Microbiologia Appunti Parte 1

Le forme principali della cellula batterica sono:

• Bacillo o bastoncino

• A forma di cocco

• A virgola tipica dei Vibrioni come il Vibrio coleri

• A spirillo

• A spirocheta

• Durante la divisione del battere la cellula madre si divide in 2 cellule figlie separate ma può

accadere che possano rimanere collegate: diplococchi.

• Se le cellule si dividono e rimangono unite formando una catenella abbiano gli streptococchi.

• Se i piani di divisione sono 2 e ortogonali l'uno all'altro si formano le tetradi e sono batteri

chiamati micrococcus: mani e terra

• Se sono 3 piani di divisione: sarcine

• Se sono più di uno abbiamo la formazione di un grappolo d'uva: stafilococchi. Sono considerati

patogeni opportunisti ossia sfrutta la debolezza dell'organismo umano. Abbiamo lo Stafilococcus

epidermidis; l'aureus perchè la colonia assume un colore giallo-oro e forma biofilm sulle protesi

causando infezioni non facilmente debellabili.

DIVISIONE CELLULARE

A metà si forma il setto di divisione della cellula madre in cui abbiamo nuova sintesi di membrana e

parete cellulare. Esso si invagina sempre di più finche le cellule figlie si separano diventando sempre

più indipendenti. Intervengono proteine in qst divisione che prima non si pensava erano incluse:

esempio la proteina FtsZ, la quale è simile alla tubulina, è inclusa e anche nei batteri quindi c'è

qualcosa simile al citoscheletro. Quella proteina si localizza dove si forma il setto di divisione. Questo

nel S. aureus.

Nel B. subtilis è presente la proteina MreB è simile all'actina e la funzione è qll di garantire la

forma a bastoncello della cellula intervenendo anche con la FtsZ (similtubulina).

Nel C. crescentus ha la crescentina simili ai filamenti intermedi. Oltre ad avere la MreB e la FtsZ ha

anche la crescentina utile sempre per mantenere la forma della cellula batterica.

Grazie ai mutanti, non producono più la proteina, è stato possibile capire le funzioni di proteine,

processi fisiologici, genetici e biochimici.

GRAM POSITIVI E NEGATIVI

I batteri possono essere divisi in gram positivi e negativi. Gram ha messo a punto una colorazione

per separarli in 2 gruppi. Entrambe le tipologie hanno membrana citoplasmatica.

All'esterno, nei gram negativi c'è un sottile strato di mureina e al di la un'altra struttura chiamata

membrana esterna. I positivi hanno membrana, spesso strato di mureina ma non hanno membrana

esterna al di là del peptidoglicano. La diversa colorazione dipende dallo spessore della mureina. Se è

elevato il colorante di gram (blu-violetto) entra nella cellula e ci rimane (gram positivi). Se entra e

poi viene estratto grazie ad alcool ci troviamo nei gram negativi poichè assumono colorazioni rosa-

rossi.

MEMBRANA CITOPLASMATICA

E' un doppio strato fosfolipidico con proteine integrali di membrana, proteine periferiche (verso il

citoplasma), lipoproteine. Una caratteristica del battere è che non ha nella membrana gli steroli. Essi

stabilizzano la natura della MC. Ma recentemente sono stati trovati gli opanoidi che ricordano il

colesterolo ma sono un qualcosa di diverso. Essi stabilizzano la struttura della MC. Anche ioni Mg e

Ca stabilizzano la struttura.

La membrana è permeabile selettivamente ma nei cianobatteri avviene fotosintesi o respirazione.

Insomma sede produzione energia.

Alcune proteine sono responsabili della comunicazione del battere con l'ambiente esterno.

E' sede anche della sintesi della parete cellulare: primo stadio avviene nel citoplasma, il secondo

nella MC, il terzo nella parete vera e propria.

I batteri hanno come catene acidi grassi per i fosfolipidi, il glicerolo è D-glicerolo, il tipo di legame è

estere.

In alcuni batteri fotosintetici, il processo avviene nella MC che può invaginarsi creando una serie di

lamelle oppure formando inclusioni citoplasmatiche (clorosomi).

Negli archea il glicerolo è L-glicerolo, legame etere tra glicerolo e catene isopreniche, e non ha

quindi acidi grassi ma catene isopreniche. MC sono rappresentate come monostrato lipidico. Tipica

degli archea ipertermofili in cui la membrana deve adattarsi dato che aumentando la T° aumenta la

fluidità. Gioca un ruolo fondamentale per la viscosità della MC il rapporto degli acidi grassi saturi e

insaturi. Gli archea hanno catene isopreniche cicliche. Poco permeabile. Il doppio strato è molto di

più permeabile.

Ci sono antibiotici che alterano la struttura della MC bloccando il blocco della divisione cellule

oppure la morte? SI! Le 3 classi principali sono:

• polieni -> provocano formazione di grossi pori nella MC e a quel punto viene alterata lo scambio di

ioni e la cellula muore;

• daptomicina -> è un lipopolipetide il quale forma un canale abnormale che provoca la morte

• anfotericina B -> interagisce con l'ergosterolo. Quindi non agisce sul battere perchè non c'è

colesterolo. Agisce sulle cellule fungine che lo hanno formando un poro a livello della MC alterando

sempre gli scambio ionici

• lisina -> interagisce con una subunità della mureina. Una volta interagito, essa crea pori nella MC

come prima.

PARETE CELLULARE

Formata da alternarsi di NAG (N-acetil

glucosamina) e NAM (N-acetil muramico) che

insieme formano le catene glicaniche. Il legame tra

questi zuccheri è ß 1-4 glicosidico. Se rompo il

legame la cellula batterica muore. Ci sono enzimi

che rompono il legame come il lisozima facendo

crepare il battere. Le catene glicaniche sono

stabilizzate da una serie di legami di aminoacidi.

Abbiamo anche aminoacidi D, non solo L. Gli

aminoacidi c'è da saperli quali sono: Lys nei gram

positivi, acido diaminopimelico nei negativi. Questa

catena tetrapeptidica è legata al NAM. La stabilità d qst struttura è determinata dal legame che si

forma tra queste catene al NAM di catene glicaniche diverse.

Le penicilline agiscono sulla parete a livello del legame tra le due catene tetrapeptidiche di due

NAM che appartengono a due catene glicaniche diverse.

Il lisozima agisce sulla parete cellulare gia formata ma nn è ideale per un trattamento contro il

batterio. La penicillina invece impedisce la sua formazione quindi agisce mentre la parete cellulare è

in corso di sintesi. Non ha effetto se la parete è gia formata!! MANNAIA!!!

La funzione della parete cellulare è quella di dare forma e rigidità alla cellula. L'altra è quella di

controbilanciare la Pressione osmotica.

Possiamo ottenere una cellula batterica priva di parete cellulare vitale ma solo se la manteniamo in

una concentrazione isotonica. Elimino la parete cellulare usando il lisozima e per esempio se

inizialmente era a bastoncino diventa circa rotonda perdendo la sua forma formando il Protoplasto

(vitale solo se in soluzione isotonica). C sono terreni di coltura dove i protoplasti riacquiscono la

parete cellulare e quindi la sua forma.

Se fosse in soluzione ipotonica la cellula richiama acqua dall'esterno per mantenere l'equilibrio con

l'esterno ma senza parete la cellula scoppia.

In ambiente ipertonico la cellula continua a perdere acqua collasando. In entrambi i casi la cellula

batterica crepa!!!

In alcuni batteri l'a.a in posizione 3 si

lega a quello in posizione 4 d un altra

catena in modo diretto oppure ci può

essere un ponte pentaglicidico. Essendoci

il DAP è un gram negativo.

Nei positivi abbiamo la Lisina ma non è

diretto ma c'è quel ponte mediato da 5

glicine.

Tt queste info riguardano E. Coli.

Parlando della sintesi della parete cellulare abbiamo già detto che può essere suddiviso in 3 step.

Nel citoplasma avviene la sintesi dei precursori della parete cellulare: UDP-NAM e UDP-NAG.

Sapendo che uno dei precursori del NAG è il PEP e esiste un antibiotico chiamato fosfomicina che

interagisce con l'enzima che permette di formare il PEP. Un altro è la cicloserina che blocca un

altro step della sintesi dei precursori nel citoplasma che è l'aggiunta di una coppia di D-alanina

nell'UDP-NAM. La cicloserina blocca l'attacco della coppia di alanina.

Questi precursori non possono in qst stato di

attraversare la MC. Quello che media il

passaggio è il Carrier o Trasportatore. Ha

una coda lipidica e un gruppo P ed è

chiamato Bactoprenolo. Esso lega i precursoi

e forma il Lipide 1 quando lega l'UDP-NAM e

il lipide 2 quando esso lega l'UDP-NAG

all'esterno dove c'è sintesi attiva di parete.

All'esterno il bactoprenolo si stacca, rientra

nel citoplasma e ricarica i precursori di Trasporto precursuori all'esterno grazie al BACTOPRENOLO.

nuovo.

La bacitracina lega il bactoprenolo e lo inibisce.

Il terzo passaggio avviene nella sede di sintesi della parete cellulare e consiste nella formazione dei

diversi legami delle catene tetrapeptidiche tra le molecole di NAM e NAG: transpeptidizazione. Gli

enzimi che fanno qst reazione sono quelli che si legano ad antibiotici come le penicilline. Gli

antibiotici sono i ß-lattamici perchè hanno un anello ß-lattamico la cui integrità è importante x il

suo funzionamento. Tra questi antiobiotici abbiamo penicilline e cefalosporine, prodotti da funghi

(penicillium e cefalosporium). I gram positivi avendo la membrana esterna erano rallentati. Allora

furono fatte modifiche chimiche.

I batteri possono acquisire resistenza alle penicilline.

ARCHEA

la parete cellulare dei archeobatteri è esternamente variabile e contiene lo PSEUDO-PEPTIDOGLICANO

ma non peptidoglicano.

differenze rispetto al peptidoglicano :

-la catena lineare è costituita da NAG e NAT(N-acetil talosaminuronico) la edda❤ dice che basta NAT

️

-legame glicosidico beta-1,3 (il lisozima non lo caga)

- la catena tetrapeptidica gli amminoacidi sono tt in forma L.

questa parete negli archea non è tt uguale.

differenze tra gli archea:

STRATO S strato S:

molte hanno anche altri involucri tipo lo

di natura proteica* a forma cristallina e la funzione è abbastanza varia

-protezione da tossine

-recettori

(proteine ricche di lisina e aspartato )*

lo strato S sta al di la interagisce con i peptidoglicano o interagisce con la membrana citoplasmatica o

interagisce con la ME. Quindi puo essere trovato sui G-G+ e micobatteri

glicocalice

puo sostituire il S

e puo sessere appiccicato alla cellula => capsula (patogeni)

o può essere non perfettamente adeso => strato mucoso

la natura di questi glicocalici è polisaccaridica

garantisce protezione a antibiotici disinfettanti ecc e impedisce l' inclusione dei MACROFAGI nel nostro

organismo.

colorazione

la capsula si può vedere con l' inchiostro di china che la rilava come un alone trasparente attorno alla

cellula.

la capsula è un fattore di virulenza se perdo la capsula la cellula non è virulenta.

la cellula può produrre gli esopolisaccridi che cementano le cellula su una superficie e li si trova anche nei

dentrifici.

trasporti si sostanze dall' interno all esterno

traslocone SEC riconosce il segnale (seq. seganle

domino interno idrodobico)

una volta la proteina è sintetizzata il secB si sega

alla proteina e la trasporta al secA questo

complesso porta la proteina al canale (sec YEG)

dove la proteina deve essere trasportata .tramite l'

idrolisi dell' atp fa modificare il mio trasportatore

(sec YEG) aprendolo e premettendo il transito della

mia proteina nel periplasma. sempre nel periplasma

la sequanza segnale viene levata e poi arrivano le

ciaperonine ecc..

