Appunti di Sperimentazione Clinica e Preclinica di Farmaci - Montopoli

SPERIMENTAZIONE CLINICA E PRECLINICA

lunedì 5 novembre 2018

11:34

5 dicembre workshop su target farmacologico e sperimentazione clinica e preclinica - iscriversi perché fa

parte del corso.

Laboratorio 8.30 - 11.30 al botta o a farmacologia, durata una settimana. La relazione va inserita in quella

del prof Salmaso.

Il 15 non c'è lei ma Salmaso

1 - Primi concetti di Sperimentazione

martedì 6 novembre 2018

12:40

Sviluppo del Farmaco

Successivamente alla sintesi di molecole, c'è una parte che prevede una sperimentazione di tipo biologico,

in cui la farmacologia è la scienza cardine. I saggi di tipo farmacologico precedono i trials clinici, che testano

su un sistema biologico complesso.

Una molecola deve essere valutata sia per il profilo farmaceutico sia per il profilo tossicologico, infatti

anche se un farmaco è super potente ma è estremamente tossico, questo non può avere un trials clinico e

non può essere commercializzato, di solito non passa nemmeno le fasi precliniche. Vi sono una serie di test

che stabiliscono se il farmaco può essere somministrato in vivo. Negli studi preclinici è possibile anche

definire la forma farmaceutica che permette di somministrare il farmaco in vivo, in modo da dare

indicazioni sul profilo farmacocinetico da seguire poi nel modello animale. Se il farmaco non ha una

struttura chimica che permette la somministrazione, è possibile andare a sviluppare dei sistemi dei sistemi

alternativi di trasporto (tipo nanoparticelle).

Vi sono dei test necessari per scrivere il report del farmaco, per il passaggio nella fase clinica I del farmaco.

Si devono avere tutte le informazioni necessarie per lo sviluppo del farmaco, che comprendono

informazioni tossicologiche, di farmacocinetica e farmacodinamica.

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Appunti di Sperimentazione Mauro Ferrari 1

Valutazione Precliniche

Servono per individuare i candidati per i test animali. In passato si prendeva direttamente un pool di

molecole e lo si testava direttamente nell'animale e si osservava cosa succedesse.

Oggi invece abbiamo una serie di dati che permettono di individuare i target e la loro efficacia, ottenuti

attraverso svariate discipline e procedure, soprattutto attraverso competenze bioinformatiche.

Ad esempio, effettuiamo l'analisi proteomica di un tessuto tumorale rispetto al tessuto sano, trovando

quelle proteine mutate che differiscono da quelle sane. Da lì con sistemi bioinformatici riusciamo a capire

che le proteine mutate sono responsabile degli effetti, quindi potrebbero essere nuovi target da validare.

Queste analisi permetto di processare anche 10.000 proteine al colpo.

Clinical Trials

FASE I - basata sulla sperimentazione sui volontari sani, ad eccezione di farmaci con indice terapeutico

basso, come antitumorali e antiepilettici. Quindi farmaci con alto rischio tossicologico, che nel contesto

della patologia viene accettano, sui pazienti sani no.

Qui vengono effettuati gli studi di farmacocinetica, su pochi volontari sani. Attraverso analisi continue si

valutano problemi di tipo tossicologico, d'organo o di sistema.

FAE II - valutazione nella patologia, fatto un controllo sul farmaco e sul placebo.

FASE III - si estende il numero di pazienti rispetto alla fase II, qui vi è l'uso compassionevole in cui la

condizione del paziente è critica, non esiste trattamento, nonostante in farmaco non è in commercio ma se

ha dato buoni risultati è possibile permetterne la somministrazione.

FASE IV - comprende la farmacovigilanza una volta che il farmaco è già in commercio, è utilizzabile anche

dalle aziende per trovare nuove indicazioni terapeutiche per il farmaco, oppure per testarne l'efficacia in

persone che non si sottoporrebbero in maniera spontanea ai trials, come le donne incinta.

Sviluppo di un Farmaco - Convergenza di Discipline

Successivamente allo sviluppo del modeling molecolare e alla sintesi della molecola, è possibile passare poi

a vedere gli aspetti farmacologici, in particolare quelli inerenti alla farmacodinamica.

La Farmacodinamica permette di validare una molecola per un target molecolare.

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Appunti di Sperimentazione Mauro Ferrari 2

Per disegnare un farmaco: sapere la patologia, trovare la molecola che agisce sul bersaglio molecolare

(ossia la farmacodinamica - il farmaco deve occupare il recettore e l'interazione deve durare il tempo

sufficiente per dare una risposta - di solito l'antagonista ha un'interazione più forte rispetto all'agonista),

capire la farmacocinetica (ADME), l'attività in vivo e la sicurezza del farmaco e dei suoi metaboliti

(paracetamolo).

