Appunti microbiologia

Lezione 1: replicazione del DNA nei batteri

I procarioti adottano la più semplice tra le modalità di riproduzione, ossia la scissione binaria, anche se alcuni possono riprodursi per gemmazione (come lieviti) o anche attraverso spore riproduttive. A differenza dei procarioti, non si ha la presenza di un vero e proprio apparato mitotico (centrioli, fuso etc.). Il processo di scissione binaria si svolge in tappe successive:

• Estensione della parete cellulare ed allungamento della cellula con sintesi di nuovo materiale citoplasmatico;
• Duplicazione del cromosoma batterico, ancorato alla membrana citoplasmatica;
• Progressiva formazione di un setto trasversale di separazione che trae origine dalla membrana cellulare;
• Completamento del processo con formazione del setto di parete cellulare e definitiva separazione delle due cellule.

Durante la gemmazione si forma lateralmente una piccola protuberanza alla cellula, detta gemma, che in un secondo momento si stacca; al contrario della scissione la cellula genitrice si conserva, e la gemma è in genere più piccola di essa. Si può definire come un'estroflessione che cresce dopo essersi staccata.

Duplicazione del cromosoma batterico

Il cromosoma batterico è ancorato alla membrana citoplasmatica; la duplicazione comporta quindi anche quella del sito di attacco. Con l’allontanamento progressivo dei due siti, i cromosomi si troveranno dislocati in ciascuna delle due cellule figlie. La forma circolare del DNA comporta una maggiore difficoltà nello srotolamento e riarrotolamento; la compattazione del materiale genetico è opera dell’enzima topoisomerasi II.

La duplicazione del DNA inizia quindi con la sua despiralizzazione a partire da un punto chiamato ORI (origine) che possiede una specifica sequenza riconosciuta dall’enzima DnaA. Poiché il cromosoma ha forma circolare, le forcelle di replicazione procedono in direzioni opposte fino ad incontrarsi alla fine del processo. L’enzima che opera il processo di duplicazione è la DNA polimerasi III (formata da 10 proteine):

• Lavora su entrambi gli strand (2 core su uno e 1 sull’altro);
• È guidata da una proteina pinza;
• Svolge attività di sintesi e controllo degli errori (proofreading);
• Necessita di un primer, di un filamento stampo e di nucleotidi liberi.

N.B. la sintesi è realizzata dal replisoma (insieme di proteine) in direzione 5’-3’; Al termine della duplicazione avviene la citochinesi tramite Z ring (anello di actina).

Replisoma

Include:

• Elicasi: svolge i due filamenti del DNA;
• Topoisomerasi: cambia la struttura del DNA, taglia un filamento in un punto, dissipa l’energia della rotazione, guida il successivo compattamento;
• ssDNA ligasi: mantiene i filamenti separati;
• Primasi: sintetizza un frammento di RNA (10 nucleotidi) come primer;
• DNA polimerasi III: sintetizza i due filamenti copia (da 5’ a 3’) con attività di proofreading;
• Rnasi H: degrada i primer di RNA;
• DNA polimerasi I: degrada i primer e ripara i gap lasciati dalla rimozione dei primer;
• DNA ligasi: unisce i frammenti di Okazaki.

N.B. si ha sintesi in continuo su un filamento e discontinua sul secondo.

Meccanismo di duplicazione

Elicasi svolge DNA e il filamento in ritardo è ricoperto da proteine SSB. Quando una certa quantità di materiale genetico è stata svolta, la primasi sintetizza un primer di RNA; la sintesi inizia. La sintesi del filamento in ritardo è discontinua e forma frammenti di Okazaki; questi vengono poi uniti dall’enzima ligasi. Alla fine del processo, il replisoma aggiunge il sito TER (terminazione) ed interviene la proteina Tus che blocca la sintesi.

Lezione 2: espressione genetica nei batteri

Un gene è l'unione di sequenze genomiche che codificano per un set coerente di prodotti funzionali (proteine, rRNA o tRNA) potenzialmente sovrapponibili. L’informazione genetica di un gene (DNA) è trascritta in mRNA, il quale è tradotto in una proteina.

