Appunti di Sperimentazione Clinica e Preclinica di Farmaci - Montopoli

FLAVOPIRIDOLO

È un flavonoide semisintetico che è stato identificato come uno dei primi inibitori di CDK. È un inibitore

reversibile e la sua attività consiste nel competere con ATP all'interno del complesso CDK-ciclina. Quindi la

competizione porta a bloccare i complessi, quindi non riesce a fosforilare il substrato. La selettività non è

alta, perché la tasca dell'ATP è molto simile tra le varie kinasi corporee, quindi non è selettiva per questo

complesso ma su tutti gli altri complessi CDK-cyclina e gli altri enzimi corporei.

Quindi si vede se esiste una struttura tridimensionale della CDK, e quindi validare l'interazione con una

molecola attraverso il modeling. Quindi vedere se la molecola riesci a comportarsi come il Flavopiridolo.

Quindi si valuta in silico l'affinità.

Quando capisco gli AA importanti per quanto riguarda la tasca dell'ATP, posso migliorare la mia molecola

modificandola e rendendola più affine.

L'attività del composto viene valutata utilizzando l'enzima isolato, il substrato e il composto, e si quantifica

quanto substrato si fosforila. Quindi si otterrà una curva con l'effetto in relazione alla concentrazione del

composto "inibente". Si determina la K inibizione, più è bassa più il composto è affine a quella kinasi.

L'ideale è che il composto dovrebbe essere molto attivo su quella kinasi e poco per le altre.

Dopodiché cerco quanto è selettiva la molecola in studio per le altre kinasi, perché se l'inibitore di kinasi è

troppo affine per tutte le kinasi il composto è troppo tossico. Quindi si fa uno studio sulle kinasi isolate, e

valuto la selettività del composto.

Alla fine valuto anche se esistono già molecole simili che sono selettive per quella kinasi, e vedo la

similitudine con il mio composto.

Composti diversi possono andare a modificare la struttura dell' enzima, anche se interagiscono nella tasca

dell'ATP. Quindi composti diversi possono dare effetti diversi.

Quindi cerco il candidato migliore selettivo per quel tipo di kinasi.

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Appunti di Sperimentazione Mauro Ferrari 30

In letteratura si trova che dal composto FLAVOPIRIDOLO (non selettivo) sono riusciti a ottenere dei

composti derivati che sono molto più selettivi per determinati tipi di CDK, andando a notare che sono

proteine importanti se si sono impegnati verso questa strada.

Se sono interessato ad un composto già stato studiato, posso prendermi il lavoro e andare a capire come è

stato studiato, e posso sfruttare l'impostazione di quel lavoro per progettare il mio.

Farmaci inibitori delle CDK ci sono già in clinica, quindi è chiaro che questo rappresenta un ottimo target

per contrastare le patologie neoplastiche. Palbociclib.

RETINOBLASTOMA

È uno dei substrati target delle CDK, viene fosforilato dal complesso CDK-cyclina e viene inattivato per far

attivare la traslocazione del fattore trascrizionale nel nucleo.

Esempio: WESTERN BLOT di RETINOBLASTOMA

Viene effettuata un'analisi Wester Blot a seguito del trattamento con quercetina.

Si va a vedere se diminuisce o aumenta la fosforilazione del retinoblastoma.

Nel pannello A vi è l'analisi con un anticorpo, 2 e 4 sono i giorni di trattamento con quercetina. La forma

ipo-fosforilata serve come controllo, invece l'actina è la proteina di normalizzazione, serve per valutare se

ho caricato la stessa quantità di materiale.

Nel lisato è stata quantificata la quantità proteica, e bisogna caricare la stessa quantità di proteina di

normalizzazione nel blot. Per verificare che questo caricamento sia avvenuto in maniera corretta e per

avere una normalizzazione, si carica una proteina sempre espressa nella cellula, presente in tutti i campioni

(non si altera, quindi proteine del citoscheletro sono più usate). Quindi l'actina ci dice che abbiamo caricato

la stessa quantità proteica e possiamo usarla per normalizzare, infatti l'actina ha 2 bande uguali.

Devo valutare le due forme iper-fosforilate del Retinoblastoma, quindi uso 2 anticorpi che mi riconoscono

parti diverse della proteina. E contemporaneamente andare a visualizzare anche la forma ipo-fosforilata.

Quindi si nota che l'intensità ottica della banda del Rb ipo-fosforilato diminuisce, in entrambi i siti. Quindi a

seguiti del trattamento con il composto la loro concentrazione diminuisce. Questo è in linea con l'ipotesi

iniziale. (che riduca l'attività della CDK, ndr.)

La quantità di substrato fosforilato diminuisce o perché le kinasi sono inibite oppure perché l'espressione

dei fattori è diminuito (CDK, cycline o anche Rb). Quindi l'effetto finale è avere meno Rb fosforilato, ma con

meccanismi diversi. Quindi dobbiamo capire se l'espressione delle proteine viene modificata, se la escludo

è quasi certo che il composto agisca come inibitore di CDK.

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Appunti di Sperimentazione Mauro Ferrari 31

BUT, a rigor di logica la quantità di Rb totale dovrebbe essere costante, quindi ad una diminuzione di forma

iper-fosforilata corrisponde un aumento di forma ipo-fosforilata. Nel blot si nota che anche la forma ipo-

fosforilata è diminuita leggermente, quindi in realtà si vede una diminuzione dell'espressione di

retinoblastoma in generale. (quindi si potrebbe valutare qual è il fattore trascrizionale che fa esprimere

retinoblastoma, oppure chi degrada il retinoblastoma; perché potrebbe esserci una diminuzione di

espressione oppure un aumento di degradazione).

