Appunti di microbiologia - parte I

Microbiologia

Introduzione ai microbi e microrganismi

I microbi o microrganismi sono definiti come organismi viventi visibili solo al microscopio. Essi vivono ovunque, per esempio nella frutta, nei laboratori, ecc. e sono dei veri e propri lavoratori instancabili nel senso che 1g di lievito riesce a trasformare 300g di zucchero in alcool etilico in un'ora di tempo, oppure 1g di lattobacilli (batteri responsabili della trasformazione del latte in yogurt) trasforma 8 kg di lattosio in acido lattico in circa un'ora.

I microrganismi si coltivano mediante l’uso di piastre petri e mezzo nutritivo.

Biotecnologia

Biotecnologia è l’uso integrato di microbiologia, biochimica e ingegneria al fine di realizzare l’applicazione industriale delle capacità potenziali dei microrganismi, cellule di tessuti coltivati e loro parti. È utilizzata come penicillina e cortisone.

Diversità degli organismi viventi e tassonomia

Gli organismi viventi che popolano il nostro pianeta sono caratterizzati da una vasta diversità, tanto che su 13 milioni di specie, solo 1,7 sono state studiate e descritte. Occorre quindi classificare e organizzare l’informazione degli organismi viventi raggruppando gli esseri simili fra loro tramite la tassonomia.

La tassonomia è articolata in tre stadi:

• Organizzazione delle specie mediante la loro similarità.
• Denominazione degli organismi e gruppi.
• Identificazione degli organismi isolati dall’ambiente.

Classificazioni storiche

La prima vera suddivisione degli organismi viventi fu fatta nel 1700 da Linneo, organizzati in due grandi regni: piante e animali. Questo tipo di classificazione poneva dei grossi problemi riguardo ai procarioti, funghi e microrganismi.

In seguito, nel 1969, Whittaker divise tutti gli esseri viventi in 5 regni diversi in base al loro modo di nutrizione:

• Regno Plantae: Fotosintetici (autotrofi).
• Regno Animalia: Ingeriscono cibi solidi (eterotrofi).
• Regno Fungi: Assorbono nutrienti in soluzione.
• Regno Protista: Unicellulari, eucarioti (protozoi, alghe e mixomiceti).
• Regno Monera: Unicellulari, procarioti (batteri e cianobatteri).

Classificazione moderna

Nel 1990 lo scienziato Woese classificò tutti gli esseri viventi secondo tre domini:

• Bacteria.
• Archaea: Metanogeni e Estremofili.
• Eucarya: Ciliati, flagellati, piante, funghi e animali.

Filogenesi molecolare

Con la scoperta della molecola di DNA fu studiata l’organizzazione degli organismi viventi a livello molecolare. È stato scoperto che sia l’RNA sia il DNA stesso possono fungere da cronometri evolutivi. Le differenze tra le specie possono essere rilevate studiando le diverse sequenze dei loro nucleotidi, poiché il numero di differenze nella sequenza è proporzionale al numero di mutazioni avvenute nel DNA.

Così nasce la filogenesi molecolare, lo studio delle variazioni storiche delle molecole di DNA degli organismi viventi. Da qui si ha un'analisi filogenetica molecolare che individua tutte le sequenze macromolecolari per descrivere e analizzare tutte le differenze fra una sequenza o l’altra di DNA, RNA o proteine tra un essere vivente e l’altro. Questo tipo di studi è stato fondamentale per classificare i microrganismi.

Sequenza nucleotidica e PCR

Una volta ricostruita la sequenza di nucleotidi degli esseri viventi da studiare, si rapportano guardando le differenze fra uno e l’altro, come nel seguente esempio:

Essere Umano: GTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGCTGCAGT

Lievito: GTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGT

Mais: GTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAAGTTGTTGCAGT

E. coli: GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCG

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Il metodo usato per il seguente processo è la PCR, che serve ad amplificare logaritmicamente una singola molecola di un gene in diversi cicli. Un ciclo è suddiviso in tre tappe (1) Denaturazione, 2) Primer annealing, 3) DNA polimerizzazione) ed è ripetuto più volte, raddoppiando ogni volta il filamento di DNA (in 30 cicli si producono circa 1 milione di molecole).