Trascrizione di un gene batterico

Gli aspetti principali della trascrizione di un gene sono:

• La sintesi va da 5’ a 3’ utilizzando un filamento stampo;
• La sintesi è simile a quella del DNA ma è svolta da un enzima chiamato RNA polimerasi DNA dipendente;
• Sono presenti segnali di inizio (promotore) e fine (terminazione) che non sono situati nell’mRNA;
• mRNA (inizia dalla base +1) contiene regioni regolatrici non tradotte come sequenza leader e trailer;

Sequenza codificante inizia con un codone start (AUG) e termina con uno codone stop (UAA, UAG, UGA).

Trascrizione di un operone

Si definisce operone un insieme di geni che vengono regolati in modo strettamente coordinato. L'organizzazione dei geni in operoni è un elemento fondamentale nella regolazione genica dei procarioti: gli operoni contengono infatti, oltre ai geni che devono essere trascritti, sequenze particolari, denominate siti di controllo, che con vari meccanismi regolano l'espressione dei geni dell'intero operone. Geni che codificano per proteine coinvolte in un unico processo sono spesso codificate da sequenze poligeniche (RNA policistronico); questa unità trascrizionale è quindi detta operone. Per quanto riguarda la trascrizione di rRNA e tRNA avviene normalmente, ma si ha una modificazione post-trascrizionale con cui le molecole maturano.

Trascrizione di un gene

Questa è catalizzata dall’enzima RNA polimerasi (oloenzima), che trascrive tutti i geni. La trascrizione è determinata da un'altra proteina chiamata fattore sigma, che si lega al promotore dei geni e regola la trascrizione (fattore di trascrizione).

Promotore di un gene batterico

Il promotore è una regione di DNA costituita da specifiche sequenze dette consenso, alla quale si lega la RNA polimerasi per iniziare la trascrizione di un gene, o di più geni (operone); sono costituiti da DNA a doppia elica, si trovano generalmente a monte del gene di cui iniziano la trascrizione e sono lunghi circa 200 bp. L'RNA polimerasi riconosce il DNA a doppia elica e si lega ad esso, anche se soltanto un'elica verrà utilizzata come stampo per la trascrizione. I promotori più efficienti sono chiamati promotori forti, dove per forza di un promotore s'intende il numero di trascritti a cui esso può dare inizio in un dato tempo. I promotori sono costituiti da sequenze nucleotidiche di basi intervallate da corte sequenze che funzionano come moduli di controllo per l'espressione genica. Sono proprio questi moduli a caratterizzare i promotori: vi sono quelli costitutivi, i cui elementi di controllo possono legarsi ubiquitariamente a fattori di trascrizione differenti (geni housekeeping), e quelli che rispondono a fattori specifici che ne regolano l'espressione genica.

Nei procarioti il promotore si compone di tre parti:

• Un sito di inizio (quasi sempre una purina);
• Una sequenza che si trova a -10 (rispetto al sito di inizio della trascrizione indicato con +1), formata da sei paia di basi (con funzioni analoghe alla TATA box eucariotica e sequenza TATAAT);
• Una sequenza a -35 (sempre rispetto al sito di inizio della trascrizione) contenente sei paia di basi con sequenza TTGACA.

Il fattore sigma dell’RNA polimerasi riconosce la zona -35 del promotore e favorisce l’assemblaggio dell’oloenzima in posizione corretta sul DNA; dopodiché, assieme ad altre subunità, riconosce la regione -10 ed apre la molecola di DNA. Inizia quindi la sintesi dell’RNA e si forma una “bolla trascrizionale” contenente l’ibrido temporaneo RNA-DNA. L’enzima scorre quindi sul DNA nella fase così detta di allungamento e il fattore sigma si dissocia per interagire con altre RNA polimerasi. La sintesi è simile a quella del DNA (5’-3’) e, utilizzando il filamento come stampo, sono aggiunti nucleotidi AUGC. L’mRNA a singolo filamento così prodotto viene rilasciato e il DNA riforma via-via la struttura a doppia elica.