Test Preclinici

Non è possibile sviluppare un farmaco senza passare attraverso la sperimentazione animale, non bastano

gli studi in vitro e quelli di tossicità. Non sarebbe etico passare da un modello cellulare a un modello

umano. Se i test sugli animali confermano la sicurezza e l'efficacia, è possibile passare ai test clinici.

Ricerca di base: permette di conoscere meccanismi fisiologici e patologici per poi permettere lo sviluppo

della ricerca applicata per lo sviluppo dei farmaci.

Ricerca applicata: si utilizzano le competenze sviluppate con la ricerca di base per sviluppare dei farmaci

contro malattie.

Ad esempio: RICERCA DI BASE:gli scienziati che hanno scoperto l' RNA interference, che riesce a silenziare

alcuni geni. RICERCA APPLICATA: Adesso l'RNA interference può entrare a far parte di una terapia.

Altro esempio: premio nobel per aver scoperto l'attivazione del sistema immunitario, anche da parte delle

cellule dendritiche.

Il premio Nobel quest'anno è stato dato per aver scoperto come l'immuno-terapia può essere utilizzata per

sconfiggere il tumore.

Come progettiamo una molecola?

1. Identificazione di un target: è possibile conoscere per differenza il target nella patologia rispetto al

target sano. Quindi parto dal target per disegnare la molecola. Esistono degli screening che

controllano centinaia di migliaia di molecole con il target, perché non è detto che di un target si

conosca la SAR. Inoltre, molto spesso le linee di segnale non sono lineari e dirette, ma sono

concatenate e tornare indietro. Quindi è possibile modulare un target, ma non ottenere risposta

perché viene attivata una via alternativa e quella bloccata viene compensata.

Esempio del Parkinson: i farmaci aumentano la quantità di dopamina nel sistema nervoso centrale,

ma è un trattamento sintomatico e non cura la patologia, non sappiamo perché si produca meno

dopamina. La synucleina è una delle molecole coinvolte nel parkinson, un'altra causa della patologia

è il Rotenone (insetticida), una molecola capace di bloccare il complesso I della catena mitocondriale,

quindi potrebbe dipendere da una disfunzione del mitocondrio.

2. Sviluppo di un saggio: bisogna verificare se il composto studiato è in grado di modulare quell'enzima.

Se è un recettore, oppure se il target è il DNA, è complicato stabilire il saggio.

È possibile anche utilizzare un tessuto, un organo oppure l'intero animale. Ci sono dei modelli animali

(zebra-fish) che danno informazioni molto specifiche (ad esempio lo zebra-fish è trasparente, quindi è

possibile utilizzare un farmaco fluorescente e non ammazzare il pesce per studiare il saggio).

La buona pianificazione e l'ottimizzazione del protocollo è fondamentale (bisogna avere tutti i

composti necessari, gli strumenti necessari, la linea cellulare giusta per studiare il farmaco, ecc).

SAGGIO: Selettivo e specifico, riproducibile, prevedibilità, robustezza (piccoli cambiamenti non

devono modificare il saggio, come piccole variazioni di temperatura non devono modificarlo).

CARATTERISTICHE DI UN ASSAY

Studio Preclinici: Metodi in silico (quindi predizioni fatte al computer) e metodi in vitro (organelli

cellulari, colture cellulare, colture tessutali, pezzi di tessuto oppure organi isolati). Comunque, i dati in

vitro non sono sostitutivi per il vivo, sono predittivi ma non necessarie. Però per esempio i metodi in

vitro solo utili per fare uno screaning di molecole troppo tossiche per i test animali.

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Appunti di Sperimentazione Mauro Ferrari 3

3. Identificare quali composti reagiscono in maniera migliore con il target. Identifica se il target è sicuro

ed efficacie.

4. Stabilire le dosi terapeutiche e le dosi tossiche.

5. Creazione del file per l'approvazione del trial clinico. Questi vanno poi inviati all' FDA o all'EMA.

Contiene tutti i dati sulla molecola, la sicurezza e l'efficacia in vitro e vivo su animali.

CULTURA CELLULARE

Il sistema più usato per gli studi della ricerca biomedica. Risali ai primi del '900 lo studio delle prime cellule.

Attualmente utilizziamo vari tipologie di cellule, ricavate attraverso: una dissociazione meccanica dal

tessuto, dissociazione enzimatica. Possiamo utilizzare cellule primarie, cellule stabilizzate. Tutte vengono

identificate come colture in vitro.

