Appunti Medicina Legale

δTR

tempo di ritenzione (dipende dall’analita e dalla colonna), la risoluzione (R = ,

W

quindi R = deltaTR/W). DeltaTR è la differenza del tempo di separazione di 2 sostanze,

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mentre W corrisponde alla larghezza del picco (picco largo = risoluzione bassa). Nella

GC importanti sono colonne capillari (lunghissime, elevati piatti teorici delle colonne

meglio è, separo meglio gli analiti avendo picchi strettissimi), fase mobile con un gas

inerte. Con questa metodica non si possono analizzare sostanze volatili, non

termolabili. Processo GC: interazione della sostanza con la stazionaria, la colonna

cromatografica è situata dentro ad un forno con un range di temperatura di 80-300°.

Dentro alla colonna passa elio. Se si ha un picco che esce tardi si può aumentare la

temperatura (il flusso non si può aumentare più di tanto perché siamo in colonne

capillari). Il gas cromatografo è costituito da un iniettore contenente un LINER, formato

da resistenze, fanno vaporizzare la miscela. Le sostanze vaporizzate entrano nelle

colonne e si separano; la fase successiva è arrivare in un detector come il FID. Al FID

arrivano gli analiti, bruciandoli, formando una corrente di ioni che verranno rivelati,

Esempi di picchi sulle slide, il

ottenendo un picco con un certo tempo di ritenzione.

picco A e B vanno bene. Il picco C ha avuto un sovraccarico della colonna (risolvibile

con una diluzione del campione). Il picco D mostra un’analita instabile (termolabile). Il

picco E mostra aderenza a dei siti attivi nella porta di iniezione o nella colonna,

comportamento caratteristico di analiti con gruppi che formano legami H con la fase

stazionaria, allungando il tempo di ritenzione, la soluzione è derivatizzare il composto,

facendolo reagire con una sostanza che blocca i siti attivi della molecola, favorendo la

fuoriuscita dalla colonna, il derivatizzante può favorire la vaporizzazione.

Lezione 4

Le tecniche cromatografiche separano gli analiti. Le 2 fasi sono la stazionaria e la

mobile. La mobile nella GC è un gas (elio), nella LC è un liquido o una miscela di

liquidi.

Gascromatografia

Con la GC si determinano sostanze volatili e non termolabili, perché ha un sistema di

iniezione che lavora a temperature di 80-280°, ha un sistema di colonne chiuse dentro

ad un forno. Le caratteristiche sono:

Il segnale proporzionale alla quantità, se iniettiamo 1 µg di sostanza, avrà

 un certo picco, se iniettiamo 2 µg avremo un picco che sarà il doppio, il segnale

che esce dal gas cromatografo è proporzionale alla quantità presente nel

campione, indagini quantitative;

È lineare, se iniettiamo 0.5 il punto sarà ad una certa altezza, se inietto 1 sarà

 alto il doppio. Può succedere che la linearità sia valida in un certo range di

concentrazione e non lo sia più per un range di concentrazione troppo alto;

questo può portare ad avere un inizio lineare, che diventa un plateaux e in

questo caso l’unica soluzione è diluire in modo da tornare nel range di linearità.

Un sistema GC è costituito da un iniettore, si inietta una certa quantità di miscela,

passa nella colonna e arriva al detector; il tempo che impiega dall’iniezione a quando

viene rilevata è caratteristico per ogni analita. Gli elementi fondamentali che

determinano il tempo di ritenzione sono la colonna (l’analita interagisce con la fase

stazionaria, la colonna) e tipologia di colonna. A parità di colonna gli elementi che

moduliamo per cambiare il tempo sono la temperatura (se aumento la temperatura

una sostanza uscirà prima, aumenta la forza cinetica, passa rapidamente nella mobile

e viene trasportata velocemente al rilevatore) ed il flusso (se ho sostanze che escono

velocemente diminuisco il flusso e il tempo di ritenzione diminuisce). Nella GC

essendoci elio lavoriamo solo sulla stazionaria e non sulla mobile.

Il gascromatografo è un sistema costituito da un iniettore in cui si inietta una miscela.

Passerà all’interno della colonna (stazionaria) in un forno ad alta temperatura

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(isoterma o programmata). All’interno della colonna c’è il liquido di ripartizione e il gas

di trasporto (mobile), fa si che gli analiti arrivino al rivelatore. Il rilevatore farà

un’analisi qualitativa e quantitativa degli analiti, ne esistono diverse tipologie: ECD

(detector a cattura di elettroni, specifico per sostanze alogenate), NPD (sostanze con

N e P nella molecola), MS e FID (detector a ionizzazione di fiamma aspecifico,

composto da una fiamma; ci sono 2 aperture da cui fuoriescono H e aria, con una

differenza di potenziale si crea una corrente che brucia gli analiti che escono dalla

colonna, fa si che si formino ioni di anidride carbonica e di acqua che vengono letti).

La derivatizzazione è la preparazione di derivati, modifica la molecola. Si fa per

migliorare la risoluzione e ridurre la coda dei composti polari. Quando ho una coda di

composti polari, ho un brutto picco ed ho diminuita sensibilità. Accade con ossidrili

(OH), carbossili (COOH), idrazine, ammine primarie e sulfidrili. Serve per aumentare la

volatilità del composto e per diminuire le interazioni di gruppi attivi (gruppo ossidrile)

con la stazionaria. Derivatizzando cambio la molecola, attacco un derivatezzante alla

molecola.