Terminazione della trascrizione

Terminazione intrinseca

Il terminatore consiste in una ripetizione invertita (conformazione a forcina) seguita da una sequenza di 6 residui di uridina nella regione trailer al 3’:

• La regione “U-rich” provoca una pausa nella trascrizione;
• Si forma la regione a forcina che destabilizza l’RNA;
• La sequenza “U-rich” non riesce a mantenere stabile il complesso DNA-RNA;
• RNA polimerasi si dissocia.

N.B. il processo non è regolato da fattori di terminazione ma è dovuto solo alla struttura dell’RNA.

Terminazione dipendente dal fattore RHO

La terminazione è causata da una proteina RHO:

• RHO si lega all’RNA riconoscendo il sito “rut” (RHO utilization site);
• RHO scorre sull’RNA consumando ATP;
• RNA polimerasi va incontro alla fase di pausa in corrispondenza del sito “RHO-dependent pause site” nella regione trailer 3’;
• RHO raggiunge RNA polimerasi e grazie all’attività elicasica svolge l’ibrido DNA-RNA;
• RNA polimerasi si dissocia.

Sintesi proteica nei batteri

La traduzione e il codice genetico: La traduzione è la decodifica dell’RNA in proteina; l’mRNA è letto a triplette (ogni tripletta è detta codone) in direzione 5’-3’. Ogni codone codifica per un determinato amminoacido in base al codice genetico.

N.B. il codice genetico è un codice degenerato e universale (la III base è meno importante). Anche se esistono 61 codoni diversi, è sufficiente un numero inferiore di tRNA (20 amminoacidi). La traduzione è svolta dai ribosomi in direzione 5’-3’, sintesi da N- a C-terminale. Ciascun mRNA è tradotto da più ribosomi (poliribosoma) in tutti gli organismi. Inoltre, solo nei procarioti, la traduzione è simultanea alla trascrizione.

Attivazione degli amminoacidi

L’attivazione consiste nel legame dell’amminoacido al suo corrispondente tRNA. Il tRNA ha una struttura 2D a trifoglio e 3D a L; possiede una sequenza molto conservata (termina con CCA) eccetto il braccio variabile. L’enzima amminoacil tRNA sintetasi lega l’amminoacido al suo corrispondente tRNA:

• Esistono 20 diverse amminoacil sintetasi, una per ogni amminoacido;
• Alta specificità, perché il ribosoma legge il codone e non l’amminoacido;
• Produce un legame ad alta energia, la quale verrà usata nella sintesi proteica.

La sintesi proteica

La sintesi proteica è svolta dai ribosomi (complessi formati da proteine ed rRNA); i ribosomi batterici sono formati da due subunità 30S e 50S. Il ribosoma riconosce l’mRNA legandosi al “ribosomal binding site”.

Le fasi della sintesi proteica sono: inizio, allungamento e terminazione.

Inizio

Nei batteri la sintesi inizia con un amminoacido modificato (N-formilmetionina) che è utilizzabile solo per lo start; poco dopo la sintesi il gruppo formile viene rimosso. La subunità 30S riconosce il sito di inizio (Shine-Delgarno), e si ha il corretto posizionamento in prossimità del sito di start (AUG); contemporaneamente si lega il fMet-tRNA. Al complesso si lega la subunità 50S per formare il complesso attivo, che possiede il tRNA in posizione P. Il processo è regolato da tre initiation factors.

Allungamento

Esso si divide a sua volta in 3 fasi:

• Legame dell’amminoacil-tRNA,
• Reazione di transpeptidazione,
• Traslocazione.

Il ribosoma possiede 3 siti: EPA:

• P: occupato da fMet-tRNA (oppure peptidil-tRNA);
• A: libero per accettare il nuovo amminoacil-tRNA;
• E: sito di rilascio del tRNA.

Avviene così la reazione di transpeptidazione grazie all’attività peptidiltransferica dell’rRNA 23S che sfrutta il legame ad alta energia AA-tRNA. Nella fase di traslocazione, invece, il peptidil-tRNA si sposta dal sito A al sito P, il ribosoma scorre di un codone, il tRNA passa dal sito E e viene poi rilasciato.