Il sistema SEC è presente nei batteri ed archea.

Partendo dal citoplasma una proteina neosintetizzata avente la sequenza segnale viene legata a una

componente del traslocone SEC chiamata proteina SEC B che la trasporta e la lega a un'altra compontente

del traslocone chiamata SEC A. E' qll proteina che fornisce energia al sistema di trasporto tramite idrolisi

dell'ATP. Una volta avvenuta l'idrolisi si ha una modificazione del SEC Y e attraverso questo canale generato

la proteina viene secreta nel periplasma tagliando la sequenza segnale. Il suo destino dipenderà dalla sua

localizzazione segnale. Nel periplasma c sono le chaperonine che sono responsanbili del corretto

ripiegamento della proteina.

Ci sono diversi sistemi che trasportano le proteine:

Un primo sistema che dipende da SEC è chiamato sistema di trasporto SRP. Inserisce proteine che hanno

la loro localizzazione finale nella membrana citoplasmatica.

Il complesso responsabile di qst inserimento è un comolesso

ribonucleoproteico. Nella immagine abbiamo la L23 che è una

delle proteine coinvolta nel processo di trasporto, abbiamo la

sub. maggior e minore del ribosoma, la proteina che è in

fase di sintesi nel ribosoma che sarà inserita nella

membrana. La prima porzione della proteina che fuoriesce

dal ribosoma si chiama sequenza segnale. Quando fuoriesce

interagisce direttamente con la proteina SRP. Questo

complesso è riconosciuto da un altra proteina FtsY che è una

proteina di membrana e che complessandosi col sistema SRP-

ribosoma-proteina nascente inserisce la proteina nella

membrana citoplasmatica. E' SEC-dipendente perchè l'inserimento è mediato da SEC Y che era quel canale

che si apriva che lasciava passare le proteine nel periplasma ma ha anche qst funzione. Una volta inserita

la proteina nella membrana assumerà il corretto ripiegamento.

Il secondo sistema serve per portare le proteine

all'esterno della cellula (come anche le altre due che

vedremo). Li troviamo nei batteri gram negativi. Si

chiama sistema di secrezione di tipo 2 tipico di

numerosi batteri patogeni che trasportano verso

l'esterno quelle proteine che causano la patologia.

Esempio il vibrio coleri è gram negativo e fa insorgere

il colera perchè produce una tossina che interagisce a

livello intestinale provocando una alaterazione completa

degli ioni nelle cellule intestinali. Si crepa perchè si

genera una forma diarroica così violenta che provoca

disidratazione. Il modo di espellere la tossina avviene in qst modo. La tossina viene sintetizzata nel

citoplasma con una sequenza segnale che viene riconosciuta nel traslocone SEC. Attravero questo passa la

membrana e passa nel periplasma. Qui viene tagliata la sequenza N-terminale. La proteina assume la

conformazione terziaria grazie alle chaperonine e quando l'ha assunta viene trasportata all'esterno della

cellula batterica attraverso un canale presente nella membrana esterna. Dato che è un trasporto richiede

energia. La fonte di energia in alcuni casi dall'idrolisi di ATP o in altri GTP. La proteina responsabile

dell'idrolisi dell'ATP (GspE) è localizzata nel versante citoplasmatico della cellula, idrolizza l'ATP e questo

gli consente di far passare la tossina correttamente ripiegata all'esterno della cellula.

Il terzo sistema è sempre SEC-dipendete tipico dei

gram negativi. E' quello che viene definito sistema di

trasporto a due partner ossia c sono due proteine

coinvolte in qst sistema. Dipende sempre dal

traslocone SEC. Questo sistema è formato da 2

proteine: la prima è la proteina tpsB che viene

sintetizzata nel citoplasma avente sempre la

sequenza segnale che la rende substrato del

traslocone SEC e quindi trasportata nel periplasma.

Qui si taglia la squenza segnale e va a inserirsi

nella membrna esterna sotto forma di canale.

Attraverso questo canale passa la proteina che deve essere trasportata all'esterno. L'altra proteina tpsA è

sempre sintetizzata nel citoplasma avente sequenza segnale e anche un corto frammento (in verde) che è

responsabile del legame della proteina che deve essere trasportata al canale attraverso il quale passa

nella membrana esterna.

I geni che codificano la proteina canale e quella trasportata sono coordinati nella loro espressione ossia non

si può esprimere una proteina e l'altra no ma vengon SEMPRE espressi CONTEMPORANEAMENTE.

Quando la proteina ha passato la membrana esterna può rimanerci legata se quella è la sua localizzazione

finale oppure liberata all'esterno della cellula.

La proteina tpsA può essere responsabile dei fattori di virulenza.

Il quarto sistema si chiama sistema autotrasportatore ossia

un unica proteina è responsabile sia della formazione del

canale sia del trasporto. Questa proteina è caratterizzata

da 3 domini: il primo è la sequenza segnale perchè

sintetizzata nel citoplasma e trasportata nel periplasma dal

traslocone SEC; il secondo è rappresentata dalla porzione

che verrà trasportata (N-terminale) mentre la parte C-

terminale della proteina si inserisce nella membrana esterna

che forma un canale attraverso il quale passa la proteina

vera e propria. A differenza del terzo che erano 2 le

proteine ossia il canale e trasportata sono sulla stessa

sequenza aminoacidica.

Il quinto sistema SEC dipendente si chiama sistema

chaperone/usciere. E' la sintesi di particolari tipi di pili. La

proteina che formerà il pilus viene sintetizzata nel

citoplasma avente la sequenza segnale che viene

riconosciuta dal sistema SEC e raggiunge il periplasma. QUi

una porzione C-terminale della proteina si lega alla

chaperonina chiamata PapD. Quindi questa chaperonina fa

assumere il corretto ripiegamento alla proteina ma anche di

impedire alle piline (proteine che formano i pili) di

assemblarsi nel periplasma. Ovviamente quando raggiunge il

periplasma la sequenza segnale viene tagliata. Così la pilina

raggiungerà la sede di sintesi del pilus presente nella sede esterna della membrana esterna.

SISTEMA TAT

Le proteine trasportate dal TAT hanno sequenza

segnale all'N-temrinale come nel SEC ma la

sequenza aminoacidica è diversa. Quindi è più lunga

(34 a.a prima 23 a.a) inoltre le protine trasportate

dal TAT hanno sequenze aminoacidiche particolari.

Le proteine che formano il sistema TAT sono 3: A, B

e C. La TatA è una proteina avente dominio

transmebrana e citoplasmatica. La TatB ja due

domini come la A. La TatC ha 6 domini

transmembrana e sia l'N sia il C-temrinale sono

rivolti verso il citoplasma. Il TatA formerà il canale

attraverso il quale la proteina trasportata passerà.

Perchè una proteina non viene riconosciuta dal SEC? Perchè possiede una sequenza segnale che è

definita per il TAT. Si complessa al TatBC e poi all'A. RR è la serie di arginine comuni a tt le

sequenze segnale. Il sistema trasporta enzimi coinvolti nella respirazione e come si sa servono

cofattori (pallina verde). B e C sono proteine che sono coinvolte nel legame della protein che deve

essere trasportata prima a TatB e TatC e poi si complessano facendo uscire attraverso il TatA verso

il periplasma.

Quindi la proteina che deve essere trasportata deve essere correttamente ripiegata nel citoplasma x

essere riconosciuta dal TAT.

Un altro sistema di trasporto diffuso in tt e 3 i domini: sistema di trasporto ABC (ATP-binding-cassette)

ossia una proteina lega l'ATP e quindi l'energia

necessaria per qst trasorto è l'idrolisi dell'ATP. A

differenza dei precedenti qst sistemi di trasporto

trasportano in entrambe le direzioni. Dall'esterno

all'interno trasportano aminaocidi e zuccheri.

Dall'interno all'esterno trasportano emolisine che

sono proteine coinvolte nella manifestazione

patologiche:fattori di virulenza. Ci sono 3

proteine coinvolte.

La proteina che deve essere trasportata passa atrraverso un complesso di proteine che legano la membrana

cellulare direttmente alla membrana esterna. La sequenza segnale che permette al riconoscimento è nella

regione C-terminale (e non all'N-terminale).

La prima proteina presente è la proteina ABC respoinsabile dell'idrolisi di ATP che fornisce energia presente

sul lato citoplasmatico della cellula.

La seconda è chiamata MFP (proteina di fusione delle membrane). Chiamata così perchè mette in contatto

ABC con la proteina localizzata nella membrana esterna (OMP). Quindi la proteina passa attraverso qsr

complesso ma senza entrare in contatto col periplasma. Qst proteine hanno un ruolo impo negli

streptomiceti (antibiotici). Ma il ceppo sappiamo produce un antibiotico ed è attivo su tutti batteri. E allora

come fa a non essere sensibile alla molecola che egli stesso produce. Ha sviluppato meccanismi che gli

permettono di resistere alla molecola da lui prodotta. Il meccanismo illustrato centra con questo sistema di

trasporto. La molecola viene porodttoa nel citoplasma dello streptomicete ma viene subito espulso

all'esterno prima che la molecola vada a inibire tutto.

Le antracicline prodotte da speci del genere Streptomices sono agenti antitumorali. La cellula tumorale

diventa resistente ad esse perchè si ha un aumento nel numero dei geni che codificano qst tipologie di

proteine. L'aumento di qst geni aumenta la quantità di proteine prodotte in midi che l'agente antitumorale

entra nella cellula ma verrà subito espulso.

L'immagine a dx si riferisce alla E. Coli ma chissenefotte!

NON FARLA. SUL LIBRO SALTARE QUESTA PARTE.

UN ALTRo trasporto tipico dei batteri patogeni è un

sistema che trasporta nel citoplasma dell'eucariote il

fattore di virulenza del patogeno. Nell'immagine

Iersinia Pestis, gram negativo. Si chiama sistema di

secrezione di tipo 3.

Se il batterio è patogeno deve interagire con la cellula

eucariote e a seconda del patogeno inserire nel

citoplasma di essa il fattore di virulenza. Il fattore di

secrezione passa direttamente dalla cellula batteria al

citoplasna dell'eucariote.

Qst sistema richiede l'intervento di numerose proteine:

YscN fungono da apparato di trasporto mentre le altre YopB e D sono qll trasportate. Qst sistema funge

come un ago, un tubo tramite il quale si stabilisce un contatto diretto. Anche in qst caso è un sistema che

richiede energia e come le altre la proteina che deve essere trasportata viene riconosciuta grazie alla sua

sequenza segnale e poi riconoisciuta dal tubo.

