Appunti di Microbiologia generale

Microbiologia generale

Storia

Aristotele (384-322 a.C.) pensava che gli animali potessero originarsi spontaneamente dalle piante e dal terreno e fino al XVII secolo si pensava che gli organismi viventi potessero generarsi spontaneamente dalla materia in decomposizione. Nel 1745 il naturalista inglese John Needham condusse una serie di esperimenti che dettero nuovo vigore alla tesi dell’abiogenesi. Egli scaldò vari liquidi nutritivi come il brodo di pollo o gli infusi d'erbe coi quali riempì alcune provette che poi tappò con della garza. Ebbene, nonostante tutti gli accorgimenti adottati affinché non entrasse nulla nelle provette che contenevano le soluzioni nutritive rese sterili dal calore, dopo alcuni giorni si poteva notare che queste pullulavano di organismi viventi. I risultati dei suoi esperimenti lo convinsero che la generazione spontanea era effettivamente possibile.

Spallanzani (1729-1799) introduce la pratica della sterilizzazione dei terreni e nel 1799 attacca la teoria della abiogenesi, perfezionando l’esperimento di Needham. Louis Pasteur (1822-1895) mise fine alla diatriba dimostrando con l’uso dei recipienti con collo di cigno che i microrganismi vengono dall’aria.

A Nicolas Appert (1749-1841) si deve l'invenzione del metodo per la conservazione ermetica dei cibi. Dopo anni di sperimentazioni, mise a punto un moderno metodo per la conservazione dei cibi tramite le bottiglie con chiusura ermetica, che avvolte in una tela venivano portate a temperatura elevata in modo da distruggere i microorganismi contaminanti.

Bartolomeo Bizio (1791 – 1862), chimico italiano, nel 1819 scoprì che la causa del fenomeno della colorazione rossa della polenta è un batterio che battezza Serratia marcescens. Sulla scia di questi risultati, continua gli studi sui molluschi e scopre che la colorazione verde assunta dai molluschi in putrefazione è dovuta alla reazione tra l'ammoniaca e i sali di rame presenti in alcune parti dei molluschi.

Principali caratteri dei microrganismi

• Caratteri morfologici.
• Caratteri colturali.
• Caratteri metabolici.
• Caratteri di composizione chimica.
• Caratteri antigenici.
• Caratteri genetici.

I batteri: principali morfologie cellulari

• Sfere: essi prendono il nome di cocchi. La divisione in un solo piano produce catene di cellule di varia lunghezza (iplococchi, streptococchi). In alcuni casi si possono alternare anche due o tre piani di divisione (tetradi e foglietti di cellule, sarcine (pacchetti di 8 cellule), stafilococchi (grappolo irregolare)).
• Bastoncelli o bacilli: più comunemente osservabile tra i procarioti, le estremità possono essere arrotondate, appuntite, squadrate, rigonfie o ramificate.
• Spirali: è una forma meno comune tra i batteri. Una cellula spiraliforma molto corta è detta vibrione, batteri spiraliformi più lunghi e rigidi sono chiamati spirilli, batteri spiraliformi lunghi e flessibili capaci di modificare la loro forma durante il movimento sono chiamati spirochete, a ciambella, elicoidali (Helicobacter). Le variazioni sulla forma sono molteplici.

Confronto tra cellula procariotica ed eucariotica

Tabella slide 10 ppt 3

Riproduzione nei procarioti

A scissione binaria: slide 11 ppt 3

Riproduzione negli eucarioti

Gemmazione – spore sessuali: slide 11 ppt 3

Rappresentazione schematica di una cellula batterica tipica

Cellula procariotica

L’interno della cellula è costituito dal citoplasma. A differenza di quello eucariotico, il citoplasma dei procarioti è privo di organuli racchiusi da membrana.

Il nucleoide

• La principale differenza tra procarioti ed eucarioti è data dall’organizzazione del loro materiale genetico.
• A differenza di quello eucariotico, il DNA procariotico è disperso nel citoplasma. La regione in cui si addensa il DNA è chiamata “nucleoide” o “regione nucleare”.
• Nella maggior parte dei casi i batteri hanno un solo cromosoma circolare. Le dimensioni del cromosoma batterico possono variare: da 0,58 mgb a 10 mgb. Nella maggior parte dei batteri (anche E. coli) è di circa 4 mgb.

Plasmidi

• I plasmidi sono di solito costituiti da porzioni di DNA a doppia elica, che posseggono le proprietà di un piccolo cromosoma (possibilità di replicarsi).
• Sono da 1/20 a 1/100 della dimensione di un cromosoma. Contengono da 50 a 100 geni.
• Le informazioni che veicolano non sono essenziali per la sopravvivenza della cellula ma possono conferire un vantaggio selettivo in particolari condizioni.

