Appunti di Microbiologia generale

CRESCITA MICROBICA

Per le enormi differenze riscontrabili tra i microrganismi, in microbiologia il termine "crescita" può essere rivolto sia ai singoli individui che compongono una popolazione sia alla popolazione microbica nel suo insieme.

Per i batteri: aumento numero di individui (cellule)

Per i microrganismi pluricellulari: aumento numero di cellule che compongono lo stesso individuo, aumento numero di individui (es. germinazione delle spore)

La crescita rappresenta uno strumento fondamentale per poter studiare i microrganismi.

Le cellule batteriche si riproducono secondo una modalità che prende il nome di SCISSIONE BINARIA.

Da una CELLULA MADRE si ottengono DUE CELLULE FIGLIE.

FASE DI LAG (O FASE DI LATENZA)

• Nessun aumento della popolazione
• I microrganismi sintetizzano parti della cellula ed enzimi
• I microrganismi si adattano al nuovo ambiente
• Variabile in durata
• In alcuni casi può essere molto breve o addirittura assente

• La popolazione aumenta alla massima intensità
• La popolazione si raddoppia ad intervalli regolari (tempo di generazione)
• Il terreno di coltura diventa torbido
• Le colonie appaiono su terreno solido

• Molti microrganismi muoiono
• Il numero di cellule morte è pari a quelle nuove
• I nutrienti scarseggiano
• Si formano le sostanze di rifiuto (metaboliti)
• La curva di crescita si appiattisce

• Scarsità di nutrienti
• Limitata disponibilità d'ossigeno
• Accumulo di metaboliti tossici
• Raggiungimento della densità critica

popolazione34FASE DI MORTE

• I microrganismi muoiono rapidamente
• Le capsule o le superfici patinose potrebbero proteggere le cellule dall'ambiente
• Potrebbero formarsi le spore

Misura della crescita MICROBICA

• Misurazione della massa cellulare
• Misurazione del numero di cellule
• Determinazione peso secco
• Conta al m.o. con la camera di Petroff-Hausser, Thoma, Petroff, Hauser, ecc.
• Conta vitale su substrato solido di un costituente cellulare (N o C) mediante piastramento e determinazione delle UFC
• Conta vitale su substrato liquido (MPN) Metodo di membrana filtrante
• Turbidimetria (misurazione della torbidità mediante spettrofotometro)

Misurazione della massa cellulare

• Peso secco - Tecnica lunga e non molto sensibile
• Quantità di un particolare costituente cellulare - Per esempio proteina, DNA, o ATP - Utile se la quantità di sostanza nella cellula è costante
• Misure turbidometriche

– Veloci, semplici e sensibili

Misurazione della torbidità mediante spettrofotometro

Si determina l’assorbanza È una misura relativa

Non è adatta con sospensioni con meno di 107 cellule/ml

Non è adatta con cellule che crescono in ammassi

È necessario calcolare la relazione tra D.O.e concentrazione batterica (curve di riferimento).

Camere di conta

• Semplici, economiche e rapide
• Utili nella conta sia di cellule procariotiche che eucariotiche
• Non riescono a distinguere fra cellule vive e morte

Camera di Conta di Petroff-Hausser

Camera di Burker

La cella o camera di Burker è costituita da un particolare vetrino dove su questo è inciso uno speciale reticolo che ci consente di contare direttamente il numero di cellule. Questo speciale reticolo è costituito da un grande quadrato (chiamato di primo ordine) che a sua volta è suddiviso in 9 quadrati (detti di secondo ordine). I nove quadrati di secondo ordine

Sono divisi in 16 quadratini di terzo ordine. Avremo quindi in un reticolo 144 quadratini di terzo ordine. Saranno 10 di questi, scelti in modo casuale, che andremo a testare per la conta. Contati i 10 quadratini si fa la media aritmetica fra questi, e considerando che il volume di un quadratino di terzo ordine è 250.000 volte più piccolo di 1 ml, basterà moltiplicare per 250.000 per ottenere il numero di cellule di lievito presenti in 1 ml di prodotto.