Se il batterio lo coltivo in lab, tt qst ambaradan non serve. In vitro la cellula batterica sintetiszza tt qst

apparato, il fattore di virulenza ma esso non viene trasportato. Se viene messo in contatto con la cellula

ospite e il sistema si mette in funzione prendendo il fattore di virulenza sbattendolo dentro a sto tubo.

L'immagine a sx si riferisce al fatto che qst sistema d trasporto è simile a come si organizza il flagello

(appendice che permette il movimento della cellula batterica). Il flagello è d natura proteica, formata da

flagellina. Quindi la sua localizzazione finale è la membrana esterna ma la flagellina è sintetizzata nel

citoplasma trasportandola fino alla membrana esterna. NON sempre il movumento flagellare utilizza

l'idrolisi di ATP come fonte di energia anzi la maggior parte delle volte utulizza la forza protomotrice.

L'altro e ultimo sistema si chiama sistema di

secrezione di tipo 4. Trasporta proteine e DNA.

Quindi questo sistema è coinvolto nella

coniugazione. Oppure il trasporto di un particolare

frammento di DNA chiamato tDNA localizzato

all'interno di un batterio il cui genere è

Agrobatterium specie tumefacem, gram negativo.

Quando viene localizzato con cellule vegetali ci

inserisce il frammento tDNA contenente un

onicogene e la pianta si ammala provocando

tumori. Il trasferimento di tDNA avviene

attraverso un sistema di trasporto d qst tipo.

Tutti i numeri in immagine sono le proteine che formano il sistema di trasporto. Sul libro non fare tt le

cose che dice. Fare solo queste cose qui.

APPENDICI FILIFORMI

FLAGELLI

Sono 3: appendici, flagelli e fimbrie. Tt le cellule hanno flagelli? NO! Tutte le cellule hanno flagelli e

fimbrie? MOLTISSIME!

I flagelli sono responsabili del movimento della cellula batterica. Può muoversi attraverso la

sciamatura, nuoto, contrazione ecc. Alla base di sto movimento c sono i flagelli. Ma il movimento è

mediato da cosa? Dallo stimolo ambientale ossia:

• chemiotassi: in risposta a una molecola

• fototassi: in direzione della fonte luminosa che abbia la lunghezza d'onda più favorevole x la

fotosintesi

• aerotassi: dalla presenza o assenza di O2. Se non tollera che c'è O2 se ne va

• magnetotassi: in funzione del campo magnetico terrestre (acquatici)

• pHtassi

• Termotassi

• Osmotassi: in risposta a concentrazione saline

I flagelli possono essere localizzati sulle estremità e uno solo: Monotrica. Sull'intera superficie:

Peritrica. Un flagello per ogni estremità della cellula: Anfitrico oppure abbiamo un ciuffo di flagelli

su un polo solo: Lofotrica.

I flagrlli sono più lunghi dei pili e fimbrie, molto più sottile (5 nm) e non sono osseervabili al MO ma

se li ispessiamo possiamo. Visibili al ME a trasmissione.

Se prendessimo una vaschetta con un capillare e questo

capillare li riempiamo con soluzione fisiologica, le cellule

si muivono casualmente. Ma se inserisco il glucosio

(nutriente) le cellule batteriche indirizzano verso il

punto in cui il glucosio è maggiormente concentrato. Si

dirigono verso un punto preciso grazie a una direzione

di rotazione del flagello. Ovvismente non è che passiamo

da a cazzo a dritto, è un movimento che tende ad

andare verso il glucosio subendo lo stesso qualche

capovolta.

Il flagello è formato da 3 parti principali:

• corpo basale

• uncino

• filamento flagellare

Il corpo basale ancora il flagello alla cellula

batterica attraverso una serie di anelli che sono

4 nei batteri gram negativi e 2 nei positivi.

Nei gram negativi (immagine) abbiamo l'anello L

che ancora il flagello alla membrana esterna. Il

P lo lega al peptidoglicano. L'MS lo ancora alla

membrana citoplasmatica e l'ultimo C è qll rivolto

verso il citoplasma.

Nei positivi uno lo lega alla membrana citoplasmatica e l'altro al peptidoglicano.

Il movimento è un lavoro e richiede energia: d solito utilizzano come energia la forza protomotrice.

Nella struttura del flagello c'è il rotore ossia gli permette di ruotare in senso orario e antiorario.

Accanto al rotore c'è lo statore formato da 2 proteine che collegano la membrana citoplasmatica al

peptidoglicano. Se il flagello ruota in senso antiorario la cellula batterica va avanti, la cellula

batteria va orario dietro. Il tipo di movimento che fa la cellula dipende da quanti flagelli ha la

cellula. Se ce ne uno è semplice ma se è completamente rivestita se si muove in senso antiorario

tutti i flagelli assumono una struttura che spinge la cellula in avanti. Se deve andare indietro fa una

capovolta.

C'è un tubo cavo che riveste il filamento flagellare. Esso è responsabile della rotazione e quindi della

direzione del movimento. E' formato dalla flagellina.

Ma come fa la cellula a capire che la

deve andare o andarsene? Grazie a un

sistema a 2 componenti. C sono almeno 2

proteine vuol dire. La prima è quella che

ha funzione di sensore e quindi

localizzata nella membrana esterna e

percepisce la presenza di una tal cosa.

Questa proteina ha recepito un segnale

fisico o chimico. La risposta viene mediata

dall'altra proteina con una modificazione

della direzione del movimento

modificando la rotazione del flagello. Quando la proteina sensore riconosce la presenza di una

sostanza partono una serie di reazioni a cascata nelle quali da una proteina all'altra viene trasferito

un gruppo P.

Le cellule batteriche sono caratterizzate dalla presenza di recettori sulla sup. della cellula che

legano per esmepio nell'immagine sostanze attraenti. Quando le legano attivano la chinasi sensoriale

CheA (sensore). Essa viene fosforilata e il gruppo P viene trasferito alla proteina CheY che

determina una modificazione della rotazione del flagello andando a interagire con lo statore e

rotore.

Quindi il rotore e statore fanno parte del flagello!!!

Il flagello viene sintetizzato alla sup. della cellula

batterica. La sintesi di nuovo flagello avviene

aggiungeno subunità di flagellina all'apice del

filamento flagellare superando tt le strutture

membranarie batteriche. I geni sono circa 50 che

mediano la sintesi. Essi non vengono attivati insieme

ma in 3 blocchi. Il primo blocco permette di cominciare a utilizzare proteine che inducono la

traduzione e trascrizione dei geni per formare il corpo basale e l'uncino (rivestimento). Una volta

formati sti due, qst induce la sintesi di geni di classe 3 coinvolti nella sintesi del filamento flagellare.

C sono un gruppo di microrganismi come le spirochete (forma spirale) ma il flagello è tra la

membrana esterna e Peptidoglicano. Ecco xk sono chiamati flagelli periplasmatici. Il meccanismo

d'azione è sempre la rotazione per il movimento.

Anche gli archea hanno i flagelli. C sono 3

caratteristiche che diferenziano i flagelli dei batteri

e qll degli archea:

• nei batteri c'è il corpo basale, uncino e filamento

flagellare. Nella slide vediamo che negli archea

non c sono anelli ma un sistema discoidale che ha

sempre la funzione di ancorare il flagello degli

archea alla membrana citoplasmatica.

• C'è sempre l'uncino

• Il filmanrto flagellare degli archea è più sottile, formato da diverse tipi di flagellina e non solo

una.

• Nel movimento degli archea l'energia del movimento è fornita dall'idrolisi dell'atp e non dalla forza

protonica.

• Le flagelline sono andate incontro a un processo di modificazione post-traduzionale ossia che la

flagellina viene sintetizzata nel citoplasma e prima d andare a formare il filmanrnto cellulare

viene modificata ossia enzimi aggiungono alla cellula dei residui di glicani. Nei batteri non c'è

questo fatto. Gli archea ricordiamo hanno caratteristiche in comune coi procarioti e eucarioti (in

cui è tipico questo fatto)

• Nei batteri le subunità di flagellina vengono aggiunte all'apice mentre negli archea vengono

aggiunti alla base perchè la dimensione del diametro degli archea è molto più sottile e la

flagellina non riesce pertanto a raggiungere l'apice.

• Non è chiaro quale sia il sistema rotore-statore.

PILI

Sono molto più corti dei flagelli e sono visibili sempre solo al ME a trasmissione. Vengono distinti in

pilo (più spesso) e fimbria (meno spesso).

Sono sempre distribuiti sulla superficie. Esistono pili di diversi tipi (tipo 1,2,3 e 4) formati dalla

pilina. Hanno la funzione di:

• Far aderire la cellula batterica al substrato (superficie di un banco, catetere e anche roccia)

• contatti tra cellule e cellule

• un tipo particolare funge da trasferimento di DNA ad un altra cellula batterica nella coniugazione

• formazione di biofilm (patina di cellule microbiche che si formano su qualunque superficie)

• recettori per virus batterici

• in qualche caso i pili sono coinvolti nella mobilità della cellula batterica

Nella slide abbiamo un batterio gram negativo

(tipico avente pili).

La prepilina ha una coda idrofobica al C-

terminale, all'N-terminale ha una struttura

globulare, presente la sequenza segnale. La

prepilina passa la MC e nello stesso tempo subisce

l'eliminazione della sequenza segnale.

Le proteine PilB e PilT svolgono una funzione

opposta l'una con l'altra. L'energia per il trsporto

è data dall'idrolisi dell'ATP.

Quando la prepilina raggiunge il periplasma interagisce sia con la parte lineare sia globulare delle

altre piline già inserite nella struttura del pilo. L'idrolisi dell'atp viene sfruttata per dare una spinta

al pilo per farlo uscire all'esterno e quindi aggiunta di pilina alla base del pilo in formazione.

La PilB permette l'idrolisi dell'atp e la spinta del pilo in avanti, la PilT depolimerizza subunità di

pilina dal pilo nascente. Questo vuol dire che quando aggiungo subunità di piline il batterio si muove

in avanti, se depolimerizzo il batterio si contrae. Questo accoppiata polimerizzazione-

depolimerizzazione permette il movimento. Ricordiamo sempre che è il flagello l'organo principale

per la mobilità ma in alcuni casi anche i pili possono contribuire.

Quindi abbiamo visto le appendici filiformi,

l'eventuale capsula, strato S, membrana esterna per

i gram -, peptidoglicani e membrana cellulare, ora

entriamo nel citoplasma.

Le masse in arancio rappresetnao il cromosoma della

cellula batterica che nella stragrande maggiornaza

dei casi non è ricoperta dalla membrna nucleare. Ma

nella immagine a dx invece abbiamo una eccezione

perchè presentano una mmebrna nucleare ben

definita.

In qll sotto abbiamo il genoma dei batteri che quindi è localizzato nel citoplasma, può essere

complessato in proteine e localizzato nella struttura chiamata Nucleoide.

Nel citoplasma abbiamo anche i ribosomi, unici organelli citoplasmatici presenti nelle cellule

batteriche. Se è in fase di crescita abbiamo una grande presenza di ribosomi (200.000 per cellula).