VANTAGGI: –

Appunti di Sperimentazione Mauro Ferrari 4

• Si ha una struttura complessa che può avere dei target sconosciuti. Quindi multi-target

• Scoprire problematiche di solubilità e trasporto, studiando quindi l'assorbimento da parte della

cellula. Per esempio studio l'assorbimento di doxorubicina (fluorescente) in presenza di Verapamil

(inibitore PGP, glicoproteina P) e senza inibitore, per avere l'attività di PGP.

• Problemi di tossicità - è possibile identificare la tossicità su una cellula, e derivare anche la tossicità

d'organo.

SVANTAGGI:

• Serve una grande quantità di materiale per il test - High throughput screening

• Il segnale deve essere individuabile, se vi sono interferenze o rumore di fondo il segnale non è

identificabile, viene mascherato

• Complessità del test. Per esempio nell'elettroforesi di un lisato è possibile identificare la singola

proteina attraverso il Western Blot. È un test complesso.

2 - Cell culture: applicazioni

giovedì 8 novembre 2018

12:28

Noi vediamo principalmente le applicazioni rivolte allo studio di farmaci, le prime 2 di questo elenco:

• Studi di citotossicità - si in ambito tossicologico sia di ricerca di antitumorali

• Studio di meccanismi di azione dei farmaci - quindi riusciamo a scoprire via di signaling toccate dai

farmaci

• Studi di interazioni cellula-cellula

• Genetici

• Biologia Molecolare

LINEA CELLULARE PRIMARIA

È la coltura cellulare che deriva direttamente dal tessuto animale. La separazione può essere di tipo

meccanico, ossia taglio un pezzo di tessuto sottile e poi le cellule migrano dal tessuto alla cultura. Oppure

con un metodo enzimatico stacco le cellule dal tessuto, e poi queste migrano verso la coltura e si possono

separare con varie metodiche. Nel primo esempio si potrebbe far riferimento ad un tumore, oppure nel

secondo metodo si possono ottenere delle cellule endoteliali dal cordone ombelicale.

Le cellule primarie hanno un tempo di replicazione ben definito, dopodiché si bloccano e smettono di

riprodursi. Inoltre non tutte le cellule possono essere estratte da una fonte naturali, come i neuroni. Non è

possibile estrarle da un morto, a meno che non si faccia immediatamente (si fa solo con gli animali). Il

tessuto per l'estrazione deve essere vivo.

Caratteristiche:

• Numero limitato di cicli, legato ai telomeri

• Crescono in monostrato

• Subiscono inibizione da contatto

• Hanno una forte dipendenza dai fattori di crescita del siero

Servono quindi delle linee cellulari immortali, per cui vengono mantenute in cultura per molto tempo,

possono essere riprodotte e non smettono mai di riprodursi.

Cellule clonali: cellule selezionate da un'unica cellula che riproduce una popolazione identica della cellula

madre. Per esempio, si modifica il gene di una cellula, e poi si seleziona le figlie della cellula madre che

esprime ancora il gene.

Le cellule tumorali sono per definizioni immortali, perché hanno subito delle modificazioni rispetto alla

cellula primaria per cui non smettono mai di riprodursi, e non sono soggetti all'inibizione da contatto, per

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Appunti di Sperimentazione Mauro Ferrari 5

cui per esempio in una piastra crescono in tutte e 3 le dimensioni, quindi si formano delle specie di grumi di

cellule tumorali.

Le cellule vanno tenute in vita con glucosio, siero (fattori di crescita) e attraverso l'utilizzo di un tampone.

I trattamenti che applico alle cellule primarie le trasformano in cellule immortali, perché subiscono delle

modificazioni che ne cambiano il tipo. Crea una nuova linea clonale

Le cellule cloni e le cellule immortali sono cellule che derivano dalla linea primaria.

TRASFORMAZIONE DELLE CELLULE

Le cellule primarie si trasformano attraverso metodi chimici, metodi virali, con irraggiamento

elettromagnetico, e attraverso l'inserimento di geni.

Le cellule immortali perdono l'abilità di regolare la crescita, richiedono meno siero per la crescita, hanno

tempo di replicazione ridotto, ma perdono alcune caratteristiche che hanno in vivo. Per cui solo le più

utilizzate.

Le cellule trasformate possono essere anche acquistate, perché per effettuare i test devono essere validate

per cui devono avere DNA ben specificato. Sono schedate attraverso banche dati, e vengono caratterizzate

attraverso il DNA, per cui identificano specificatamente da dove deriva quella cellula (da quel tessuto).

