Appunti di Microbiologia generale

Principi base della microbiologia

La microbiologia è lo studio dei microorganismi. I microorganismi sono organismi microscopici, includendo anche i virus. Possono essere sia entità cellulari che non in grado di eseguire i loro processi vitali indipendentemente dalle altre cellule (questo le differenzia dalle cellule animali e vegetali, che non possono vivere da sole in natura ma si devono organizzare a formare tessuti). Presentano grandezze dell’ordine del micron, per questo sono chiamati microorganismi.

Temi della microbiologia

• Diversità e l’evoluzione di microorganismi
• Cosa i microorganismi fanno sul pianeta Terra e le interazioni tra microorganismi e animali, corpo umano.

I microbiologi studiano microorganismi utilizzando varie tecniche, tra le quali la più importante è quella di studiarli in cultura (coltivazione di microorganismi). La coltura è costituita da cellule che crescono in un mezzo che può essere liquido o solido contenente nutrienti. È fondamentale che vi siano dei fattori di crescita, come vitamine, sali minerali e acqua. Il termine “crescita microbica” si riferisce all’aumento del numero di cellule, che non è altro che il risultato della divisione cellulare. Una singola cellula microbica, inoculata su una piastra di terreno, dopo un certo arco di tempo, si sviluppa per formare una colonia. Questa è costituita da milioni di cellule tutti uguali che derivano (per divisione cellulare) da una singola cellula parentale. La colonia la vedo ad occhio (circa 2mm).

L’altra tecnica fondamentale è la microscopia. Partendo da una colonia, posso metterla in vetrino e andare a visualizzare le singole cellule che la compongono, utilizzando il microscopio. Questo è quindi un modo per visualizzare gli individui della colonia.

Elementi delle strutture microbiche

• Abbiamo una membrana citoplasmatica che ha la funzione di barriera semipermeabile e separa due compartimenti: uno interno e uno esterno alla cellula.
• Vi è poi il citoplasma, che è una miscela acquosa formata da proteine, lipidi, polisaccaridi e acidi nucleici (macromolecole).
• Nel citoplasma vi sono inoltre i ribosomi, che permettono la sintesi delle proteine.
• Vi è poi una parete cellulare, che è una struttura relativamente permeabile peculiare di alcuni organismi. Si trova esternamente alla membrana e da sostegno e forma ai microorganismi.
• Abbiamo il DNA genomico, che è il complemento di tutti i geni della cellula.

Organismi e struttura cellulare

Gli organismi, a seconda della struttura cellulare, vengono divisi in due grandi categorie:

• Procarioti: Sono microorganismi che appartengono a due domini: Bacteria e Archea. Hanno una semplice struttura cellulare e mancano di nucleo ed organelli subcellulari. Il DNA non è quindi all’interno di un nucleo ma è libero nel citoplasma. Il genoma è un cromosoma circolare chiuso, che forma il nucleoide immerso nel citoplasma. In alcune possono essere degli elementi circolari di piccole dimensioni, mobili (possono essere trasferiti da una cellula all’altra) detti plasmidi. Contengono geni non essenziali alla sopravvivenza, ma di quelli che gli danno delle particolari caratteristiche (come la resistenza agli antibiotici). Il genoma è piccolo compatto, di 500-10000 geni nell’ordine di 10⁶ coppie di basi.
• Eucarioti: Appartengono al dominio Eukarya. Possono essere sia microorganismi che essere cellule vegetali o animali. Tra questi organismi abbiamo le alghe, i protozoi e i funghi. Questi presentano un nucleo, che contiene il DNA, e degli organelli. Hanno una struttura cellulare più complessa. Il genoma è un cromosoma lineare, contenente dalle 20000-250000 coppie di basi.

