Appunti di scienze e tecniche di medicina di laboratorio

Scienze e tecniche di medicina di laboratorio - Lezione 1

Introduzione alla medicina di laboratorio

La medicina di laboratorio è una scienza clinica applicata che studia con metodi chimici, fisici e biologici le alterazioni dell’organismo nello stato di malattia, ricavando da campioni biologici provenienti dal paziente dati, qualitativi o quantitativi numerici, che consentano al medico di ottenere informazioni utili a scopo diagnostico, terapeutico, preventivo, prognostico e riabilitativo.

Diagnosi medica

La diagnosi medica è costituita da:

• Anamnesi: il medico attraverso una serie di domande cerca di valutare lo stato di salute del paziente.
• Esame clinico
• Indagini strumentali: si intendono indagini di tipo ecografico, radiografico, ecc.
• Indagini di laboratorio: in questa fase viene introdotta la medicina di laboratorio, intesa come l’insieme di analisi ed esami effettuati su un campione biologico prelevato dal paziente.

Il medico di laboratorio si interfaccia con il clinico, da qui il clinico farà richiesta di un determinato esame, di conseguenza verrà raccolto il campione dal paziente, il quale verrà analizzato direttamente dalla struttura stessa oppure verrà trasportato e analizzato in un'altra struttura. Segue poi la fase di conservazione del campione biologico, si tratta di una fase importante perché se i campioni non vengono conservati in condizioni ottimali, al momento dell’analisi del campione biologico rischieremo di ottenere un risultato alterato. Ultimo passaggio che costituisce l’indagine di laboratorio è il referto elaborato dal medico di laboratorio, che verrà poi consegnato al clinico.

Riassumendo: alla base della medicina di laboratorio vi è il quesito clinico, ovvero il medico che decide quali esami richiedere (scelta dell’esame di laboratorio). Si procede con la preparazione del paziente dal quale poi verrà prelevato il campione biologico, che verrà analizzato da qui si genera un risultato (referto) il quale verrà valutato ed interpretato dal medico.

Campioni biologici

Cos’è un campione biologico? I liquidi o i tessuti prelevati dal paziente. Su questi campioni biologici si eseguono gli esami di laboratorio.

Esempi di campioni biologici:

• Sangue
• Urine
• Feci
• Liquido sinoviale
• Liquido cefalo-rachidiano o cerebro spinale
• Lacrime
• Sudore
• Saliva
• Latte materno
• Succo gastrico
• Succo duodenale
• Liquido seminale
• Liquido amniotico (indagini prenatali)

Esistono alcuni campioni biologici che vengono prelevati solo in caso sospetto di patologia come:

• Liquido ascitico (solitamente questo liquido si forma in presenza di un tumore)
• Liquido di lavaggio bronchiale
• Liquido pleurico
• Liquido di lavaggio intestinale

In alcuni casi vengono effettuati dei prelievi di campioni biologici di materiale cellulare come nel caso di biopsie, tramite questo prelievo siamo in grado di capire a quale stadio si trova un tumore.

Motivi per effettuare un esame di laboratorio

Perché si effettua un esame di laboratorio?

• Per finalità di “screening” (in assenza di sintomi), come screening in gravidanza o neonatali.
• Nella fase diagnostica (conferma o esclusione di un sospetto clinico).
• Prima di attuare un trattamento farmacologico.
• Per monitorare: il decorso della malattia, il livello dei farmaci, ecc.
• Per scopo di ricerca, in questo caso è necessario il consenso del paziente.

Test di screening

Che cos’è un test di screening? Si tratta di un test effettuato su una popolazione apparentemente sana al fine di individuare un'infezione o una malattia sub-clinica. Un test di screening deve avere le seguenti caratteristiche:

• Economico: vi deve essere sottoposta una popolazione numerosa, quindi deve essere economico.
• Sicuro: la maggior parte dei soggetti sottoposti al test sarà presumibilmente sana e un danno da test non è giustificabile.
• Di rapida esecuzione
• Sensibile e specifico: si devono ottenere risultati abbastanza attendibili.