L'anticorpo della forma ipo-fosforilata se invece di riconoscere la zona che non è fosforilata, riconosce la

zona fosforilata, può andare a riconosce sia la forma ipo che la forma iper. Se questo accade, l'anticorpo

riconosce il retinoblastoma totale, quindi se aumenta la forma ipo aumenta anche la forma iper. Se dopo il

trattamento mi cambia la fosforilazione, la quota totale non dovrebbe cambiare perché le riconosce

entrambe (anticorpo Z).

Se invece l'anticorpo riconosce la zona non fosforilata (ma che può esserlo dalla CDK), cambierà la quantità

di forma ipo ma sarà proporzionale alla forma iper (anticorpo Y). Perché il totale è sempre 100. Quindi

dovrebbe diminuire la forma ipo ma in contemporanea dovrebbe aumentare la forma iper.

Nel nostro Western Blot diminuisce la forma iper, ma anche la forma ipo. Quindi è l'espressione del

retinoblastoma che diminuisce.

Per capire se è solo questa linea cellulare che si comporta così, andiamo a fare la stessa cosa su un'altra

linea cellulare. Si vede che il pRB non cambia, ma il p-pRb aumenta. Quindi in questo caso non funge da

inibitore, ma induce la fosforilazione. La forma iper forma addirittura la forma ipo, quindi se l'anticorpo è Z,

anche la banda dell'ipo dovrebbe essere più grossa. Se invece è anticorpo Y, se vedo un'aumento della

forma iper dovrei vedere una diminuzione della forma ipo.

Il lavoro non è tanto corretto, dando per scontato che la iper-fosforilazione è diminuita, ma la quantità di

Rb è inalterato, vado a controllare che i fautori della fosforilazione non cambino come espressione.

Cioè CDK e cycline mantengano la stessa espressione. Lo sbrodolamento dell'CDK2 nel grafico C ci fa

pensare che si sia stato un errore di caricamento, ma dato che l'actina è perfetta è più probabile che sia

stata disegnata.

Tutto il lavoro è un po' strano, perché le cicline dovrebbero cambiare con il passare dei giorni, non restare

sempre costanti perché non sono sempre espresse, solo le CDK sono sempre espresse. Quindi se ho un

blocco delle fasi avrò anche un aumento della ciclina presente in quella fase, non restano costanti le altre.

Ma i dati non sono concordanti con quelli del citofluorimetro. Quindi in teoria avrei dovuto avere tanta

ciclina D, e praticamente pochissima ciclina E ed A. Cosa che non abbiamo, sono tutte uguali.

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Appunti di Sperimentazione Mauro Ferrari 32

8 - Analisi del Ciclo Cellulare

martedì 27 novembre 2018

12:43

CICLINE

Nel momento in cui andiamo a valutare CDK, di solito valutiamo anche l'espressione di Cicline.

Le 2 linee cellulari rispondono in maniera diversa al trattamento, anche se intrinsecamente le 2 linee

cellulari hanno profili molto diversi, ad indicare quanto tra diverse linee può esserci variabilità.

Dai citogrammi si nota che la linea NIH non cambia il ciclo cellulare al seguito del trattamento, inoltre le

popolazioni di cellule sono più omogenee perché le gaussiane sono più strette. La linea S180 invece è

influenzata dal trattamento, Infatti in questa linea la fase S è notevolmente ridotta, così come la fase G2/M.

Inoltre, le popolazioni sono più disomogenee.

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Appunti di Sperimentazione Mauro Ferrari 33

La linea cellulare S180 ha una diminuzione statisticamente significativa della produzione di complesso CDK,

rispetto alla linea NIH che non mostra una vera diminuzione.

Il dato viene comunque normalizzato, infatti l'intensità della fluorescenza della CDK è normalizzata con

l'intensità della Actina (proteina di controllo) che viene usata come divisore dell'intensità della CDK.

Quindi andiamo a concludere che l'espressione di CDK e ciclina è diminuita dalla molecola in analisi, non c'è

quindi l'inibizione del complesso enzimatico, ma diminuiscono i componenti del complesso quindi anche di

conseguenza si abbassa la concentrazione del substrato fosforilato.

Di solito il cambio dell'espressione di una proteina è dovuto o alla diminuita induzione all'espressione,

oppure all'aumenta degradazione della proteina.

ESEMPIO CICLINA D1

Anche la ciclina sembra rappresentare un ottimo target, perché la sua over-espressione da degli effetti

nello sviluppo della patologia tumorale. Infatti causa:

• Tumore nel topo nudo

• Indipendenza da sistemi di ancoraggio, quindi favorisce la metastasi

• Creano resistenza ai chemioterapici

• Aumenta espressione VEGF

Effetto di Curcumina su Ciclina D1

Anche se tecnicamente la curcumina è un PAINS, è molto sicura per l'utilizzo sull'uomo quindi si continua a

studiarla.

Le cellule di Carcinoma Ovarico resistenti a Cis-Platino (C13) presentano più ciclina rispetto alla linea wild

type (2008), e in tutte e due la Curcumina è in grado di diminuire l'espressione di ciclina.

[più asterischi ci sono, più è significativo il dato].

Quindi essendoci un cambio di ciclina D, pensiamo sia coinvolta la FASE G0/G1.

Nel momento in cui vedo la diminuzione di CICLINA, cerco i fattori trascrizionali legati all&