Non c'è RER ma c'è una differenza nel processo di trascrizione e traduzione delle proteine. Nei

batteri trascrizione e traduzione posso avvenire insieme ossia non ha ancora terminato di

trascrivere RNA in mRNA che già che l'mRNA si lega al ribosoma per iniziare la sintesi della

proteina: ecco i Poliribosomi.

Ribosomi di un procariote o archea e eucariote sono diversi: nel procarioti il coeff. d sedimentazione

è 70s, nell'eucariote è 80s e inoltre hanno proteine e rRNA diversi.

Esistono numerosi classi di antibiotici che uccidono i batteri perchè interferiscono con la sintesi

delle proteine. Ma uno può dire che anche le mie cellule vengono uccise? No perchè le differenze di

sedimentazione e le diverse proteine spiegano perchè le nostre proteine non vengono toccate. Gli

antibiotici hanno affinitià 10.000 volte superiore per i ribosomi batterici.

• Essendo inclusioni citoplasmatici non sono organelli. Hanno una membrna lipidica monostrato e in

alcuni casi da una d natura proteica. Ci sono in alcuni casi in certi batteri e non in altri. L'acido

PHB fa parte di una classe di acidi chiamati PHA (poli idrossi alconati) e possono sostituire il

materiale plastico di natura biologica. L'accumulo di PHB avviene quando la cellula ha già a

disposizione un eccesso di nutrienti con funzione di riserva. Quando non ha energia allora ne fa

uso. Le tiene dentro perchè se no aumenterebbero danni di natura osmotica.

• Nei batteri possono sfruttare i granuli di zolfo come fonte di energia

• vescicole gassose sono circondati da strati di natura proteica, impermeabili all'avqua ma

permeabili ai gas. Presenti nei cianobatteri. Sono dei canali cavi pieni di questo gas, meno dense

alla cellula contribuendola al galleggiamento, come nei cianobatteri così da garantire a loro di fare

fotosintesi. Sono strutture labili. In alcuni casi le vesciole aiutano i cianobetteri a fargli

raggiungere ambienti più estremi

• Cristalli parasporali lasciamo perdere per ora.

• magnetosomi sono ricchi di magnetite che permettono ai batteri acquatici di muoversi in funzione

del campo magnetico terrestre.

• carbossisomi si trovano in batteri fotosintetici, racchiudono l'enzima principale coinvolto nella

fissazione della CO2 in glucosio durante la fotosintesi. L'enzima è la rubisco. Abbiamo anche gli

enterosomi presenti nei batteri gram - come la salmonella che inteagusce con le cellule epiteliali

dell'intestino. Esse Contengono al loro interno enzimi come il propandiolo. Esso è un prodotto di

degradazione di uno zucchero presente nelle cellule eucarioti. Quindi quando salmonella attacca le

cellule epiteliali, avendo gli enterosomi in cui abbiamo enzimi che attaccano e ciulano il

propandiolo che serve alle cellule eucarioti. Quindi questi enzimi sono dei fattori di virulenza.

• ficobilisomi sono formati da proteine coinvolte nel processo di cattura della luce per fare

fotosintesi.

• clorosomi sono strutture nella quale avviene fotosintesi in batteri fotosintetici verdi. Sono

localizzati i pigmenti per far fotosintesi.

• I cromatofori sono stutture diverse in batteri diversi in cui avviene sempre fotosintesi. Sono simili

ai cloroplasti ma non c'entrano un cazzo.

I granuli di riserva di PHB sembrano dei vacuoli visibili al ME e anche al MO perchè visibili come

corpi rifrangenti. Sono circondanti da un monostrato di fosfolipidi.

I granduli di riserva di Volutina sono riserve di fosforo possono essere osservate al ME e MO

perchè se coloro con blu di metilene si vedono perchè sono metacromatici (rosso vivace).

I granuli di zolfo presenti.

Esistono anche inclusione per fonte di azoto chiamate Cianoficine (nei Cianobatteri) formati di

polimeri di aspartato e arginina.

Le vescicole gassose hanno un diamretro di 0.1µ. Se recuperassi due bottiglie riempite di una

sospensione di cianobatteri contententi vescicole, se gli do un colpetto spacco le vescicole e la massa

verde di cianobatteri vanno sul fondo, se no stanno in superficie.

La Spirulina platensis la si trova in farmacia ma alcuni cianobatteri sono tossici perchè producono

tossine nell'amebite acquoso e animali che si abbeverano di quest'acqua avremo problemi epatici,

quindi sono epatotossine.

Nei magnetosomi c'è una sorta di catenella interna (nella slide con l'anfitrico) è il magnetosoma. Ha

una disposizione lungo tt la lunghezza cellulare e mantenuta da proteine del citoscheletro batterico

(che serve per la divisione cellulare e forma).

PROCESSI DI DIFFERENZIAMENTO CELLULARE BATTERICO

Parleremo delle spore, sporificazione (1° esempio del differenziamento cellulare) ma c sono alcuni

cicli cellulari di batteri come Streptomiceti (produttori di antiviotici), Mixococcus ecc che nel corso

della loro vita hanno modificazioni significative nella struttura della cellula.

Una cellula batterica che sporifica può tornare cellula batterica in certe condizioni.

SPORE

Nella slide a MO in contrasto di fase evidenza come la

cellula batterica è scura ma in alcune e in posizione

diversa c sono corpi rifrangenti: sono le spore, in

particolare del genere Bacillus perchè a bastoncino,

gram positivo che sporifica. L'altro genere è il

Clostridium.

Possiamo sottoporre le spore a colorazione specifica perchè le spore hanno diversi involucri che le

proteggono da agenti fisici, chimici, temperatura ecc quindi è difficile colorarle. Si utilizza la

coloazione di Scheffer e Fulton. Abbiamo una sospensione di batteri sporificanti e che faccio?

• fissazione tramite calore

• versiamo sul campione versato un colorante: verde di Malachite.

• scaldiamo (forza l'entrata del verde nella cellula, è il mortensante)

• laviamo con acqua e le cellule non lo trattengono ma le spore si.

• per favorire l'osservazione al MO coloriamo al contrasto utilizzando la safranina (colorante rosso)

per cui le cellule diventano rosse, le spore rimangono verdi.

Vedremo che alcune sono libere, altre rimangono dentro perchè non hanno completato la

sporificazione che si conclude con la lisi della cellula madre e liberazione di spore. Per questo si

chiamano Endospore. Le Esospore hanno funzione di diffusione del batterio.

Lo stimolo per la sporificazione di Bacillus e Clostridium è la carenza di nutrienti che porta alla

liberazione di spore nell'ambiente e c rimangono anche per miglioni di anni. Se non sporifica allora

fa germinazione ritornando battere.

Per sporificare c vogliono 8/10 ore (nel bacillus), per germinare 15 minuti.

In condizioni di nutrimento ottimale la cellula si allunga,

scissione binaria e si moltiplica.

Ma se c'è carenza di nutrienti inizia la sporificazione.

Si allunga ma la formazione del setto che normalmente

ha luogo a metà nella cellula madre, qui è in posizione

apicale.

Prima della formazione del setto il DNA deve duplicarsi.

Una parte rimane nella cellula mentre un altra va nella

prespora.

Poi lo strato di peptidoglicano che forma il setto di divisione si rompe. A qst punto la spora si

invagina e acquista una membrana.

Dopodichè si forma la corteccia che verrà circondata dalla tunica sporale e in alcuni batteri

sporigeni si forma anche l'esosporio. La sintesi di tt qst involucri porta alla maturazione della spora

con lisi della cellula batterica e liberazione della spora nell'ambiente.

Durante la sporificazione avvengono anche altri fenomeni: l'accumulo nel citoplasma della spora di

acido dipicolinico che formerà un sale di calcio che permette di disidratare il citoplasma perchè la

spora resiste al calore. La base d qst resistenza sta nel fatto che la cellula è disidratata. Ma se il

citoplasma è disidratato, gli acidi nucleici e proteine devono esseer protetti dall'acido. Il DNA viene

protetto dalla sintesi di proteine che lo avvolgono per proteggero dai raggi UV.

Quindi la spora resiste al calore, antibiotici, agenti fisici, chimici, raggi UV. Vedrre anche sul libro.

Se la spora si trova in un ambiente ricco di nutrienti va incontro a germinazione che inizia con la

perdita della tunica della corteccia, con degradazione proteine che degradano DNA e acido

dipicolinico. Questo porta alla riformazione della cellula batterica.

Nel peptidoglicano di una spora il NAM invece di avere la catena tetrapeptidica ha una struttura

ciclica formato da acido dipicolinico.

La spora non ha attività metabolica per questo le macromolecole non c sono.

Durante lo sviluppo la cellula batterica può assumere

forme diverse. Le specie coinvolti sono: genere

Callobacter specie crescentus. Questa cellula può

assumere 2 aspetti diversi con funzioni diverse.

Abbiamo la cellula flagellata in un caso oppure ha un

peduncolo spesso chiamato Prosteca. La cellula

flagellata non può duplicarsi ma lo fa solo quando

perde il flagello, forma il peduncolo che serve alla

cellula per ancorarsi a superfici. La cellula

peduncolata si duplica.

Se la cellula è flagellata si potrebbe dire che si trova in G1 della mitosi. Gli eventuali pili vengono

retratti e anche il flagello perdendo la capacità di muoversi. Dallo stesso polo in cui c'era il flagello

inizia la sintesi del peduncolo (inizio fase S con duplicazione cellulare). Quando ha completato la

sintesi del peduncolo, esso permette alla cellula di attaccarsi al substrato. Quando la cellula è alla

fine della divisione cellulare, la nuova cellula risintetizza il flagello e i pili.

Altri esempio di differenziamento cellulare è la

formazione del corpo fruttifero (Mixobatteri). Sono

quelli che si muovono a sciami, a branco di lupi

perchè? perchè muovendosi a sciame, se incontrano

altri batteri, secernono enzimi che lisano altre

cellule degradandoli per accaparrarsi sostanze

nutrienti. Questo quando c sono nutrienti. Se

mancano si differenziano che li porta a sviluppare il

corpo fruttifero. Le singole cellule iniziano a

aggrgarsi l'una all'altra e all'interno d qst

aggregato alcune cellule vengono lisate (soprattuto quelle all'interno) x dare nutrimento a quelle

intorno per sopravvivere.

Il corpo fruttifero libera le mixospore. Se qst spore si trovassero in nutrimento germinano e

riprendono il ciclo vegetativo normale.

I corpi fruttiferi possono essere a cupola o a forma di fiore.

Gli streptomiceti sono chiamati cosi perchè come nei

funghi prevede la formazione del micelio ma la

cellula è procariote. In condizioni ottimali di crescita

producono le ife le quali si ramificano penetrando il

terreno solido sul quale c sono le cellule formando il

micelio vegetativo. Serve per prendere dal terreno i

nutrienti. A un certo punto sviluppano verso la

superficie le Ife aeree che formano il micelio aereo.

Da questo attraverso processi di settazione si

staccano le catenelle di spore le quali se sono in condizoni ottimali germinano e riparte il ciclo.