Proprietà condivise e specifiche delle cellule microbiche

• Proprietà condivise:
  • Compartimentazione e metabolismo: la cellula è considerata un compartimento che assume sostanze dall’ambiente esterno, le lavora e rilascia prodotti di scarto nell’ambiente. Anche se vi è una membrana, il sistema è considerato aperto per via dei continui scambi.
  • Crescita: durante le reazioni metaboliche si produce energia, che viene usata per sintetizzare nuove strutture e componenti cellulari che consentono la divisione cellulare, alla base della crescita cellulare.
  • Evoluzione: è un processo estremamente lento, in cui alcune modificazioni genetiche possono essere selezionate in modo da migliorare il fitness riproduttivo, in sostanza l’adattamento alla vita. Durante la divisione (alla base della crescita cellulare) possono verificarsi delle modificazioni del DNA. Se queste sono utili a migliorare l’adattamento della cellula all’ambiente vengono selezionate.
• Proprietà specifiche:
  • Motilità: consente alle cellule di allontanarsi da condizioni pericolose e/o di spingersi e avvicinarsi a nuove risorse ed opportunità, verso una condizione favorevole. Può essere mediata da flagelli.
  • Differenziazione: alcune cellule sono in grado di produrre cellule o strutture specializzate in grado di sopravvivere meglio in un periodo di stress. Un esempio è la sporulazione, produzione di spore. La spora è una forma di resistenza al calore, all’acidità o ad altro.
  • Comunicazione o cross-talking o quorum sensing: alcune cellule sono in grado di comunicare con quelle vicine mediante la produzione o ricezione di specifici segnali chimici, che sono metaboliti secondari.

Interazione dei microorganismi con l'ambiente

In natura, i microorganismi vivono in stretto contatto con il loro ambiente. La popolazione è un gruppo di cellule microbiche che derivano da una singola cellula microbica mediante successive divisioni (sono tutte uguali). L’habitat è l’ambiente in cui vive una popolazione microbica. La comunità è un gruppo di popolazioni microbiche che interagiscono tra loro poiché condividono lo stesso habitat. La diversità (riferendoci alla composizione) e l’abbondanza degli organismi che compongono la comunità dipendono da diversi fattori, quali la disponibilità di nutrienti e alcuni fattori come pH e temperatura. La comunità la definiamo in questi termini (di diversità e abbondanza).

L’ecosistema si riferisce all’insieme di organismi vivi insieme alle composizioni chimiche fisiche dell’ambiente (quindi habitat + comunità microbica). È fortemente influenzato e controllato dal metabolismo e dalle attività biologiche dei microorganismi della comunità. L’ecologia microbica è una branca della microbiologia che studia la composizione e le attività biologiche degli ecosistemi microbici.

Evoluzione della vita microbica

La Terra ha un’età di 5,6 miliardi di anni. I batteri sono stati i primi organismi a viverci e comparvero dopo il raffreddamento. Comparvero nelle acque dei primi oceani 4,6 miliardi di anni fa le prime entità cellulari. Inizialmente, 3,8 miliardi di anni fa, esistevano soltanto batteri fototrofici (sfruttano la luce) anossigenici (non producono ossigeno). 2,5 miliardi di anni fa comparvero i cianobatteri, che sono batteri fototrofici ossigenici, in grado quindi di produrre ossigeno. Grazie all’attività fotosintetica di questi batteri l’atmosfera fu arricchita di ossigeno, permettendo la colonizzazione delle terre emerse.

Il passaggio da anossigenico ad ossigenico permise lo sviluppo della vita di tutti gli altri organismi. 2 miliardi di anni fa, grazie alla lenta ossigenazione della Terra, comparvero gli eucarioti, poi delle alghe, poi di tutte le piante e degli animali. C’è un progenitore comune, “LUCA” (“last universal common ancestor”) da cui si sono originati i tre domini: Bacteria, Archea e Eukarya.

Il numero totale di cellule microbiche sulla Terra è stato stimato a 2,5 x 10³⁵ cellule. Sono riserve fondamentali di nutrienti essenziali per la vita. Vivono prevalentemente in profondità (fino a 10 km di profondità sotto la superficie terrestre) sia marine che terrestri: per il 66% vivono nelle profondità marine, per un 26% nelle profondità terrestri, il resto le superfici. Costituiscono la maggiore percentuale di biomassa.

Hanno un grande impatto sulla società umana. I microorganismi sono gli agenti patogeni che causano le malattie. All’inizio del XX secolo, la maggior causa di morte era rappresentata dalle infezioni. Oggi, le malattie infettive sono maggiormente controllate, soprattutto nei paesi industrializzati (in quelli non sono ancora la causa di molte malattie per via della ridotta disponibilità di medicine e vaccini).

Hanno un ruolo essenziale anche nella nutrizione umana. Non sono solo responsabili di patologie, possono anche esercitare delle attività benefiche per l’uomo. Quelli che abbiamo nel nostro intestino sono essenziali per l’omeostasi del nostro organismo e per favorire la digestione di carbonati complessi, la sintesi di vitamine e degli acidi grassi complessi. Questi microorganismi instaurano un rapporto di simbiosi mutualistica con il nostro organismo.