Le cellule immortali perdono la capacità di essere differenziate, non svolgono più le funzioni svolte nel

tessuto iniziale. Perdono il fenotipo, per cui se dobbiamo fare studi specifici su un tipo di tessuto, non

possiamo validare l'efficacia del mio farmaco su questo tipo di cellule.

CONTAMINAZIONI

I materiali utilizzati possono contaminare le culture cellulare. Le cellule del sangue sono in sospensione, le

altre cellule aderiscono ai materiali (plastica, vetro). Esistono dei materiali che permettono il coating della

plastica, e permettono meglio l'adesione delle cellule al tessuto. Questi possono avere dei contaminanti

che danneggiano la coltura, ad esempio disinfettanti, tracce di metalli, endotossine, plasticizzanti. È più

difficile da identificare.

È possibile avere anche contaminazione biologica, per cui lieviti, batteri e funghi possono crescere nel

terreno delle cellule, e competono con loro diminuendo i nutrienti e provocando problemi di crescita.

Capita anche che ci sia una contaminazione incrociata di linee cellulare, per cui se una tende a proliferare

maggiormente prende il sopravvento sulle altre. I micoplasmi invece entrano dentro le cellule.

Effetti dei contaminanti biologici:

• Competono per l'uso dei nutrienti con le cellule

• Secernono acidi o basi che possono interferire con la crescita delle cellule

• Degradano arginina e purina, inibendo la sintesi di istoni e acidi nucleici

• Producono acqua ossigenata, creano stress ossidativo.

IDENTIFICAZIONE DI CONTAMINANTI

Il terreno diventa torbido, cambia la velocità di crescita delle cellule, variazione anormale di pH, cellule in

lisi.

Di solito i contaminanti biologici cambiano il pH del terreno, che da rosso/rosa diventa giallo per via

dell'indicatore.

MICOPLASMA

Il micoplasma non è visibile, ma fa variare il tempo di replicazione della cellula. Attraverso una colorazione

con un colorante nucleare apposta, il nucleo della cellula si colora e anche i nuclei del micoplasma che crea

tanti punti dentro il citoplasma della cellula. È uno dei contaminanti più diffusi nelle linee primarie, perché

fa parte del nostro microbioma. Quindi è facile che avvenga la contaminazione nel momento

dell'estrazione. –

Appunti di Sperimentazione Mauro Ferrari 6

COSE CHE SERVONO

• Ambiente sterile

• Nutrienti base

• Fattore di crescita

• Fattori di adesione

• Temperatura stabile e pH stabile

Cappa a flusso laminare - Biohazard, proteggono il campione e l'utilizzatore. Quando si sintetizzano nuovi

composti si utilizza sempre questo tipo di cappe, perché non si sa bene cosa si produce. Anche quando si

adoperano cellule umane si usano sempre queste cappe, perché possono anche essere contaminate con

virus, non noti al momento dell'estrazione.

TERRENO

Contiene:

• Nutrienti - carboidrati, AA, vitamine, acidi grassi e lipidi, proteine e peptidi

• Sali inorganici

• Antibiotici, per evitare contaminazione (non si usano se devo testare antibiotici)

• Sistemi tamponi - bicarbonato o HEPES o fosfato

• Indicatori di pH (rosso fenolo, rosso (7,2-7,4), giallo/arancio acido, viola basico (cosa rara da

ottenere)).Le cellule rilasciano acido lattico a seguito del metabolismo del glucosio, e anidride

carbonica per cui tendono ad acidificare la soluzione.

• Siero - bisogna conoscere in maniera precisa cosa c'è dentro il siero. Serve per promuovere l'adesione

delle cellule, aiuta ad aggiungere nutrienti, fattori di crescita e proteine.

Le cellule in coltura sono sostanzialmente "dopate", perché hanno molti fattori di crescita e condizione

ideale. Se voglio vedere la rigenerazione del tessuto, devo abbassare i nutrienti prima della

somministrazione della molecole che dovrebbe promuovere la rigenerazione, perché se sono già a livelli

massimi le cellule non possono superare il loro limite intrinseco.

TEMPERATURA

Utilizziamo degli incubatori per mantenere costante la temperatura, la diminuzione di temperatura serve

per abbassare il metabolismo, infatti è possibile congelarle le cellule in azoto liquido con l'utilizzo di terreni

particolari. Nell'incubatore abbiamo acqua (evita evaporazione del terreno) e CO2 per mantenere costante

il pH, l'umidità e proteggere le cellule dai contaminanti.

MICROSCOPIO

Utilizziamo il microscopio per vedere la salute delle nostre cellule.

ADESIONE

Le cellule sono adese alla piastra. Attraverso l&