Apparecchi di conta elettronici:

• La sospensione microbica viene fatta passare attraverso un piccolo orifizio
• Il movimento dei microrganismi attraverso l'orifizio impatta una corrente elettrica che fluisce attraverso l'orifizio 36
• È quantificata l'interruzione della corrente
• Non riescono a distinguere fra cellule vive e morte
• Facili e rapidi da usare
• Utili per la maggior parte dei microrganismi ma non per i procarioti

Metodo di piastramento:

• Misura del numero

delle cellule vitali

• L'entità della popolazione è espressa come unità formante colonia (UFC)
• Semplice e sensibile
• Ampiamente utilizzato per la conta vitale negli alimenti, nell'acqua e nel terreno
• Risultati inesatti se le cellule crescono confluenti

Guardare dimostrazione ppt 10 slide 9

Metodo diluizione

Conta vitale su substrato liquido (MPN)

Realizzando diluizioni successive di un campione, esisterà almeno una diluizione in cui solo alcune aliquotedella diluizione contengono microrganismi. Di conseguenza, inoculando più tubi, solo alcuni daranno luogoa crescita, mentre per le diluizioni precedenti tutti i tubi di substrato inoculati con un'aliquota delladiluizione daranno luogo a crescita, e per le successive tutti i tubi saranno sterili. Utilizzando il numero ditubi positivi in tre diluizioni successive è possibile risalire, mediante tabelle statistiche, al numero piùprobabile di microrganismi

per ml o g di campione.

Metodo delle membrane filtranti

Utile specialmente per analizzare campioni acquosi, DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique)37

Il liquido contenente i microrganismi viene filtrato su una membrana, che trattiene le cellule • colorando con colorante fluorescente e osservando in epifluorescenza è possibile distinguere cellule vive e morte, che assumono colori diversi.

L’ influenza dei fattori ambientali sulla crescita batterica

La disponibilità di nutrienti non è l’unico parametro a influire sulle possibilità e sui ritmi di crescita dei microrganismi: ci sono molti altri fattori importanti chimici, fisici e biologici da considerare per poter comprendere, prevedere o controllare le attività microbiche nell’ambiente.

Fattori ecofisiologici che influenzano lo sviluppo microbico negli alimenti

La crescita microbica è influenzata da un gran numero di fattori di natura fisica, chimica e biologica. Sono in generale:

Antimicrobici naturali, come ad esempio oli essenziali, tannini, glicosidi e resine nei vegetali, lattoperossidasi nel latte bovino, lisozima nelle uova. Altri potrebbero formarsi in seguito ai trattamenti tecnologici.

Range di pH di crescita dei microrganismi

I microrganismi hanno valori di pH minimi, massimi e ottimali di crescita.

Generalizzando si possono indicare i seguenti range di pH per i vari gruppi di microrganismi, anche se singole specie possono differire in maniera significativa nei loro valori minimi di pH di crescita.

Il pH è uno dei fattori che hanno maggiore impatto sullo sviluppo microbico. Oltre al pH è utile conoscere, però, anche il grado di dissociazione degli acidi organici presenti. Lo stress acido è l'effetto combinato di bassi valori di pH e di acidi organici deboli. Gli acidi forti (come HCl e acido fosforico) si dissociano completamente. Gli acidi deboli (come acido lattico o acido acetico) restano in equilibrio con la

formadissociata e non dissociata Il grado di dissociazione dipende dal pH dell'ambiente: A pH acido l'equilibrio si sposta verso la forma indissociata che essendo solubile nei lipidi entra facilmente all'interno della cellula dove grazie al suo pH neutro viene dissociata determinando l'abbassamento del pH e la denaturazione delle proteine e degli acidi nucleici con conseguente morte della cellula.

L'attività dell'acqua Per crescere e svolgere le proprie attività metaboliche, i microrganismi hanno bisogno di acqua. In un alimento la quantità totale di acqua (umidità) è presente sia in forma libera (utilizzabile dai microrganismi) che legata a componenti dell'alimento stesso. L'acqua può essere non disponibile per i microrganismi perché:

• contiene soluti disciolti come sali o zuccheri
• è cristallizzata sotto forma di ghiaccio
• è presente come acqua di

idratazione è assorbita sulle superfici

Dunque, solo l'acqua libera presente in un ambiente consente la crescita dei microrganismi.

I valori di Aw sono compresi tra 0 e 1 ppt 11 slide 6

microrganismi osmotolleranti 39

I microrganismi osmotolleranti sintetizzano o concentrano soluti organici che non danneggino i processi biochimici interni. Si tratta in genere di zuccheri (saccarosio, mannitolo, glicerolo) o aminoacidi (prolina) e derivati (betaina) e vengono definiti "soluti compatibili". La concentrazione intracellulare dei soluti compatibili richiama acqua all'interno della cellula. In molti altri casi i soluti vengono accumulati trasportandoli dall'ambiente contro gradienti di concentrazione anche molto elevati (saccarosio, trealosio, glutammato, glicina betaina, prolina, carnitina).

Concentrazione salina

Classificazione di Kushner 3 gradi:

• DEBOLMENTE alofili 2-5 % NaCl
• MODERATAMENTE alofili 5-20 % NaCl
• ESTREMAMENTE alofili >20 % NaCl