I cristalli parasporali che abbiamo saltato

all'inzio c sn in alcuni tipi di batteri: solo

genere Bacillus. Quando lo si osserva ha la

struttura cristallina, parasporale xk la sintesi d

sta struttura avviene in parallelo col processo di

sporificazione e osserviamo qst cristallo vicino

alla spora.

Sono formati da una proteina e la funzione d

sto cristallo non se sa. L'ipotesi più accreditata

è che produca una proteine x difendersi ma non

se sa.

L'applicazione pratica d qst proteina prodtta è tossica per larve di insetti come lepidottei, ditteri e

imenotteri.

Solo il 2% degli insetticidi prevede l'ultizzo della proteina come bioinsetticida. Tra qst il 90% utilizza

sta tossina. Proviene dal Bacillus Turingensis. Quando viene sintetuzzata è una pretossina e viene

ingerita dalla larva degli insetti, quando raggiunge il lume intestinale si trova in condizioni in cui il

cristallo viene suddiviso in subunità. Successivamente proteasi intestinali attivano la tossina

nell'inetsino. Attivata riconosce recettori specifific sulla membrana epiteliale delle cellule larvali

formando un canale alterando il trasporto di ioni ecc provocando la disegrazione delle cellule

epitelilali della cellule intestinali larvali.

Ma quando ingoia la spora oltre alla tossina, la spora germina con quindi moltiplicazione della cellula

batterica dando luogo un fenomeno simile alla setticemia. Tra 4/5 ore crepano!! Bastardeee!!!

E' tossico solo per le larve di quegli insetti.

Ricordiamo che la tossina è efficace a un determinato stadio larvale di quegli insetti.

Si possono ottenere piante transgeniche.

Il gene che codifica la tossina è localizzato sui plasmidi quindi molecole circoslri di DNA a doppia

elica che non sono impo per la voitalità della cellula batterica ma possono conferire al battere una

caratteristica fenotipica. Quindi i plasmidi producono la tossina.

MODALITA' DI COLTIVAZIONE DEI MICROORGANISMI

Attraverso la scissione binaria abbiamo la duplicazione della cellula madre in due cellule figlie

sempre diploidi. Si forma il setto di divisione lungo la porzione mediana della cellula madre

precedentemente allungata e il DNA precedentemente replicata, con invaginazione del setto e

separazione della cellula madre ognuno avente DNA.

La cellula usa nutrienti principio che devono essere presenti in un terrento di coltura per crescere.

Di solito si calcolano sul peso secco (ossia senza acqua):

• C: sia in forma organica e inorganica

• O

• N

• H

• P

• S: impo per formazione di aminoacidi (met) e legami disolfuro che garantiscono l'attività di certi

enzimi

• K

• Na

• Mg

• Ca

• Cl

• Fe

• Altri

Il ferro è presente molto poco. Guardare i processi coinvolti per oguno. Tutti gli altri sono in

concentrazioni molto basse perchè svolgono attività di cofattori o costituenti di enzimi e coenzimi.

Non è necessario una quantità definita perchè fungono da residui nei terreni (peptone).

In una cellula batterica abbiamo le proteine (50%) e ogni cellula ne ha 2 milioni e mezzo con oltre

2.000 diverse. Il DNA invece forma il 3% della cellula con molecole di 1-2 per cellula. Ovviamente

sono più di 1 perchè c sono anche i plasmidi oltre il DNA cromosomale.

Un terreno di coltura è l'insieme d tt gli elementi chimici e sostanze che servono alla cellula per

svolgere la sua attività metabolica. E' una quantità equilibrata che permette alla cellula di crescere

in modo ottimale. Se ne metto una quantità inferiore allora la crescita sarà inibita, idem quando ne

metto troppo perchè portare alla cellula di crescere meno bene.

In funzione delle fonti di C e energia che gli archea utilizzano:

• fototrofi usano la luce come energia.

Fotoautotrofi

Foto eterotrofi:

• chemiotrofi usano cme fonti di energia l'ossidazione di composti organici e inorganici.

Chemioautotrofi (o chemiolitotrofi o litografi):

Chemioeterotrofi

• autotrofi che usano la CO2 come fonte di C

• eterotrofi usano la sostanza organica come fonte di C

Sapere un esempio per ognuno. Pagina 96.

Il Fe serve soprattutto per i batteri patogeni perchè devo catturare il Fe disponibile nell'amebite

essendo che il Fe serve per la loro capacità di produrre malattia. Quindi i batteri recuperano

dall'esterno il Fe. Possiamo suddividere quesi batteri in:

• Idrossamati. Esso lega il Fe presente all'esterno e attraverso il legame idrossamato ione ferro3+

all'interno del citoplasma dove lo rilascia e l'idrossamato continua a ciulare Fe all'esterno.

• Siderofori, chimicamente diversa dall'idrossamato, legano anch'esse il Fe3+ e lo trasportano nella

cellula batterica.

Esempio la mozzarella blu era contaminata dal batterio gram- del genere Pseudomonas che produce

un pigmento colorato blu il quale è un sideroforo che lega il Fe.

Le principali fonti necessarie per il terreno di coltura è definito da un'acronimo: CHNOPS ogni

lettera sta per un elemento chimico. La sintesi dei precursoi avviene nel citoplasma e quindi il

battere deve avere modalità di trasporto per catturare nutrienti all'esterno e trasportarli nel

citoplasma. Ma la permeabilità della membrana cellula della cellula batteria varia con la tipologia

della sostanza che deve attraversare. Dipende da parametri:

• velocità di diffusione del substrato che attraversa la MC

• trasporto contro gradiente (attivo e quindi serve E che deriva dall'idrolsi dell'ATP o dalla forze

proton motrice) e secondo gradiente (passivo quindi non serve fonti di E).

Diffusione

Si va secondo gradiente. Le molecole passano

attraveeso la MC e in qst caso si chiama

diffusione semplice. Il soluto nella cellula nel

tempo ma la velocità è bassa. Esiste anche la

diffusione facilitata perchè sono coinvolte

proteine nella membrana esterna (porine) oppure

nella MC (permeasi). Sono alla fine canali che

facilitano l'entrata nella cellula di un certo

substrato secondo gradiente. La velocità di ingresso del substrato è molto più elevata in qst caso.

E' sempre un UNIPORTO.

Nel trasporto primario serve Energia sotto forma di idrolisi dell'ATP come ricordiamo le proteine

ABC. Vengono trasportati zuccheri e aminoacidi. Nel secondario si utilizza la forza proton motrice (H

+ e Na+ generato dal trasporto primario) e di solito è sempre accompagnato dal trasporto di

qualcos'altro. Se siamo nel SIMPORTO il substrato e l'altra molecola trasportata sono nella stessa

direzione, il contrario nell'ANTIPORTO.

Se parliamo di traslocazione di gruppo è del tt diverso dalle altre. Indica che il substrato per

essere durante il suo trasporto attraverso la MC viene modificato chimicamente. Infatti da S quando

entra compare S-Y ossia ha subito una modificazione come l'aggiunta di un gruppo fosfato. Quindi ci

deve ssere una proteina che trasferisce al substrato trasportato il gruppo fosfato: come il sistema

delle FOSFOTRASFERASI. Il substrato trasportato con qst sistema sono molto zuccheri.

Esempi di trasporto attivo

Nell'esempio abbiamo il glucosio e mannosio. C

sono enzimi responsabili del trasferimento del

gruppo fosfato l'uno alltrato fino ad unire il P

al substrato che deve essere trasportato. I

primi enzimi di trasferimento del P sono comuni

in tutti gli organismi. Si parte dal PEP che cede

il fosfato alla enzima E1 diventando acido

piruvico. A sua volta E1 o cede all'enzima Hpr

diventando fosorilato. Fino a qui è comune. Poi

gli enzimi dipendo dallo zucchero trasportato.

Per il glucosio abbiamo che la Hpr lo cede a

EIIa e poi a EIIb e a sua volta a EIIc e poi lo Sistema fosfotransferasico

da al glucosio che entra nel citoplasma

permettendogli il trasporto. Il glucosio serve per glicolisi ecc.

Gli enzimi delle vie glicolitiche sono sintetizzati dalla cellula batteriche anche se manca glucosio

(enzimi costitutivi). La cellula batterica fa enzimi che scindono lattosio a galattosio dal glucosio solo

se il lattosio è presenta (enzimi inducibili).

Il terreno di coltura serve per l'isolamento e l'identificazione per vedere se un certo batterio è

sensibile a certi antibiotici. Esempio prendo una cistite che per colpa di E.Coli dall'intestino sono

passati alle vie urinarie. Fai urinocoltura per vedere se c'è o meno. Sapendo che il batterio si

elimina dando antibiotici ma io devo sapere se il batterio è sensibile o meno così da prescrivere

l'antibiotico che funza perchè se mi da un antibiotico il cui ceppo di E.Coli è resistente allora non

serve a un cazzo. Isolamento perchè devo isolare il ceppo di E.Coli.

Servono anche per l'analisi delle acque e degli alimenti.

Importanti anche per le applicazioni nella microbiologia industriale.

Per queste differenze abbiamo numerosi tipi di terreno, che riflettono le differenze metaboliche dei

diversi microrganismi e lo scopo del ricercatore.

Ricordare che l'attività metabolica del microorganismo è dipendente dalle condizioni di crescita. I

mixotrofi sono i batteri che cambiano il metabolismo. Esempio gli idrogenobatteri se messi in terreno

in cui c'è H e CO2 utilizzano H come fonte di energia ossidandolo (chemiolitotrofi perchè ossidano

sostanza inorganica x ottenere energia) ma se esso viene messo in terreno con sostanze organiche

allora si adatta.

Un terreno può essere liquido o solido: nel solido viene aggiunta una

sostanza solidificante.

Nei terreni liquidi vedo che il batteri sono cresciuti perchè passo da limpido a

opaco. La campanella di duram è una campanella rovesciata di vetro e serve x

capire se un batterio fa gas o meno. Se fa gas allora si forma una bolla

all'apice della campanella di duram rovesciata.

Un terreno solido ha l'agar che è un polisaccaride estratto da alghe marine

avente caratteristiche x usarlo come agente solidificante. Sono rarissimi i

batteri che lo usano come nutriente e non interfersice x un cazzo col batterio. Campanella di

Si scoglie a T° elevate (fino a 80 gradi) e rimane solido per temperature Durham

superiori a 45°C. E' un vantaggio perchè se devo preparare un terreno con un antibiotico, a t°

troppo elevate lo inattivo ma se posso abbassare la T° fino a 48°C allora lo posso fare così lo

mantengo attivo.

Le capsule petri sono in plastica monouso, tonde con un

diametro di 90mm. C'è una base in cui metto il terreno sciolto

che poi solidifica coprendo con un coperchio.

Ci possono essere colture pure con colonie della stessa

dimensione, colore e aspetto e anche colture miste. Capsula Petri

Oltre alle capsula petri abbiamo le slant in cui lasciare la

provetta sulla superficie e lasciato solidificare l'agar che

assume andamento obliquo. Slant

Possiamo distinguerr terreni minimi chimicamente definiti, che conosco esattamente la composizione

del terreno di coltura. Riconosco P, N, C con una fonte di C e una miscela di sali che garantiscono la

presenza degli elementi CHNOPS. Va bene per E.Coli ma anche i cianobatteri che sono fotoautotrofi.