Terminazione

La terminazione si verifica quando il ribosoma incontra i codoni di stop (UAA, UAG, UGA); la peptidil transferasi idrolizza il legame tra peptidil e tRNA consumando GTP. Si libera quindi il peptide e il tRNA, agiscono 3 fattori di terminazione e il ribosoma si dissocia.

Maturazione e secrezione delle proteine nei batteri

Splicing delle proteine

Processo comune a tutti gli organismi viventi; si parla di cis-splicing quando avviene sulla stessa proteina e trans-splicing quando si ha l’unione di due proteine distinte. Consiste nella rimozione di una porzione di proteina (130-600 amminoacidi) e fusione di due porzioni della stessa sequenza proteica (cis) o di due sequenze (trans).

Folding delle proteine (chaperonine)

Il protein folding è il processo di ripiegamento molecolare attraverso il quale le proteine ottengono la loro struttura tridimensionale. Il ripiegamento avviene sia contemporaneamente alla sintesi proteica che alla fine di questa. Soltanto una volta terminato il ripiegamento le proteine possono assumere la loro funzione fisiologica. Il processo può essere descritto come un auto-assemblamento intramolecolare dove la proteina è guidata ad assumere una specifica forma attraverso interazioni non covalenti, come legami ad idrogeno, coordinazione di metalli, forze idrofobiche, forze di van der Waals etc.

Le chaperonine sono proteine che:

• Aiutano il ripiegamento corretto delle proteine (processo co-traduzionale);
• Correggono ripiegamenti errati (processo post-traduzionale);
• Evitano l’aggregazione di proteine.

La prima chaperonina ad agire è “trigger factor” (TF), che maschera zone idrofobiche ed evita l’aggregazione. Questo processo è sufficiente per la maggior parte delle proteine. Successivamente agiscono “DnaJ (HSP40) e DnaK (HSP70)”, che utilizzano ATP per ripiegare la maggior parte delle proteine sulle quali TF non è sufficiente. Infine, agiscono GroEL e GroES che intervengono solo in casi particolari con consumo di ATP.

N.B. le chaperonine sono maggiormente prodotte in condizioni di stress.

Traslocazione e secrezione delle proteine

Le cellule interagiscono con l’esterno e alcune proteine vengono secrete (pili, flagelli, enzimi litici, tossine, etc.). Solo 1/3 delle proteine rimane nel citoplasma.

N.B. secrezione = ambiente esterno / traslocazione = membrana o periplasma.

Esistono diversi sistemi per la secrezione/traslocazione delle proteine, alcuni comuni a tutti gli organismi, alcuni specifici per i Gram -. Superata la membrana, le proteine secrete possono essere liberate da zone porose del peptidoglicano o rimanere adese al peptidoglicano.

Meccanismi comuni a Gram- e Gram+

• Sistema Sec: comune a tutti gli organismi viventi; trasporta proteine non ripiegate attraverso la membrana; può avvenire prima o dopo la traduzione; il peptide segnale all’N-terminale viene riconosciuto da SecA; la proteina è spinta attraverso il poro (SecYEG) usando ATP; il peptide segnale viene rimosso da una peptidiasi e la proteina si ripiega.
• Sistema Tat: trasporta proteine ripiegate; le proteine devono avere due arginine nel peptide segnale; nei Gram- le proteine sono passate al sistema di tipo II o V.
• Sistema tipo I: comune a Gram- e +; fa parte della famiglia dei trasportatori ABC; nei Gram+: trasportatore transmembrana, proteine di fusione nello spazio periplasmatico; nei Gram-: trasportatore intermembrana, proteine di fusione nello spazio periplasmatico, struttura sulla membrana esterna.
• Sistema tipo VI: comune a Gram+ (solo per DNA) e Gram- (DNA e proteine); trasporta proteine ma anche DNA (coniugazione batterica tramite pili sessuali).

Meccanismi Gram-

• Tipo II e V portano all’esterno proteine traslocate da Tat e Sec;
• Tipo I, III e VI sono indipendenti da Sec;
• Tipo IV lavora sia tramite Sec che in maniera dipendente;
• Tipo III, V e VI iniettano fattori di virulenza nell’ospite;
• Tipo III e VI funzionano solo se c’è contatto e riconoscimento dell’ospite.