Coniugazione

Coniugazione = trasferimento genico unidirezionale mediato da plasmide che richiede un contatto “fisico” tra due cellule batteriche:

• Pilo sessuale (Gram-negativi)
• Ferormoni (Gram-positivi): il rilascio di ferormoni da parte della cellula “accettrice” (femminile) induce produzione della sostanza aggregante sulla superficie della cellula “donatrice” (maschile) con formazione di aggregati cellulari con trasferimento del plasmide.

Significato della coniugazione

• Significato clinico:
  • Principale meccanismo di trasferimento di geni per l’antibiotico-resistenza.
  • Trasferimento di geni codificanti per fattori di virulenza (enterotossine, adesine, siderofori).
• Significato ambientale:
  • Trasferimento di resistenza a erbicidi ed idrocarburi aromatici.
  • Resistenza batterica ai metalli pesanti.
  • Trasferimento di geni per la fissazione dell’azoto.
• Significato evoluzionistico:
  • Principale meccanismo evolutivo/adattativo batterico.

Plasmidi

• Alcuni plasmidi possono integrarsi nel cromosoma (in tal caso prendono il nome di episomi e, in queste condizioni, non si replicano più in modo autonomo, ma in sincronia con il cromosoma stesso).
• Un episoma può separarsi dal cromosoma e tornare a replicarsi autonomamente sotto forma di plasmide.

Citoplasma della cellula procariotica

• Mancano i mitocondri, i cloroplasti, ed un sistema vacuolare.
• Sono presenti ribosomi e granuli di varia natura, costituiti da sostanze di riserva.

Nel citoplasma di alcuni procarioti possono essere presenti inclusioni di diversa natura: inclusioni di materiale di riserva, vescicole gassose, magnetosomi, carbossiomi. L’accumulo di sostanze di riserva è un fenomeno molto diffuso, alcune sono molto comuni: glicogeno, amido, poli beta idrossibutirrato (PHB), polifosfati. Altre presenti solo in alcune specie e correlate con metabolismi particolari (zolfo, nitrati).

Inclusioni citoplasmatiche: ribosomi

• I ribosomi sono particelle citoplasmatiche che intervengono nella sintesi proteica.
• Sono composti dal 60% in RNA e dal 40% in proteine.
• Presentano una costante di sedimentazione di 70S.

Membrana citoplasmatica (composizione chimica)

• I lipidi e le proteine sono nella proporzione di 1:5 e costituiscono il 10-26% del peso secco batterico.
• La struttura è costituita da un doppio strato di fosfolipidi, da catene di acidi grassi, orientate in modo perpendicolare al piano della membrana, e da due strati esterni di proteine globulari.

Le membrane negli Archea

Le catene lipidiche sono generalmente costituite da unità ripetute di un idrocarburo ramificato, l’isoprene.

Parete cellulare (composizione chimica e funzione)

• È composta da: acidi teicoici e peptidoglicano (Gram positivi); peptidoglicano e membrana esterna costituita da lipopolisaccaridi, lipidi e proteine (Gram negativi).
• Possiede una struttura rigida che conferisce una forma alla cellula e la protegge dai fattori esterni.

Struttura del peptidoglicano

La parte rigida di una cellula batterica è una struttura polimerica chiamata peptidoglicano mureina, o mucoproteina. I peptidoglicani sono polimeri molto grandi, formati da tre tipi di unità costitutive: N-acetiglucosamina (NAG), acido N-acetil-muramico (NAM) legati da un forte legame β-1,4 ed un peptide costituito da 4 o 5 aminoacidi (D-alanina, L-alanina, acido Dglutamico e lisina o, in alternativa, acido diaminopimelico (DAP).

La colorazione di Gram

Strutture di superficie

Capsula e strato mucoso (glicocalice)

• Alcuni batteri sintetizzano polimeri organici che vengono deposti all’esterno della parete sotto forma di uno strato più o meno lasso. Sono di natura polisaccaridica e in qualche caso proteica o glicoproteica.
• Capsula: strato più compatto aderente alla parete.
• Strato mucoso: strato poco denso facilmente rimovibile.

Funzioni

• Benché non siano necessarie per la crescita e la replicazione in colture di laboratorio, conferiscono un notevole vantaggio nell’habitat naturale.
• Proteggono i batteri da: fagocitosi, essicazione, virus batterici e numerose sostanze tossiche.
• Favoriscono l’attecchimento a superfici solide in ambiente acquatico o alle superfici dell’ospite (batteri patogeni).