Se un ceppo di E.Coli avesse perso la capacità di sintetizzare aminoacidi come l'Hys non può crescre

in un terreno minimo xk nn fa sintesi proteica e quindi muore. Può crescere solo se do Hys nella

concentrazione corretta. Alcuni ceppi chiamati auxotrofi (ausotrofo) quelli che non sono in grado di

sintetizzare una macromoecola o nutrienti. I prototrofi (prosotrofo) sono quelli che producono tutto.

Nei Lactobacilli essi fermentano solo se c sn diversi nutrienti aggiuntivi. Sono esigenti infatti. In qst

caso quindi siamo nei terreni massimi o chimicamente indefinito in cui abbiamo sia E.Coli sia il

L.Mesenteroide (Lactobaccilo). Possono crescere bene nei massi i Chemioeterotrofi.

Sono selezionati i terreni anche per il loro utilizzo. Abbiamo 3 tipologie:

Tra i selettivi abbiamo il terreno di Sabouraud consente la crescita dei funghi escludendo i batteri.

Le condizioni che determinano qst sono la concentrazione di glucosio molto elevata che inibsce la

crescita batterica e il pH del terreno che è circa 5.5 mentre la maggior parte dei batteri sono

neutrofili.

I terreni selettivo-differenziali sono usati in micro clinica, dei farmaci, gelato ecc. Se sono

differenziali c deve ssere qualcosa che faccia distinguere una colonia d un batterio da un altro.

Infatti contengono indicatori di pH così da colorare a un certo pH e se viene modificato l'indicatore

vira di colore.

Abbiamo l'agar-sangue che differenzia colonie di Streptococchi emolitici da colonie di batteri che

non fanno emolisi ossia gli S. hanno enzimi che degradano l'emoglobina dei globuli rossi e di norma

sono circondate da un alone più chiaro.

Abbiamo il MacConkey-agar è selettivo perchè abbiamo i sali biliari che inibiscono la crescita dei

Gram positivi (S. aureus crepa infatti e non cresce) ed è differenzuale perchè differenza colonie di

batteri che fermentano il lattosio da queli che non lo fanno. Qundi il terreno contiene lattosio e

indicatore di pH chiamato rosso fenolo. La Salmonella su qst terreno appare incolore. Ma se c'è un

ceppo che fermenta il lattosio produciamo acido lattico, varia l'indicatore di pH perchè lo abbasso

andando dal rosso al rosa. Questo accade per l'Enterobacter cloacae.

L'altro è il terreno Mannitol salt agar che contiene NaCl che permette la crescita solo di ceppi di

specie di Staphilococcus e Micrococcus, ma E. coli o B. subtilis no perchè c'è troppo glucosio. Quindi

è selettivo x qst ma diffrrenziale perchè c'è mannitolo e indicatore di pH che è sempre rosso fenolo.

Ceppi appartenenti a S. aureus fermentano il mannitolo producendo acidi che modificano il pH e il

rosso fenolo vira dal rosso al giallo. Le specie di Stafilococco che non fermentano il mannitolo non

producono acidi e quindi il pH non vira (S. epidermidis).

Nel terreno eosin blu di metilene mi permette di sapere gli agenti che danno selettività al terreno.

Sono in grado di inibire la crescita della maggior parte dei batteri gram+. Il differenziale perchè

contengono indicatori di pH che sono sempre eosina e blu di metilene che quindi svolgono una doppia

funzione. La caratteristica che rende il terreno selettivo è il lattosio. Il discorso è analogo al

McConkey-agar.

Sia E. Coli che Enterobacter aerogenes fermentano il lattosio ma l'E.coli molto di più e questo causa

lo sviluppo di E.coli di un colore giallo pallido a differenza di E. aerogenes che hanno un colore

tendente a rosa. La differente capacità di fermentare il lattosio fa si che noi riusciamo a

distinguere colonie di E.coli e E. aerogenes.

Un alimento qualunque sia la destinazione finale, tipologia di consumo ecc prima d essere messo in

commercio deve essere sottoposto a analisi microbiologiche per garantire la qualità dell'alimento. I

patogeni che si vanno a ricercare sono gli stessi che causano patologia nell'individuo.

Una terza tipologia di terreno è il terreno di arricchimento. E' fatto in modo tale che m permetta

partendo da una popolazione mista di riuscire a isolare il batterio con caratteristiche che

interessano a me. Esempio il batterio che degrada la cellulosa o la lignina (raro perchè soprattutto i

funghi degradano la lignina). Mettiamo il caso che in un campione di terra abbiamo batteri che

degradano fenolo (disinfettanti più potenti causa di ustioni se usato così come è) oppure benzene,

toluene (tt composti chimici tossici e inquinanti per l'ambiente). Devo aumentare nel campione di

suolo prelevato il n° do batteri che degradano il fenolo. Quindi devo far sviluppare e proliferare i

batteri offrendo loro nutrienti adatti.

Allora noi abbiamo recuperato per esempio un campione di acqua e vogliamo isolare un micro che

degrada una certa sostanza. Possiamo inoculare il campione in soluzione fisiologica perchè essendo

NaCl al 9x1000 e permette alle cellule batteriche di vivere in un ambiente isotonico. Poi possiamo

procedere con degli strisci di terreno o piastramenti e in qst terreno abbiamo aggiunto oltre al C ed

energia anche la sostanza che permette al batterio di degradarla. Ovviamente ora abbiamo pochi

batteri ma almeno così seleziono quelli che mi interessano. Oppure posso adottare un altra

strategia: se è vero che il suolo ha una elevata concentrazione di batteri possiamo utilizzare un

terreno massimo. Dato che qui la fonte di C ed energia è nel terreno tt i batteri crescono. Tra le

colonie cresciute dobbiamo cercare quella colonia che vogliamo noi ossia preparo poi un terreno

avente il fenolo come unica fonte di C, quindi trasferire le colonie sul nuovo terreno. Ma dato che è

un lavoro enorme quindi meglio usare il terreno arricchimento. Insomma ricordare una sostanza

xenobiotica per la quale pochi batteri lo sanno usare come fonte di C.

Ieri abbiamo visto i mixotrofi (nell'esempio

idrogenobatteri). Se li voglio isolare so che essi

ossidano l'H per ottenre energia e lo fanno se c'è

O2. Quindi ovviamente do CO2 e H2 così isolo gli

idrogenobatteri.

A seconda dei batteri che usano l'NH4+ o NO2

posso isolare certi batteri come Nitrosomonas o

Nitrobacter. Se voglio isolare un cianobatterio

azotofissatore uso un terreno dove non c'è una

fonte organica di C, non c'è azoto e c'è luce. Essi fissano l'N2. Questo mi facilita l'isolamento di un

campione di acqua per esempio in cui ci sono cianobatteri.

Se invece la fonte è il solfato di ammonio possono isolare sia cianobatteri sia alghe eucariotiche.

Oppure prendendo un campione ricco di H2S mi permette di isolare solfobatteri verdi fotosintetici

anossigenici ossia non producono O2 in seguito alla fotolisi dell'acqua ma utilizzano al posto

dell'acqua l'H2S.

Se io volessi isolare i Lactobacilli essi sono molto esigenti dal punto di vista nutritivo quindi non

userò mai un terreno minimo perchè devo aggiungere tt i fattori di crescita come a.a, purine,

pirimidine, nucleotidi ecc.

Se voglio isoalre un batterio che degrada la cellulosa l'unica fonte di C che gli devo dare è appunto

la cellulosa. Solo che essa non è molto solubile in acqua gli do della carta da filtro. Ci vorrà più

tempo ma alla fine riesco a isolare il gruppo di batteri chiamati Citofagi che degradano la cellulosa.

Oppure prendo un campione di suolo farlo crescere sul terreno massimo quindi tutte le colonie

crescono. Ma invece che trasferirle tt aggiungo la Carbossi metil cellulosa e anche un colorante

chiamato Congored e il terreno diventaa bello rosso. Prendo il mio suolo, diluisco opportunamente,

inoculo e incubo sulle piastre. Si svilupperà un alone arancione intorno a quei batteri che usano la

cellulosa. Ecco che in una popolazione mista posso vedere subito quelli inteerssati da me.

La caseina è la proteina del latte quindi se c metto una proteasi si degrada. Le proteasi si utilizzano

nelle polveri che si utilizzano nelle lavatrici. Se volessi isolare un batterio che degrada la caseina ci

metto latte in polvere e inizialmente è opaco. Diluisco poi bene, incubo e vedo come le colonie si

sviluppano. Se la colonia produce proteasi attacca la caseina e la idrolizza e quindi da opaco diventa

lucido intorno alla colonia che produce proteasi: questa è la CHIARIFICAZIONE DEL TERRENO.

Per capire quale amminoacido non viene prodotto da un batterio auxotrofo. Preparo 20 piastre

ciascuna con un a.a diverso e strisco il ceppo che avevo su ognuna e ovviamente il ceppo cresce

sulla piastra in cui c'era un'a.a che lui non era capace di sintetizzare. Per controllare che tt erano

vivi faccio crescere il batterio su un terreno massimo così ne sono sicuro che sia vivo e che sia

crescuto (CONTROLLO DI MARCATORI DEL CEPPO BATTERICO). Se quel ceppo è ausotrofo x un

aminoacido troverò scritto esempio Hys- per indiciare l'incapacità del microorganismo di

sintetizzarlo oppure se fosse resistente all'antiobiotico è la sigla esempio la Ampicillina (beta-

lattante) scritto Amp^R per indicare che è Resistente.

Preparazione di un terreno di coltura (LB il quale è massimo in cui crescono tt i batteri eterotrofi).

Si vede subito che è massimo perchè ho lievito e triptone oltre che NaCl, H2O e agar.

Sterilizzare vuol dire eliminare tt che sia cellula o nutriente. Per eseere sicura che i risultati che

ottenfo studiando quel batterio devono essere retribuiti a quel batterio.

L'agar standard va aggiunto dai 15-18 g per litro ma n lacuni casi va aggiunto un terzo di agar (5-6

g per litro) come l'agar molle nell'antibiogramma.

Ovvio che prima d inserirlo nella capsula petri devono far abbassare la T° e me ne accorgo quando

prendo in mano la bottiglia e riesco a tenerla in mano (48-50° C). A qst punto inoculo le piastre.

Faccio la flambatura del collo della bottiglia con il becco Bunsen perchè quando apro possono uscire

delel sostanze tossiche prodotte dai batteri e così le ammazzo. Poi apro il coperchio della capsula, ci

inoculo il terreno e richiudo subito. Una capsula petri tiene circa 20 ml di terreno. Se non devo

aggiungere nnt al terreno posso anche non stare li a calcolare bene 20 ml (infatti vedo che il

terreno più o meno ricopre tt il diametro della cspsula) ma se devo inserire un a.a esempio 25 mg

allora devo calcolare bene i 20 ml di terreno.