Esempi di test di screening:

• Pap-Test: carcinoma della cervice uterina
• Esame sangue occulto nelle feci: cancro al colon
• PSA (antigene prostatico specifico): tumore della prostata
• Test di screening prenatale: malattie cromosomiche del feto
• Reazione di Mantoux: rilevare esposizione alla tubercolosi
• Test per individuare l’infezione da HIV
• Test per individuare l’infezione da coronavirus (Covid-19)

Test di screening per Covid-19

Approfondiamo il test di screening per individuare l’infezione da coronavirus (Covid-19): in questo caso il campione biologico è rappresentato dal sito in cui il virus si propaga, ovvero le vie respiratorie per cui si effettua un tampone per prelevare dalla gola del paziente un po' di muco e saliva (test molecolare). Si ha il risultato entro 24 ore, i tamponi conservati a + 4 °C vengono poi spediti ai laboratori affinché vengano analizzati. In laboratorio il materiale genetico prelevato dal paziente viene retrotrascritto e amplificato attraverso una tecnica chiamata «Polymerase chain reaction», o RT-PCR. (reazione a catena della polimerasi inversa)

Mentre nel caso del test antigenico rapido Covid-19 è un'indagine di tipo qualitativo che si basa sulla ricerca degli antigeni virali espressi sulla superficie di SARS-CoV-2. Il tampone rapido viene somministrato con la stessa modalità del tampone nasofaringeo classico. Il test tuttavia, a differenza del test molecolare, non ricerca il genoma virale ma la presenza di proteine di superficie del virus (es. proteina Spike), chiamate anche antigeni. Gli antigeni virali del virus vengono individuati da anticorpi specifici. I risultati del tampone rapido sono molto più rapidi: in circa 15 min si riceve l’esito. Purtroppo però la velocità ha un costo in termini di sensibilità: se la carica virale è bassa, il test potrebbe risultare erroneamente negativo e non rilevare l’infezione anche se è presente.

Test di screening Pap-test

Test di screening Pap-test: Esame eseguito per lo screening di tumore al collo dell’utero si procede con:

• Prelievo di alcune cellule dal collo dell’utero con una apposita spatola (spatola di Ayre).
• Queste cellule vengono poi strisciate su un vetrino che viene esaminato in laboratorio.
• Questo esame consente d’identificare le alterazioni cellulari, delle displasie, che possono nel tempo trasformarsi in tumore.

Tipologie di laboratori

Esistono diverse tipologie di laboratori presso le strutture ospedaliere ognuna delle quali è specializzata per effettuare esami differenti:

• Biochimica clinica
• Ematologia e coagulazione
• Biologia molecolare clinica
• Microbiologia
• Virologia
• Immunologia
• Dosaggi ormonali
• Immunotrasfusionale

Valutazione del referto

Nel momento della valutazione del referto, il medico deve capire se il risultato sia reale o alterato a causa di una variabilità correlata ad errori. Si possono distinguere 2 tipologie di variabilità:

• Analitica: questa si divide a sua volta in 2 categorie
  • Fase pre-analitica: errori commessi prima dell’analisi di un campione biologico
  • Fase post-analitica: errori commessi dopo l’analisi del campione biologico
• Biologica: questa si divide in 2 categorie
  • Intraindividuali: è legata alle oscillazioni omeostatiche che garantiscono la composizione costante dei liquidi biologici
  • Interindividuali: ogni individuo ritenuto sano ha caratteristiche distintive peculiari che lo diversificano dal suo simile all’interno della stessa popolazione (fattori che possono influenzare l’esito: età del paziente, gravidanza, variazione circadiane, ciclo mestruale)

Esempi di variabili pre-analitiche

Esempi di variabili pre-analitiche:

• Scorretta identificazione del paziente o del campione biologico
• Ordine del campionamento (provette sterili per colture, provette senza additivi, provette con anticoagulanti, ecc.)
• Trasporto dei campioni (conservazione non adeguata durante il trasporto, solitamente il campione viene conservato a 4°C)
• Presenza di sostanze interferenti nel campione (contaminanti, farmaci)

Durante la fase del prelievo possiamo individuare fonti di errori che rientrano nelle variabili pre-analitiche:

• Mancato controllo del rispetto della dieta da parte del paziente
• Applicazione prolungata del laccio
• Contaminazione da infusione venosa
• Emolisi
• Incompleto riempimento della provetta
• Uso di provette con anticoagulanti e conservanti non idonei
• Errata identificazione del paziente
• Errata etichettatura delle provette
• Mancata indicazione del tipo di prelievo (arterioso, venoso, ecc.)
• Mancata indicazione di data e ora del prelievo

Esempi di variabili post-analitiche

Esempi di variabili post-analitiche:

• Errata trascrizione dei risultati
• Refertazione inadeguata o incompleta (note, valori di riferimento, acronimi)

Caratteristiche dei test di laboratorio

• Accuratezza: il valore fornito dall’analisi deve essere prossimo al valore reale del parametro analizzato
• Precisione: riproducibilità di un test
• Specificità: capacità del metodo di determinare effettivamente la molecola d’interesse
• Sensibilità: è il minimo valore che il test è in grado di rilevare. Il limite di rilevabilità indica la più piccola quantità che il metodo riesce a dosare rispetto al valore del controllo negativo. Esso è tanto più basso quanto maggiore è la sensibilità del metodo. (es. eseguiamo test antigenico rapido per Covid-19 potrebbe essere un falso negativo in quanto il test non è sufficientemente sensibile)

I valori di riferimento: Tutti i valori riscontrati con un’analisi clinica di laboratorio o chimico-clinica devono essere paragonati a valori di riferimento considerati normali che sono distribuiti nella popolazione secondo una curva gaussiana. L’intervallo dei valori di riferimento comprende il 95% dei valori che si ottengono in una popolazione di individui sani.