Flagelli

• Consentono la mobilità cellulare. Caratterizzano i batteri e li fanno distinguere in monotrichi, anfitrichi, lofotrichi e peritrichi.
• I flagelli sono formati da tre parti: struttura basale, filamento ed uncino.
• Il filamento è costituito dalla proteina flagellina avvolta a spirale intorno ad un nucleo centrale cavo.

Struttura dei flagelli nei Gram positivi

Struttura dei flagelli nei Gram negativi

Movimento flagellare

• Movimento rotatorio che si origina dal corpo basale che funzionerebbe come un motore (proteine Mot). Altre proteine (Fli) fungono da invertitori, ribaltando la rotazione del flagello in risposta a segnali intracellulari. Risultato: avanzamento in linea retta + capovolgimento.
• L’energia richiesta per la rotazione dei flagelli proviene dalla forza proton-motrice.
• La velocità di rotazione varia a seconda della specie e dell’energia proton-motrice ed è compresa tra 200 e 1000 giri al sec.
• Velocità di avanzamento: 0,00017 km/h; 60 lunghezze cellulari/sec. (ghepardo: 110 km/h; 25 lunghezze/sec.)
• Il movimento dei microrganismi con flagelli polari o lofotrichi è diverso da quello dei microrganismi con flagelli peritrichi.

La chemiotassi nei batteri

Capacità dei batteri flagellati di avvicinarsi o allontanarsi da particolari sostanze chimiche.

Chemiotassi positiva

Chemiotassi negativa

Il fenomeno della chemiotassi può essere messo in evidenza con il metodo dei capillari.

Chemiotassi

Il movimento del flagello, normalmente, è casuale. In presenza di un gradiente di concentrazione di particolari nutrienti, il movimento della cellula batterica può mostrare dei fenomeni di chemiotassi, che dirigono la cellula verso la zona in cui la concentrazione di nutrienti è ottimale, risposta ad agenti chemiotattici. Viceversa, nel caso di sostanze tossiche, i batteri si portano nella zona di minor concentrazione, risposta ad agenti chemiorepellenti.

La membrana citoplasmatica di un batterio mobile contiene dei chemiorecettori chiamati Proteine di Chemiotassi Leganti Gruppi Metilici (MCP), dotate di un recettore di membrana e di un modulo localizzato nella superficie interna che comunica con le proteine citoplasmatiche, le quali, infine, legano proteine di legame periplasmiche ad alta affinità. Le MCP subiscono cambiamenti nel loro grado di metilazione in seguito allo stimolo chemiotattico.

L’endospora

La formazione di endospora che normalmente non avviene durante la crescita vegetativa di un batterio sporigeno è dovuta ad un complesso processo di differenziamento che inizia quando la popolazione si trova in carenza di nutrienti, e sfavorevoli condizioni di temperatura, radiazioni, valori estremi di pH.

Il processo porta alla sintesi, dentro la maggior parte delle cellule vegetative, di un nuovo tipo di cellula con diversa ultrastruttura, composizione chimica e proprietà fisiologiche. I generi batterici Bacillus e Clostridium sono quelli maggiormente studiati in quanto produttori di spore.

Fasi della sporificazione

1. Alla fine della crescita esponenziale ciascuna cellula contiene due corpi nucleari; questi si riuniscono per formare un filamento assiale di cromatina, primo segnale dell’inizio della sporulazione.
2. Nelle vicinanze di un polo si forma un setto trasverso che separa il DNA e il citoplasma della cellula più piccola dal resto del contenuto cellulare (prespora).
3. Comincia a svilupparsi la corteccia tra le 2 membrane che delimitano la prespora.
4. Si forma all’esterno delle membrane la tunica sporale.
5. La spora in via di maturazione comincia ad essere rifrangente.
6. Comparsa della resistenza al calore (assorbimento da parte della cellula in sporificazione di ioni Ca²⁺ e sintesi di grandi quantità di acido dipicolinico).

Composizione chimica della spora

• Nelle spore mature il rapporto molare tra acido dipicolinico e Ca²⁺ si approssima all’unità, ciò suggerisce che il dipicolinato sia presente come calcio chelato. Questo complesso rappresenta il 10-15% del peso secco della spora ed è localizzato all’interno del protoplasto della spora.
• La corteccia è composta in prevalenza da un caratteristico peptidoglicano che contiene tra dimeri ripetuti di N-acetilglucosammina ed acido muramico.
• La tunica esterna (30-60% del peso secco della spora) è composta in prevalenza da proteine con contenuto insolitamente alto di cisteina ed aminoacidi idrofobi.