Possibile migliorare il grado di frammentazione su MS. In campo tossicologico ci sono

molecole di cui non vedo lo ione, ma frammenti non caratteristici, una soluzione per il

problema è derivatizzare, ottenendo un composto diverso, frammentando mi darà ioni

più significativi. La derivatizzazione porta un aumento di sensibilità e migliora la

La più utilizzata è la

cromatografia di un analita cambiandone la struttura molecolare.

silalizzazione, reazione trimetil-selil-derivato, in grado di reagire con OH, NH e

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COOH. I gruppi attivi formano dei trimetil-silil-derivati.

HPLC (High Pressure Liquid Chromatography)

Costituito da una mobile liquida. Le colonne piccolissime, all’interno hanno

microscopiche sfere, sono nella cromatografia di ripartizione, rivestite con il liquido di

ripartizione; più le particelle sono piccole, più è alta l’efficienza della colonna, motivo

per cui sono riusciti a fare colonne sempre più corte. L’efficienza è inversamente

proporzionale alla dimensione. Strumento composto da 2 bottiglie di solventi, un

sistema di pompe, spinge gli eluenti nella colonna, arrivano al detector. Il detector è a

fluorescenza o MS. Abbiamo la possibilità di interagire utilizzando solventi diversi.

Esistono cromatografie di ripartizione (usata in tossicologia), d’assorbimento (quasi

dismessa) ed a scambio ionico.

La cromatografia di ripartizione è l’unica che viene usata in ambito tossicologico ed

esistono la normalphase (stazionaria più polare dell’eluente, gruppi attivi sono OH,

separa composti polari) e la reversedphase (stazionaria meno polare dell’eluente,

catene idrocarburiche e trattiene sostanze apolari). Esiste una reversedphase con un

gruppo aromatico e un gruppo etereo, grazie a ciò le colonne riescono a trattenere

composti apolari e polari, va bene per le analisi multi-determinative, abbiamo strutture

molecolari ed analiti a polarità diverse. Nella cromatografia di ripartizione si usano

colonne evo (usata per l’etilglucoronide, metabolita dell’alcol, estremamente polare) e

sinergy (molecole con polarità inferiore sono trattenute troppo dalla colonna, adottate

colonne come la sinergy, c’è una situazione dove si fa un compromesso in quanto

voglio determinare sostanze a polarità diversa). Esiste un termostato, si usa al

massimo a 40°C, va benissimo per le molecole termolabili. Tecnica utilizzata sia in

situazione isocratica; sia in gradiente di eluizione (vario la composizione dei miei

eluenti). I sistemi che contengono la sinergy nelle reversedphase usano un tampone

Ho una cromatografia

acquoso e un solvente organico tipo aceto-nitrile o metanolo.

con un analita che esce a 22 minuti, voglio accelerare senza cambiare colonna,

aumento la concentrazione (se esce ad un 22 e sono partita da un 70% di A, parto da

un 40% di A, aumento la quantità dell’eluente organico tipo metanolo o aceto nitrile in

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modo da far uscire prima la mia sostanza). Se è vero che quando ho una stazionaria

polare, in LC inversa i non polari vengono trattenuti di più dei polari, aumento l’uscita

dei composti non polari utilizzando solvente. Abbiamo un tempo di ritenzione e la

risoluzione.

Analisi quantitativa

Quando non ho i calibratori venduti dalla ditta, vengono fatti in laboratorio in matrice.

Si prepara aggiungendo quantità note dell’analita nella matrice in concentrazioni

variabili, aggiungo la stessa quantità di SI nei campioni e calcolo il rapporto (area del

campione noto diviso l’area di SI) per le determinazioni, ottengo una curva di

polvere, non ci sono

calibrazione. Abbiamo necessità di fare analisi usando uno SE:

problemi estrattivi e di sensibilità; pesiamo 50 mg e si solubilizza. Metto un SI per

controllare lo strumento, se l’iniettore sbaglia riesco a controllare e fare

determinazioni di un SI. A legale i calibratori si preparano da standard analitici

certificati, vengono acquistati standard analitici da ditte certificate, si devono

diluiscono in modo da ottenere concentrazioni da aggiungere al campione

trasformandolo in calibratori.

Spettrometria di massa (MS)

Genera molecole cariche o frammenti molecolari in un alto vuoto, in fase gassosa. Il

fatto che le molecole debbano essere in fase gassosa permette l’abbinamento la GC

ad un MS; complicato abbinarla con LC.

Zona in cui vengono generati gli ioni: generare ioni. Ci sono varie tecniche di

sorgenti che producono ioni. Impatto elettronico: ionizzazione fisica abbinata a GC,

sistema composto da un filamento di W, sottoposto a differenza di potenziale a

voltaggio elevato, formazione di un fascio di elettroni, gli analiti sono bombardati dal

fascio, formazione di uno ione. Quando abbiamo una molecola neutra su cui arriva un

fascio di elettroni da 70-80 elettronvolt, formazione di uno ione radicale, instabile,

frammenta in altri prodotti. MALDI: ionizzazione chimica, usato per macromolecole.

Chemicalionization: ionizzazione chimica. ESI (electospray): ionizzazione chimica,

sistema a pressione atmosferica; sorgente che forma ioni partendo da un liquido, per

avere ioni devo passare ad uno stato gassoso, applico un voltaggio, ottengo un cono

formato da goccioline microscopiche, provoco un’evaporazione rapida, rompe la

tensione di vapore ottenendo molecole cariche positivamente o negativamente oppure

degli M+1 (ione o radicale dello ione molecolare in fas