Vengono sfruttati nella biotecnologia per produrre antibiotici, aminoacidi, vitamine, etanolo, enzimi (per la biocatalisi industriale), proteine ricombinanti, i carburanti biologici.

Principi base della microscopia

Microscopia e microbiologia sono strettamente associate. Il microscopio è super essenziale, non può mancare in laboratorio! Ci permette di visualizzare le cellule microbiche, invisibili ad occhio nudo. Esistono due tipi di microscopi:

• Microscopio ottico: consente una risoluzione massima di 0,2 micron.
• Microscopio elettronico: ha una risoluzione maggiore, fino ad un massimo di 0,2 nm.

Struttura microscopio ottico

Abbiamo le lenti oculari, da cui si osserva, che consentono già di loro un ingrandimento di 10-20x, a seconda delle lenti montate. Poi abbiamo l’obbiettivo, le cui lenti sono responsabili di un ulteriore ingrandimento che può essere di 10x, 40x o 100x. Tendenzialmente, in microbiologica si usa soprattutto il 100x. Vi è lo stage che è dove viene posizionato il vetrino. Sotto abbiamo il condensatore che raccoglie la luce e la focalizza sul vetrino. Vi è una manopola per la messa a fuoco e vi è poi la fonte di luce. L’ingrandimento totale è dato dalla somma dell’ingrandimento delle lenti oculari (per esempio 10x) e quello delle lenti (per esempio 100x) → (10x e 100x 1000x). Si usa ampiamente l’obbiettivo ad immersione: sul coprioggetto vi è una goccia di olio minerale e l’obbiettivo si immerge. Questo permette di avere una migliore visualizzazione dell’immagine, convergendo maggiormente la luce.

Colorazione

Strategia per aumentare il contrasto tra le cellule e il loro background nella colorazione ottica. Per migliorare la performance della microscopia la utilizzo. I coloranti utilizzati sono il blu di metilene e cristal violetto. Sono molecole cariche positivamente che interagiscono con molecole caricate negativamente. La stessa superficie è carica negativamente, quindi, anche se non riuscisse ad entrare, riescono a colorare la cellula tramite assorbimento superficiale.

• Preparazione vetrino;
• Asciugare all’aria;
• Scaldarlo;
• Colorare il campione;
• Osservarlo a microscopio.

La colorazione differenziale marca con coloranti diversi cellule diverse. Si utilizzano come minimo due coloranti diversi. Quella più conosciuta ed utilizzata è quella di Gram. È usata come primo step per la caratterizzazione tassonomica di un batterio, per capire se è un Gram-positivo o un Gram-negativo. La diversa risposta dipende dalle diverse caratteristiche strutturali di queste due classi batteriche: quelli (+) hanno una parete molto ampia mentre quelli (-) molto sottile. Questa differenza è alla base della differenziazione.

• Viene aggiunto il colorante cristal violetto al campione;
• Viene aggiunta una soluzione di iodio;
• Si procede con la decolorazione con etanolo, che interessa solo le cellule Gram-negative, perché l’etanolo non riesce a penetrare attraverso la spessa parete dei Gram-positivi;
• Viene fatta una seconda colorazione con supranina, colorante rosa che colora le cellule precedentemente decolorate, ovvero le Gram-negative.

Microscopia a fluorescenza

Viene utilizzata per visualizzare microorganismi che emettono fluorescenza, che è l’emissione di luce ad una lunghezza d’onda diversa rispetto a quella che viene assorbita. L’autofluorescenza è quando le cellule contengono naturalmente le sostanze fluorescenti, come le clorofille. Il caso numero due è la colorazione con un agente fluorescente, il più utilizzato è il DAPI. Questo fa emettere alla cellula un colore blu brillante. Viene utilizzato per visualizzare cellule in molti habitat.

Struttura microscopio elettronico

La microscopia elettronica usa gli elettroni invece che la luce visibile per visualizzare le cellule. Ha una maggiore risoluzione. Esistono due tipi di microscopia elettronica:

• EM di trasmissione (TEM): si avvale di tecniche speciali di sezionamento del campione per osservare le strutture interne. Si trattano i campioni con permanganato, uranio e sali di piombo (costituiti da atomi pesanti che diffondono gli elettroni, aumentando il contrasto).
• EM a scansione (SEM): il campione non viene sezionato ma viene rivestito da un sottile strato di metallo pesante, solitamente oro. Gli elettroni diffusi producono un’immagine. Si può osservare solo la superficie della cellula. L’ingrandimento va dai 15X ai 100000x.