I valori critici o anomali rappresentano valori che si discostano notevolmente dai valori di riferimento. Ad esempio, prendiamo in considerazione i valori di riferimento del numero dei globuli rossi presenti in un individuo, questi valori sono stati rilevati su un campione di persone sane che differiscono per sesso ed età, e sono stati riportati in tabelle e grafici.

Come si sceglie una popolazione di riferimento?

• Numero di soggetti sufficientemente elevato
• In buono stato di salute
• Individui differenziati per età, sesso
• Fattori ambientali (dieta, quota altimetrica)
• Altri fattori biologici (variazioni cronobiologiche)

Criteri di esclusione

• Malattie sistemiche e disordini fisiopatologici
• Assunzione di agenti farmacologicamente attivi: terapia farmacologica, contraccezione orale, tossicodipendenza, alcolismo e tabagismo
• Gravidanza

Referto

Che cos’è il referto? Il referto è l’atto scritto, ufficiale e definitivo con cui vengono comunicati i risultati di un esame di laboratorio. È un atto che deve risultare corretto nella forma e nei contenuti tecnici. Deve fornire informazioni non ambigue, utili sul piano clinico e facilmente interpretabili. Nel referto molto spesso vengono riportati i valori di riferimento che verranno poi paragonati con i valori ottenuti dall’esame di laboratorio.

Esame di laboratorio emacromo-citometrico

Prendiamo ora in considerazione l’esame di laboratorio emacromo-citometrico: si tratta di un prelievo venoso effettuato al mattino a digiuno (almeno 8 ore) per una migliore standardizzazione e per ridurre la variabilità biologica. Si utilizza generalmente sangue prelevato da una vena dell'avambraccio o, per esami specifici, il sangue arterioso (emogasanalisi) o il sangue capillare (digito-puntura) specialmente nei bambini e neonati. Bisogna accertare l'identità del paziente (braccialetto, tessera sanitaria, lettura ottica, ecc.). Per effettuare questa tipologia di prelievo sono consigliate le vene centrali dell'avambraccio (cubitale e cefalica) inoltre le provette devono essere etichettate prima del prelievo.

Provette per la raccolta ematica

Le provette per la raccolta di sangue intero hanno un codice colore che contraddistingue la presenza di sostanze che le rendono adatte alle diverse misurazioni, ovvero il colore del tappo della provetta indica che all’interno di essa vi è una sostanza adeguata per un certo test. Infatti se eseguiamo un prelievo di sangue in una provetta al cui interno non sono presenti sostanze, il sangue prelevato andrà incontro a un processo di coagulazione.

Il sangue: è costituito da sangue intero, plasma e siero.

• Sangue intero: parte corpuscolata + plasma. Si ottiene prelevando il sangue in presenza di anticoagulanti.
• Plasma: sangue privato degli elementi corpuscolati, si tratta dunque della parte liquida del sangue. Si ottiene dal sangue prelevato in presenza di anticoagulanti separandolo dagli elementi corpuscolati mediante centrifugazione.
• Siero: rappresenta anche questo la parte liquida del sangue, in questo caso nel sangue intero si forma un coagulo di fibrine. Si ottiene dal sangue prelevato in assenza di anticoagulanti. Successivamente il campione di sangue viene fatto coagulare mediante centrifugazione e si rimuove il coagulo di fibrina.

Il sangue dunque è costituito da elementi corpuscolari/figurati, quali sono globuli bianchi (neutrofili, basofili, linfociti, monociti, eosinofili) e piastrine/trombociti e rappresentano 1% del volume totale, e da globuli rossi/eritrociti 45% del volume totale. Mentre la parte liquida del sangue viene definita plasma e rappresenta il 55% del volume totale ed è composta da acqua, proteine plasmatiche (albumine, fibrinogeno, globuline) lipidi, glucosio, aminoacidi, ioni.

Tutti gli elementi figurati del sangue derivano da un unico precursore che si trova nel midollo osseo ovvero la cellula staminale pluripotente, da cui derivano le 2 linee di cellule progenitrici mieloide e linfoide.