Scelta del gene per la sequenza evolutiva

Per determinare le diverse caratteristiche evolutive tra le specie, è fondamentale la scelta del gene da sequenziare. La scelta si articola seguendo le seguenti propedeuticità:

• Presente in tutti gli organismi viventi, quindi fondamentali per le funzioni cellulari base.
• Omologo dal punto di vista funzionale, svolge le stesse funzioni.
• Sequenza conservata adeguatamente, né troppo variabile, né troppo poco variabile.
• Abbastanza grande da contenere tutte le informazioni storiche dell’individuo.

Quindi, bisogna individuare un gene che si è conservato per milioni di anni di divergenza evolutiva. L’RNA ribosomiale, 16S si trova nei geni che codificano per la molecola che è abbastanza grande da contenere le informazioni e sufficientemente piccola per sequenziarla. È stato usato per costruire gli alberi filogenetici di procarioti ed eucarioti (parte del 18S in questi ultimi).

Definizione di specie batterica

Una specie batterica è definita come un insieme di ceppi che condividono un determinato fenotipo, il quale si mantiene stabile ed è diverso da quello che caratterizza altri ceppi perché la propagazione batterica è clonale (per scissione), per cui la definizione di specie non si può basare sui criteri generici delle altre specie perché non si ha riproduzione sessuale. L’unità tassonomica della specie è definita da interfecondità parentale e fertilità della specie.

I ribosomi

I ribosomi sono organelli presenti in tutte le cellule eucariote e procariote, formati da due subunità (maggiore e minore) ognuna costituita da un complesso di RNA e proteine. I ribosomi sono la sede della sintesi proteica (sono sintetizzate le proteine).

Ribosomi nei procarioti

Nei procarioti, vi sono tre molecole di RNA ribosomiale di grandezza 5S, 16S e 23S. Le 16S e le 23S sono quelle più grandi perché contengono rispettivamente 1542 e 2904 nucleotidi, molto conservati e sufficientemente variabili in modo da essere usate come ottimi cronometri filogenetici.

I ribosomi nei procarioti costituiscono il 40% del peso secco della cellula, formato da due subunità di RNA e costituito da rRNA (RNA ribosomiale) e proteine ribosomiali. Le due subunità sono formate da:

• Subunità 50S: rRNA 23S + rRNA 4.5S + 34 proteine.
• Subunità 30S: rRNA 16S + 21 proteine.

Che insieme formano l’rRNA 70S.

Ribosomi negli eucarioti

I ribosomi negli eucarioti sono formati da due subunità 60S e 40S per formare un rRNA 80S.

Contributi storici alla microbiologia

Microbiologia è la disciplina che studia gli organismi invisibili ad occhio nudo. Van Leeuwenhoek è stato il primo scienziato che nel 1677 ha osservato in modo accurato e completo la struttura dei microrganismi tramite un microscopio dotato di una sola lente che consentiva un numero d’ingrandimenti pari a 50-300. Si iniziano ad avere delle ipotesi che potrebbero essere contrapposte alla teoria della generazione spontanea.

Contributi di scienziati

In seguito, si ebbero importanti contributi dovuti a:

• Koch: 1878 dimostra la causa di una malattia contagiosa come il carbonchio (antrace) dovuta al microrganismo Bacillus anthracis.
• Pasteur: 1864 dimostra che i microrganismi sono presenti nell’aria demolendo così definitivamente la teoria della generazione spontanea. Pasteur, attraverso un semplice esperimento, riuscì a confutare la teoria della generazione spontanea. Egli impiegò per i suoi esperimenti dei matracci a collo d'oca, che permettevano l'entrata dell'ossigeno, ma impedivano che il liquido all'interno venisse a contatto con agenti contaminanti come spore e batteri. Egli bollì il contenuto dei matracci, uccidendo così ogni forma di vita all'interno, e dimostrò che i microrganismi riapparivano solo se il collo dei matracci veniva rotto, permettendo così agli agenti contaminanti di entrare.