Attivazione delle endospore

• Le endospore di recente formazione rimangono dormienti anche quando vengono poste in condizioni ottimali per la germinazione.
• Lo stato di quiescenza può essere interrotto mediante l’attivazione.
• Il meccanismo forse più generalizzato per attivare le spore è lo shock da calore: esposizione a temperature elevate ma subletali. L’attivazione con il calore è reversibile.

Induttore

Stimolo traumatico (shock termico)

Fattori di germinazione

• L-alanina, Aspargina, glucosio, fruttosio, Ca++, Mn++

Germinazione delle spore

• Il processo è molto rapido e si esprime mediante la perdita della rifrangenza e della resistenza al calore.
• L’attività metabolica viene sbloccata; perdita di circa il 30% di peso secco dovuta all’escrezione di materiale solubile composto prevalentemente da calcio-dipicolinato e da frammenti di peptidoglicano.
• La corteccia è distrutta e rimane solo la parete esterna della spora.
• Può essere ottenuta anche con trattamenti meccanici che erodono o spezzano il rivestimento delle spore.

Esocrescita delle endospore

• All’inizio si osserva il rigonfiamento della spora all’interno dei suoi rivestimenti.
• Rapida sintesi della parete della cellula vegetativa, il cui strato di base è presente attorno al protoplasto della spora al momento della germinazione.
• Dalla parete della spora emerge quindi la cellula vegetativa neoformata che si allunga e continua l’accrescimento sino ad iniziare la prima divisione vegetativa.

Struttura cellula eucariotica

Il genoma degli eucarioti

• Nella maggior parte dei casi hanno un genoma molto più grande dei procarioti.
• Possiedono DNA non codificante.
• I cromosomi sono lineari.
• Il genoma degli eucarioti presenta telomeri alle estremità di ciascun cromosoma lineare. Queste sequenze evitano i danni causati dalla perdita di nucleotidi che, a ogni duplicazione, si verifica all’estremità della molecola di DNA.

Molti elementi extra-cromosomali possono essere presenti:

• (i) plasmidi 2 μm, DNA a doppio filamento circolare. Questi elementi posso essere presenti in un numero elevato di copie e sono utili per la costruzione di vettori nella tecnologia del DNA ricombinante. Nessuna funzione è stata ancora attribuita ai 4 geni presenti.
• (ii) RNA a doppio filamento e DNA lineare, presenti nei ceppi killer. Essi codificano per la produzione di tossine, letali per i ceppi non-killer.
• (iii) DNA mitocondriale.

Parete cellulare di lievito

• Spessore 100-200 nm.
• 15-25% della massa secca.
• La composizione è distintiva delle specie.

Composizione 80-90% polisaccaridi (glucani e mannani anche ramificati) organizzati in un network di microfibrille. 2-4% chitina (polimero di N-acetilglucosammina). La chitina è presente in % maggiori nei lieviti filamentosi (Candida albicans) mentre in altre specie è del tutto assente. In Saccharomyces cerevisiae la chitina svolge diverse funzioni: i) recettore di tossine killer, ii) mantenimento dell’integrità osmotica e morfologica, iii) maggior costituente delle cicatrici di gemmazione.

• Le mannoproteine rappresentano la parte superficiale della parete. Esse presentano dei legami crociati mediati da interazioni idrofobiche e/o da ponti disolfuro. Le mannoproteine sono inoltre legate alle microfibrille di glucano mediante legami covalenti.
• La composizione della parete di lievito (S. cerevisiae) influenza le caratteristiche di flocculazione e flottazione dei diversi ceppi utilizzati nelle fermentazioni alcoliche. Sulla base di questa caratteristica i lieviti si dividono in bottom yeast e top yeast.
• La flocculazione è legata alle glicoproteine di superficie e alla carica elettrostatica superficiale.
• La flottazione è legata alle caratteristiche di idrofobicità di superficie, in particolare alla capacità di intrappolare la CO₂.

Parete cellulare nelle muffe

• Spessore 100-200 nm.
• 15-25% della massa secca.
• La composizione è distintiva delle specie.

Composizione: Hanno una spessa parete cellulare formata da chitina (75%), talvolta cellulosa e occasionalmente entrambi, e proteine/lipidi (25%).

I virus

Sono parassiti intracellulari obbligati submicroscopici – elementi genetici (DNA o RNA) capaci di moltiplicarsi all’interno di una cellula e di uscire, adeguatamente vestiti, dalla cellula in cui si sono formati.