Dalla linea mieloide derivano:

• I megacariociti da cui si sviluppano le piastrine/trombociti
• I globuli rossi/eritrociti
• Mastociti
• Mieloblasto da cui si sviluppano basofili, eosinofili, neutrofili, monociti (questi una volta che migrano nei tessuti prendono nome di macrofagi)

Dalla linea linfoide derivano:

• Cellule natural killer
• Linfociti che si dividono in linfociti B e T

Emopoiesi o ematopoiesi è il processo che consente la formazione e maturazione di tutte le cellule del sangue a partire dai suoi precursori.

Esame emocromocitometrico (EMOCROMO)

L’emocromo rappresenta l’indagine di base per la diagnosi di laboratorio delle patologie ematologiche; è inoltre un esame che rientra nel “profilo d’ingresso” del paziente anche per la valutazione dello stato di salute generale.

È un esame del sangue che determina:

• La quantità dei globuli (leucociti o globuli bianchi, eritrociti o globuli rossi, trombociti o piastrine)
• Alterazione delle dimensioni dei globuli rossi
• I livelli dell’ematocrito (HCT)
• I livelli dell’emoglobina
• La percentuale di ciascun leucocita (potrebbe essere una domanda dell’esame)

Attualmente vengono utilizzati dei CONTAGLOBULI, di ultima generazione, che forniscono i seguenti parametri:

1. Conteggio totale dei globuli bianchi (WBC)
2. Conteggio totale dei globuli rossi (RBC)
3. Emoglobina (HGB)
4. Ematocrito (HCT)
5. Volume corpuscolare medio (MCV)
6. Contenuto medio emoglobinico (MCH)
7. Concentrazione corpuscolare media emoglobonica (MCHC)
8. Conteggio totale delle piastrine (PLT)
9. Indice di distribuzione volumetrica dei globuli rossi (RDW)
10. Volume piastrinico medio (MPV)
11. Indice di distribuzione volumetrica delle piastrine (PDW)
12. Piastrinocrito (PCT)
13. Indice di distribuzione della concentrazione emoglobinica (HDW)

Questi macchinari riescono, contemporaneamente, a misurare una serie di parametri. Procedura: Il campione di sangue viene inserito nel contaglobuli, dove vengono misurati i vari parametri. Una parte del campione di sangue viene “distrutta” perché viene misurata anche l’emoglobina. L’emoglobina è una molecola che si trova sul globulo rosso, per misurarla bisogna distruggere il globulo rosso.

Analisi dello striscio di sangue periferico

Inoltre, una piccola goccia di sangue viene messa su un vetrino per fare un’analisi microscopica. Viene valutata la morfologia dei globuli rossi e delle altre cellule.

I parametri espressi sono legati ai globuli rossi. Si definiscono parametri eritrocitari. I valori sono differenti tra uomo e donna. Parametri: globuli rossi, volume medio eritrocitario, indice di anisocitosi, emoglobina, emoglobina corpuscolare media, concentrazione media dell’emoglobina corpuscolare.

Microcitosi = si riferisce al volume eritrocitario. Globulo rosso è minore. Legata a situazioni di anemia.

Macrocitosi = si riferisce al volume eritrocitario. Globulo rosso è maggiore.

Indice di anisocitosi = ci indica se il volume dei globuli rossi è omogeneo.

Ematocrito = rappresenta il volume dei globuli rossi rispetto al volume di sangue totale.

Emoglobina

Gli eritrociti sono cellule del sangue. La funzione principale dei globuli rossi è il trasporto dell’ossigeno dai polmoni verso i tessuti e di una parte dell’anidride carbonica dai tessuti ai polmoni, che provvedono all'espulsione del gas all'esterno del corpo. Il trasporto di ossigeno avviene grazie all’emoglobina.

Ogni molecola di emoglobina contiene 4 atomi di ferro e può legare reversibilmente 4 molecole di ossigeno. Per la presenza del Fe²⁺, l'emoglobina assume un colore rossastro, che aumenta quando il ferro si combina con l'ossigeno e diminuisce quando la globina si lega con l'anidride carbonica.

Riduzioni dei livelli di emoglobina sono indice di anemia

Parametro: Emoglobina

Sigla: Hb

Unità di misura (g/dL)

Valori di riferimento : 13-17.5 (uomo) e 12-15.5 (donna)

Difetto: Anemia

Anemia falciforme

L'anemia falciforme è dovuta ad una differenza di un amminoacido nella catena dell'emoglobina (da glutammato a valina). In condizioni di bassa pressione di ossigeno, questa mutazione causa una insolubilità dell'emoglobina che si deposita modificando la forma dei globuli rossi (diventano simili a delle falci) e rendendoli meno plastici e più fragili.