Storia evolutiva e diversità microbica

L’evoluzione è un processo che genera nuove varietà e specie di organismi. La variazione è il risultato di una mutazione genetica che avviene durante la duplicazione del DNA (la DNA polimerasi è molto efficiente ma nonostante questo può commettere errori, determinando mutazioni favorevoli o sfavorevoli). Le mutazioni favorevoli vengono selezionate, determinando un migliore adattamento all’ambiente. La filogenesi è lo studio delle relazioni evolutive tra gli organismi che ci porta alla costruzione di un albero filogenetico. La disciplina è basata sul confronto delle sequenze del gene 16S dell’rRNA.

L’operone dell’rRNA contiene tutti i geni che codificano per l’RNA ribosomiale. Abbiamo un promotore (P1P2), poi la sequenza codificante per la subunità 16S (circa 1500 coppie di basi), poi ITS (di circa 500 bp, è trascritta ma non è tradotta, contiene sequenze estremamente variabili a seconda della specie e del genere dell’organismo microbico), poi la sequenza codificante per il 23S (circa 2800 coppie di basi) e infine abbiamo il terminatore (T1T2). Le ITS sono sequenze tipizzanti. La sequenza 16S contiene 9 regioni (come l’ITS) estremamente variabili, che prendono il nome di V1 – V9, che hanno quindi importanza tassonomica. Sequenza 16S e ITS sono quindi considerati marker filogenetici.

• Estrazione del DNA genomico da una coltura cellulare e suo isolamento.
• Il DNA isolato viene sottoposto a PCR, funge da template. I primer che utilizziamo sono dei nucleotidi complementari a delle regioni esterne al gene 16S o complementari alla regione ITS.
• La sequenza ottenuta la andiamo a confrontare con le sequenze presenti nella banca dati.
• Sulla base di questo confronto posso creare un albero filogenetico (rappresentazione che descrive le distanze evolutive tra i vari microorganismi). Io devo avere un’omologia almeno pari al 97% perché l’organismo faccia parte di una specie.

Tutti i domini della vita si sono evoluti da LUCA, che è un batterio. I batteri sono i più vicini a LUCA perché sono stati i primi a comparire sulla Terra, gli eucarioti i più lontani.

Diversità metabolica

La diversità tassonomica si riflette in una diversità metabolica. Tutte le cellule richiedono una fonte energetica e una strategia metabolica per conservare energia e guidare i processi vitali che consumano energia. Questo è un postulato. Gli organismi possono essere classificati in base alla fonte di energia:

• Alcuni organismi utilizzano come fonte energetica le sostanze chimiche. Questo è alla base della chemiotrofia. Questi organismi possono utilizzare sia composti chimici organici (glucosio, acetato) che non organici (ammonio, acido solfidrico, ecc.). Quelli che utilizzano composti chimici organici sono detti chemioorganotrofi, mentre quelli che usano sostanze chimiche inorganiche sono detti chemiolitotrofi.
• Altri utilizzano la luce solare. Lo sfruttamento della luce è alla base di un’altra strategia metabolica, la fototrofia. Gli organismi che utilizzano la luce sono detti fototrofi.

Il risultato di entrambe le strategie metaboliche (chemiotrofia e fototrofia) è sempre lo stesso: la produzione di energia sotto forma di ATP, fondamentale per la crescita e sopravvivenza cellulare.

Chemioorganotrofi

• Sono organismi che ricavano energia da composti chimici organici.
• Sono in grado di metabolizzare tutti i composti organici naturali e molti sintetici.
• Distinguiamo:
  • Organismi aerobi: producono energia solo in presenza di ossigeno. Questo è il substrato limitante, senza ossigeno non sono in grado di sopravvivere e crescere.
  • Organismi anaerobi: producono energia in assenza di ossigeno. La modalità con cui lo stesso composto organico viene metabolizzato è diversa rispetto a quella degli aerobi.
  • Organismi microaerofili o anaerobi facoltativi: sono in grado di produrre energia in presenza o in assenza di energia. Generalmente prediligono situazioni con basse pressioni parziali di ossigeno, sono più simili agli anaerobi.