Altri scienziati importanti

In seguito, vi furono altri tre scienziati importanti che studiarono il comportamento dei batteri, fra cui:

• Spallanzani: Osservò la crescita batterica all’interno di fiaschi chiusi contenenti infusi, fatti bollire per breve tempo (30 minuti), dimostrando che l’aria può dare origine ad alcuni organismi.
• J. Tyndall: Osservò la crescita batterica negli infusi di fieno, sterilizzati a 100°C, e intuì che i batteri potevano trovarsi in due fasi distinte. Termolabile o Termostabile.
• F. Cohn: Riprese gli esperimenti di Tyndall dimostrando che i batteri presenti nel fieno (Bacillus subtilis) producevano forme resistenti al calore, oggi note come endospore batteriche.

Contributi di Koch

Koch dimostrò che il carbonchio (antrace) è una malattia infettiva, attraverso il seguente procedimento:

• Semina sangue prelevato da animale malato (infetto) in brodo nutriente (propagazione in vitro).
• Infetta animale sano con microrganismo propagato in vitro.
• L’animale si infetta di carbonchio.
• Reisolamento del microrganismo dall’animale malato.

Questo fu possibile grazie alle seguenti condizioni:

• Il Bacillus anthracis è di notevoli dimensioni.
• Produce spore.
• L’antrace dell’animale è una setticemia (infezione del sangue, normalmente sterile) in cui è presente solo l’agente patogeno.

Postulati di Koch

• L’organismo sospetto deve presentare tutti i casi della malattia, mentre negli animali sani deve essere completamente assente.
• Le colonie dell’organismo sospetto patogeno devono crescere come coltura pura.
• Le cellule coltivate da una coltura pura devono indurre la malattia negli individui sani.
• Bisogna risolare l’organismo patogeno per verificare l’identità con l’originale.

Caratteristiche dei microbi (microrganismi)

• Metabolismo: Assunzione di sostanze chimiche dall’ambiente che in seguito sono trasformate secondo processi che avvengono all’interno della cellula con successiva eliminazione verso l’esterno (la cellula è un sistema aperto).
• Riproduzione e crescita: Le sostanze chimiche assunte fungono da risorsa per la produzione di nuove cellule.
• Differenziamento: I microbi hanno la capacità di formare una nuova struttura cellulare, come ad esempio una spora.
• Comunicazione: Le cellule comunicano o interagiscono fra loro per via di sostanze chimiche rilasciate/assunte da queste.
• Mobilità: Sono spesso in grado di muoversi autonomamente.
• Evoluzione: Le cellule si evolvono, acquisendo nuove proprietà biologiche.

I microbi, a livello di funzioni codificanti, tramite il DNA svolgono processi di replicazione e caratterizzano l’espressione genica di un individuo. Tramite poi l’RNA, si danno via ai processi di traduzione che porteranno alla sintesi di proteine.

Dal punto di vista strettamente energetico, la cellula vista come “macchina cellulare” svolge diverse azioni quali la scissione binaria. I batteri, sia sotto forma di colonie che in singole cellule, si dividono secondo il seguente schema:

• Inizio: DNA cellulare circolare.
• La cellula batterica si allunga e il DNA inizia a replicarsi.
• Inizio della divisione cellulare, con la distribuzione di molecole di DNA in ciascuna nuova cellula formata.
• Le due cellule figlie possiedono le stesse molecole di DNA della madre.

Informazione genetica nei procarioti ed eucarioti

Tutte le cellule codificano l’informazione sotto forma di DNA. Esso è composto dalle stesse basi (G, A, T, C) e lo stesso zucchero (D-ribosio). La sintesi del DNA è uguale in tutti gli organismi.

Differenze fra procarioti ed eucarioti

Procarioti...