METODI PER STUDIARE I MICRORGANISMI

STRISCI BATTERICI, COLTURA PURA E CRESCITA SU PIASTRA

Crescita su Piastra

La crescita su piastra risulta particolarmente utile nei casi in cui sia necessario disporre di una

coltura pura. Abbiamo:

• Piastramento per diffusione. Abbiamo preparato il terreno solido. Preleviamo con una pipetta un

campione di terreno e lo semino su un idoneo punto della capsula (al centro). Posso seminare al

massimo 0.1 ml. Diffondere il campione utilizzando le spatole per piastrare formate da anse di

vetro che venivano utilizzate più volte sterilizzando ogni volta mettendogli dentro a un becher

pieno di alcol e poi sopra a una fiamma. Da qst fiamma evaporato l'alcol però brucio i batteri

perchè è incandescente quindi aspetto che si raffredda. La deposito sul bordo del terreno e se il

terreno friggeva allora direi che non ci siamo. Aspetto quindi fino a che poi è ok e vado a

distribuire mettere il terreno.

• Strisci batterici. Invece che seminare per diffusione strisciamo utilizzando un ansa (bastonicino di

plastica avente un cerchietto alla fine). Il diametro del cerchietto mi permette di preleveare 10

microlitro o 1 microlitro. Ovviamente non devo bucare il terreno. Faccio più strisci perchè

l'obiettivo è qll d isolare colonie singole. Effettuo prima cosa lo striscio 1. Poi predno una nuova

ansa e tocco lo striscio precedente e rifaccio la stessa cosa con striscio 2. Idem poi ancora una

volta con striscio 3. Nell'1 ho la crescita continua o a patina in cui non distinguiamo colonie perchè

sono troppo numerose ma man mano che striscio è come se diluisco la coltura (la quantità di

crescita batterica) e nel 3 posso vedere le singole colonie.

Non è sufficiente però per capire di cosa si tratta.

Nello S. aureus sono rotonde, dimensione piccolina, bordo lineare, sono di un colore giallo .

• Piastramento per inclusione

Abbiamo detto che la maggior parte dei batteri fanno scissione binaria. La maggior parte perchè gli

Streptomiceti producono micelio vegetativo e micelio aereo con liberazione delle spore.

Oppure in certi batteri sono presenti strutture come beociti con liberazione di spore.

Nella spirulina abbiamo tricomi che possiedono circa 100 di cellule. In certe occasioni il tricoma si

frammenta.

Nei lieviti abbiamo la gemmazione come i lieviti (microrganismo unicellulare eucariote).

Nella crescita microbica abbiamo diversi fattori che la determinano: aumento dimensioni sia aumento

del n° di cellule. Posso misurarle determinando 2 parametri:

• massa cellulare

• concentrazione cellulare

Esistono metodi diretti che c permettono di determinare la concentrazione cellulare (conta

microscopica, conta vitale in piastra e determinazione del numero più probabile di cellule MPN quidni

è metodo statistico).

Posso usare metodi indiretti collegati all'attività metabolica del batterio. Esempio il batterio deve

crescere in presenza di O2. Oppure misurare la quantità di proteine presente in un certo volume

della coltura, se aumenta nel tempo significa che i batteri stanno crescendo.

Misura della massa cellulare intesa come misurazione della torbidità del campione

Utilizza lo spettro fotometro oppure il colorimetro. Abbiamo nel primo la fonte luminosa in cui raggi

di luce incidente colpiscono un aliquota del cmapione messa in una cuvetta. Maggiore sono le cellule

nel campione maggiore è la quantità di luce che viene assorbita dal campione e maggiore è la

torbidità. La trasmittanza T quindi è il rapporto della luce emessa Ie / luce che colpisce le cellule

del campione Ii quindi misura la luce che passa il campion. Ciò che si misura è l'Assorbanza ossia la

quantita di luce che viene assorbita calcolata come -logT= logIi/Ie. E' chiatama anche Densità ottica.

L'A aumenta man mano che la coltura cresce sempre di più. Le lunghezza d'onda per calcolare la

presenza di un battere sono 540-660 nm.

Conta al microscopio o totale

Vengono usati vetrini come le camere di Burker. Il vetrino ha una griglia formato da quadritini,

rettangoli ecc. Inoltre lo spazio tra il reticolo e il vetrino copri oggetti è di 0.02 mm (1/50 mm). Il

rticolo ha 25 quadrati ognuno avente un area di 1 mm^2 e un volume di 0.02 mm^3. Questi sono

vetrini usati per contare batteri.

Di norma inoculo la coltura batterica di lato tra il vetrino e il copri ogegtto. Prendo il vetrino e vado

al MO contando le cellule che c sono nei quadratini. Se ammettiamo che in ogni quadrato c siano 28

batteri per esempio quindi se ho 25 quadrati avro 28 x 25 quadrati. Poi la camera è profonda 0.02

mm e quindi 1/50 e quindi moltipilco x 50 se voglio sapere il n° di batteri mm^2. Poi moltiplico per

10^3 per sapere il volume. L'unità di misura sono cellule per cm^3 (mL). Si utilizza molto per

contare le cellule di lievito.

Conta vitale

Presuppone terreni di crescita. Il campione se è

molto concentrato (10^9 cellule per mL) ma io so che

su una capsula di petri standard contiene 0.1 mL (per

diffusione). Quindi devo procedere diluendo il

campione e seminando diluzioni del campione. Man

mano che diluisco diminuisce il n° di colonie e questo

m permette x contare in modo preciso il n° di colonie.

Utilizzo soluzione fisiologica, semino.

Il punto di partenza sono il n° di colonie che conto.

Se sono troppe non posso contarle, se no le conto. Se

ho seminato la diluzione 10^-3 ho 159 colonie, se

10^-4 conto 17 colonie (dovrebbero essere 15,9

quindi ci sta). Questi valori sono ottenuti diluendo la coltura 1000 volte e quindi moltiplico le colone

159 per 1000 per capire quanti CFU (unità formanti colonie) per mL.

Se sono 17 faccio 17 per 10.000 dato che ho diluito di 10.000.

Mettiamo che semino 0.1 ml per diffusione, se vogliamo avere la concentrazione della coltura di

partenza per ml moltiplico 159 x 10^3 x 10 (così riporto la concentrazione cellulare per ml). Questo

perchè 0.1 è un decimo di 1 quindi moltiplico per 10.

Metodo delle membrane filtranti (metodo diretto)

Questo metodo è utile per la conta di microrganismi in campioni liquidi (limpidi) contenteti un numero

molto basso di microrganismi (es. acque

potabili).

Consiste nella filtrazione di un volume noto di

campione attraverso una membrana filtrante di

acetato di nitrocellulosa (con pori di diametro

0.2 µm). Questa misura è precisa xk le cellule

batteriche di norma hanno dimensioni superiori

a 0.2 µm. Dopo la filtrazione la membrana è

posto sulla superficie di un terreno agarizzato.

La piastra viene incubata (se voglio

determinare la carica batterica totale presente

su quella piastra) a 37°C per il tempo necessaria per la crescita.

Quindi i batteri (spore comprese) rimangono adesi alla superficie e passerà acqua e virus.

Per essere accettate microbiologicamente devon avere una certa carica batterica e i limiti sono

definiti da una apposita normativa.

Nella foto il metodo è da museo, oggi si utilizzano le caffettiere. La membrana e imbuto sono sulla

beuta già fissati, gia sterilizzati, e poi si butta tutto alla fine.

Se io prendessi dell'acqua di piscina devo tenerla a 4°C xk se permetto che il campione raggiunga i

37 gradi potrebbe darmi una falsa interpretazione della carica batterica totale e fare l'analisi entro

24-48 h se no iau!

Ci sono altri modi per verificare se in un campione c sono microrganismi e avere una idea di quanti

microscopia a fluorescenza.

ce ne sono! Utilizziamo il Il colorante è il DAPI che conferisce alle

cellule batteriche una colorazione azzurra. E' un colorante specifico perchè esso interagisce con gli

acidi nucleici. Utilizzando qst tecnica non devo stare li a coltivarle perchè mette in evidenza la

presenza di una cellula (viva o morta).

La tecnica FISH

Ogni cellula batterica ha un suo genoma e tra ogni

genoma di batteri diversi abbiamo il core che è comune

a tt i batteri contente proteine che stanno alla base di

processi comuni tra tt le cellule. Ma ci sono poi sequenza

geniche caratteristiche d un certo batterio: esempio

l'rRNA 16s avente regioni costanti (presenti in molti

batteri) e regioni variabili (che distinguono un genere

batterico da un altro che sia lievito, fungo ecc). Se io

utilizzo regioni variabili come sonde ossia prendo qsr frammetno d RNA e lo marco con colorante. Poi

prendo il campione in cui c'è quel battere e quella sonda andrà a riconoscere la sequenza

corrispondente del genoma della cellula presente appaiandosi e ibridandosi con sta sequenza.

Sfrutta il principio di complementarietà del DNA.

Si utilizzano nella ecologia microbica.

Ovviamente io posso nello stesso campione usare un altra sonda specifica per un altro batterio

marcata con un altro colorante e allora vedrò due colori ossia la presenza di due batteri. Esempio.

Con qst tecnica però non evidenzia se le cellule evidenziate sono morte o vive. Per saperlo utilizzo

allora 2 coloranti: rosso e verde. Quello rosso penetra nella cellula batterica presente in ql campione

ma penetra nelle cellule morte, mentre quello verde non colora le cellule perchè non riesce a

entrarci ma se non entra vuol dire che l'integrità della membrana è salva quindi sono cellule vive.

Quindi i coloranti attraversano la membrana citoplasmatica a seconda della integrità della membrana

cellulare.

Curva di crescita esponenziale

Mettiamo che un batterio si replichi ogni 30 minuti.

E' chiaramente una modalità di sviluppo esponenziale.

Ad ogni replicazione aumenta il n° di cellule nel

tempo e posso esprimerlo come 2^n. Esempio dopo 3

mezz'ore avrò 2^3 cellule ossia 8 cellule.

Su un grafico posso esprimerla in cui sulle x metto il

tempo, sulle ordinate il n° di cellule.

Per sapere come costruirla che inoculo, prelievo e faccio un conteggio vitale e conto quante colonie

si sviluppano in 30 minuti. Passati poi altri 30 minuti prelievo ancora e conteggio ancora e riporto i

dati sul grafico. In un certo periodo di tempo sufficientemente lungo vedo che la crescita batterica

è esponenziale.

Dato che in poco tempo ho troppe cellule conviene usare una scala semilogaritmica, considerando su

scala logaritmica le y.

Se è vero che è esponenziale, posos esprimere la crescita batterica nel tempo con qst formula:

N=N0 x 2^n.

N (numero totale di cellule dopo un certo periodo di crescita) = N0 (numero iniziale di cellule che

avevo nella coltura) x 2^n (n è numero di generazioni al tempo t).

Posso esprimerlo in logaritmi decimali:

logN=logN0 + nlog2

Risolvendo per n ottengo: n=(logN-logN0)/log2 (0.301)

Il tempo di generazione dipende dal batterio xk è influenzato dalle condizioni di crescita. E.coli in

condizioni ottimali di crescita si moltiplica ogni 30 minuti ma il Microbacterium lepre ogni 7 giorni, il

microbacterium tuberculosis ogni 24h.

Tempo di generazione

Conoscendo n e t, cioè il tempo (ore e minuti) di crescita esponenziale, è quindi possibile conoscere

t/n cioè il tempo di generazione g: g=t/n (in h)

Un altro indice facilmente calcolabile è rappresentato da k, ossia la costante della velocità di

crescita, misura del n° di generazioni per unità di tempo in una coltura in crescita esponenziale:

k=n/t (in h-1)

K è valida quando la coltutsa è in fase esponenziale di crescita ossia quando è in condizioni ottimali

di crescita.

Inserisco un valore (2 x 10^4) e il punto in cui si è raddoppiato. Tiro due rette parallele

orizzontalmente fino a incontrare la retta che ho costruito prima, poi le tiro parallele verticalmente

fino a raggiungere l'asse delle x. Il tratto compreso (<----->) rappresenta il tempo di generazione.

L'immagine ha una retta e sembra che la coltuta sia in continua crescita esponenziale ma in realtà

in una beuta la fase di crescita non può essere mantenuta all'infinito perchè i nutrienti finiscono.

Allora meglio rappresentarla così: SAPERE DISEGNARLA E TUTTE LE FASI

Abbiamo 4 fasi:

• fase lag o di latenza: il n° di cellule rimane costante perchè ho inoculato il batterio in un terreno

e esso si deve adattarsi a quelle condizioni. Insomma se un Prototrofo (qll che fa tt da solo) se lo

mettiamo in un terreno minimo deve avere il tempo per attivare tt gli enzimi per formare

proteine ecc. E.coli invece cresce a 37°C ma il terreno di coltura è a 4°C quindi il batterio ha uno

shock termico quindi devo aspettare che il terreno raggiunga 37°C (termostato) e così l'E.coli

cresce. Se il batterio non deve adattarsi perchè è gia nelle condizioni ideali allora la fase lag

scompare

• fase esponenziale (logaritmica): il tempo di generazione è massimo perchè il batterio è nelle

condizioni ottimali x la crescita. Durante qst fase se aumenta la concenteazione cellulare

diminuisce la concentrazione di nutrienti, inoltre aumentano la concentrazione degli scarti

metabolici che alterano il pH di crescita. Da ora ha inizio la seguente fase

• Fase stazionaria: non aumenta nel tempo il n° di cellule perchè quelle morte e qll replicate è più

o meno uguale. Gli antibiotici sono attivi sulla cellula batterica solo quando la cellula è in fase

esponenziale (solo perchè nella stazionaria ce ne vogliono troppi). Qst perchè l'antibiotico colpisce

la sintesi delle proteine e in esponenziale è massima. In qst fase il B. subtilis esso innesca il

processo di sporificazione oppure alcuni antibiotici. Il turingiensis produce il cristallo parasporale.

• Fase di morte: non c sono più i nutrienti e quindi le cellule lisano e muoiono.

Potremmo costruire un altro grafico in cui sulle x metto la densità ottica e sulle y il n° delle cellule

vive.

Curva diauxica

Prima fase di crescita, poi fase stazionaria e poi

ancora fase esponenziale. E' tipica di batteri come E.

coli inoculati in un terreno in cui c sono 2 zuccheri

diversi (glucosio e lattosio). Gli enzimi sintetizzati

dalla cellula anche quando non c'è glucosio si

chiamano costitutivi, invece altri sono quelli

sintetizzati dalla cellula batterica ma solo se c'è il

lattosio.

Quando la coltura entra in fase stazionaria la

presenza del lattosio induce la trascrizione dei geni

che codificano per proteine che scindono il lattosio.

Per indurre i geni è necessario un certo intervallo di tempo affinche i geni siano trascritti e

tradotti. Quindi non è una fase stazionaria ma una fase di latenza o lag perchè la cellula si sta

adattando alle condizioni.

La blu indica che nella prima fase di crescita (nella rossa) è nulla la presenza dell'enzima ß-

galattosidasi, non serve perchè il battere usa il glucosio. Quando è finito allora la cellula inizia a

formare sto enzima perchè il glucosio è finito. Quindi il lattosio viene scisso e quindi la coltura ha a

disposizione di nuovo il glucosio e la fase di crescita esponenziale riparte.

Crescita in coltura continua

Una coltura continua è un sistema APERTO in cui il terreno fresco è continuamente aggiunto ad un

tasso costante, mentre il terreno vecchio (esausto perchè non c sono più nutrienti) è eliminato. Non

si può fare manualmente ma si utilizzano chemostati e turbidostati. I due sistemi hanno lo stesso

obiettivo ma l'immissione di terreno fresco si basa su

principi diversi. Si utilizzano apparecchi del genere:

nella immagine c'è un chemostato. Con una tempistica

regolata viene introdotto nel fermentatore terreno

fresco (e insieme aria sterile e altri gas). La valvola

regola la velcità del flusso di entrata. C'è anche una

uscita che mi permette di recuperare terreno esausto e

cellule. Il terreno fresco contiene tt i nutrienti ma un

nutriente essenzuale per la crescita è presente in

quantità limitante. Il tasso di crescita è determinato

dalla velocità di flusso del terreno fresco (sistema di controllo ESTERNO).

Nel turbidostato presenta un sisema che

raccoglie terreno e cellule avente una

fotocellula che legge la torbidità del brodo

di coltura è tarata su un valore allora si

apre la valvola prendendo una certa

quantità di terreno.

I parametri che influenzano la crescita

sono T°, ossigeno, pH, concentrazione

salina, se il batterio vive in un ambiente

acquoso allora la P dell'acqua, se il

batterio è fotosintetico la lunghezza

d'onda con la quale viene esposta la

coltura. Per ognuno d qst fattori possiamo

suddividere i batteri. I batteri e archea

colonizzano tt gli ambienti.

Per la T°, vediamo 5 tipologie di crescita

diverse. Nel grafico abbiamo le temperature cardinali ossia la temperatura minima al di sotto della

quale il batterio non si duplica più, quella ottimale in cui il t di generazione è ottimale, massima al

di sopra della quale il batterio non si moltiplica. Al di sopra della temperatura massima la morte è

rapida. Mentre dalla ottimale alla minim l'andamento è meno immediato xk la membrana è gelificata.

Le T° minime sono T° alle quali possiamo conservare i ceppi batterici perchè non tt le cellule

muoiono ma se le congelo a -80° ecc possono conservare i ceppi così che tra 1 anno lo riprendo e

cresce. Mentre se siamo sopra la temperatura ottimale allora non posso più farlo perchè la

temperatura influenza l'attività enzimatica e quindi la denaturazione delle proteine. Ma la T° agisce

sulla fludiità della membrana citoplasmatica.

Se alla coltuta prima di congelarma aggiungiamo un agente che protegga le membrane cellulari

(come il glicerolo) allora possiamo conservare il ceppo, basta aggiungere l'esatta concentrazione di

gliceorlo e congelarla velocemente perchè la procedura comporta una ceerta % di mortalità. Ma se

congeliamo in azoto liquido, le molecole d'acqua formano cristalli piccoli e quindi i danni alle cellule

sono minimi; se congelo lentamente i crsitalli sono grandi e rompono tutto.

Quindi o li lascio in azoto liquido oppure bagno e poi li conservo a -80°C ma non sono eterni ma

ogni anno almeno devo scongelarli e rifare il tutto.

La liofilizzazione è un processo che liofilizza le colture così da tenere le colture x anni. Il

congelamento ha il limite della sporificazione.

La tubercolosi è una patologia che insorge nei bovini anche ma la specie batterica è micobatterium

bovis, nell'uomo è tubercolosis. I ricercatori lo conservavno continuando a strisciare la coltura su

piastre fresche ma inoculandolo nell'animale il batterio non provocava più la tubercolosi perchè nel

genoma erano andate perse tt le regioni contenenti geni coinvolte nella patogenesi perchè in qll

condizioni non serve che producano geni patogeni e continuando a spatolare si sono andate perse.

Ma se ha la capacità di continuare a stimolare il sistema immunitario è un buon vaccino e da qui si

scopri il vaccino: BCG ossia Bacillus (forma a bastoncino) carmet-C egheren-G che sono i ricercatori

e la specie si chiama batterio attenuato perchè non è patogeno.

• Abbiamo nella immagine blu batteri in cui l'optinum di T° è 4°C si chiamano Psicrofili. L'Hysteria

monocitogenes contamina un alimento perchè si moltiplica bene a 4°C e se l'alimento è

contaminato, ingerisco anche questo batterio, il quale da una patologia simile alla meningite. Come

si impedisce la sua moltiplicazione se lo colonizza? Uso i batteriofagi che ammazzzaaa tutto!! Il

batteriofago non dovrebbe provocare nessun danno alle cellule.

• I verdi sono mesofili con T° ottimale a 37-39°C e sono tt i patogeni umani.

• i termofili in giallo hanno una T° ottimale di 60°C. Il bacillus stearothermophilus viene utilizzato

alla base di un test che dimostra la presenza o assenza di antibiotici nel latte (causa la mucca

che ha la mastite) oppure per dimostrare che il processo di sterilizzazione ha funzionato. Per

sterilizzazare si usa l'autoclave a 120°C per 20 minuti uccide batteri e spore. Ma x essere sicuro

che abbia fatto bene il suo lavoro aggiungo all'inizio una provetta d sto bacillus e faccio partire

l'autoclave. Al termine prendo la provetta, rovescio il campione in un terreno di coltura e se il

giorno dopo il terreno è limpido allora ha avuto buon fine.

• nel rosso l'ipertermofilo: thermococcus con T° ottimale di 88°

• nel viola l'ipertermofilo come il Pyrolobus fumarili con T° ottimale di 108°C.

• In qst gruppo c sono anche gli archea termoacidofili ossia crescono a t° elevate in presenza di pH

acido.

FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA

1 FATTORE: TEMPERATURA

Un vantaggio è che si può lavorare con una loro

proteina anche a T° ambiente

Nella PCR l'enzima fondamentale è la DNA

polimerasi ma viene chiamati TAQ (un termofilo).

Quando non erano ancora scoperti si usava l'E. coli

Ma nel Micobacterium tubercolosis hanno una % di

G+C del 75% ma cresce bene lo stesso

I metanogeni svolgono la produzione di metano. Alcuni sono termofili e contengono nel citoplasma

elevate concentrazioni del difosfoglicerato che impedisce la depurinazione.

La DNA girasi è coinvolta nel superavvolgimento del DNA ed è diversa da qll che si trova nei batteri

mesofili.

Orologio evolutivo molto lento: la selezione

Questi sono gli appunti tenuti dalla Prof.ssa Edda De Rossi. Sono sempre presi con cura in minimo dettaglio con iPad!!
Gli argomenti di questa parte sono:
- Introduzione
- Caratteristiche cellule batteriche & Archea
- Appendici filiformi
- Processi di Differenziamento cellulare batterico
- Modalità di coltivazione dei microorganismi
- Metodi per studiare i microorganismi
- Fattori che influenzano la crescita batterica
- Controllo crescita microbica
- Metabolismo batterico (Fermentazione, Respirazione anaerobia, Ossidazioni aerobie, Produzione di energia a partire da composti alternativi)
- Fotosintesi anaerobia e Colonna di Winogradsky