Appunti di Microbiologia enologica

APPLICAZIONE DEI LIEVITI KILLER

1. Controllo della crescita di un ceppo indesiderato nel corso della fermentazione

2. Protezione del vino dai lieviti contaminanti

L’attività killer viene rimossa con trattamenti con bentonite ad 1 g/L, ma non attraverso la

filtrazione.

Ricerca di lieviti produttori di tossina killer stabile in mosto e con ampio spettro di azione

contro i lieviti indesiderati.

Se crescono in modo pulverulento possono presentarsi liberi o a fiocchi.

- Sviluppo polverulento

- Sviluppo in aggregati

- Sviluppo flocculento

Sviluppo FLOCCULENTO

Per flocculenza si intende che dopo la gemmazione le cellule si separano e queste in un

secondo momento sono in grado di riformarsi.

Si usa nella vinificazione dei vini spumanti metodo classico: spumanti che vengono prodotti

in fermentazione alcolica di un vino base e poi rifermentazione in bottiglia con lo stesso

inoculo in modo effervescente, qui si aggiunge del lievito (zucchero) che rimane in bottiglia.

Si genera un precipitato morto fine e per rimuovere questi precipitati si ribalta o inclinare la

bottiglia, in modo tale che le fecce si raccolgono verso il collo della bottiglia e qui viene

eliminato (avviene per forza di gravità la discesa verso la bottiglia).

Vantaggio di rimuovere i lieviti durante il remuage al termine della sboccatura in bottiglia.

Quando una cellula è flocculante può esprimere determinate proteine che permettono di

essere tale. LECTIN-LIKE THEORY

Proteine reattive che creano delle interazioni deboli o forti di aggregazione tra di loro, i lieviti

flocculanti esprimono e processano una proteina come flocculina, queste sé attive si aprono

e ciò che scatena l’attivazione di queste proteine possono essere varie condizioni legata alla

presenza di ioni bivalenti come calcio che ne consentono l’apertura.

Queste pinze possono riconoscere in modo specifico dei recettori a base di carboidrati

(mannoproteine). L’apertura consente la formazione degli aggregati.

Almeno 5 geni sono espressi nelle condizioni di crescita di un lievito. Un pH neutro non

comporta una idrofobicità della soluzione, se il pH è acido l’idrofobicità aumenta e queste

aumentano l’attivazione delle proteine con relative aggregazioni (anche l’etanolo nel mezzo

si riversa producendo un abbassamento del pH).

Se alcuni geni vengono rotti non vengono più esposti le flocculine (1, 5, 9, 10, 11).

FLO8 è un anser che aumenta l’espressione è un aumento della relativa flocculazione.

I geni sono strutturali, una volta che la proteina viene collocata sulla parete del lievito anche

sé questa muore sarà sempre presente e anche quando le cellule sono morte sono in grado

di flocculare in presenza o assenza del relativo attivatore. La flocculazione interviene

legando recettori legati alle parete di altre cellule (INTERAZIONE CELLULARE).

Fattori che influenzano la flocculazione:

1. Cationi (Ca2+)

2. Temperatura, l’abbassamento favorisce la sedimentazione del lievito

3. Ossigeno, l'aerazione moderata è benefica per la flocculazione di lievito

4. Zuccheri che agiscono sulle interazione cellula-cellula a livello superficie e sulla

regolazione dei geni FLO

5. Etanolo che favorisce la flocculazione aumentano l'idrofobicità superficiale

POTERE SCHIUMOGENO: tendenza delle cellule al galleggiamento e alla prerogativa di

aderire ed essere attratte dalle bollicine di gas che si formano nel corso della fermentazione.

POTERE FILMOGENO (flor): formazione di un velo sulla superficie del vino, dove lo

sviluppo continua in condizioni ossidanti.

Residuo in basso di lievito di feccia morto, nel corso della fermentazione le cellule

rimangono nel mezzo a fermentare, a fine fermentazione si portano in superficie e

continuano il processo ossidativo dell’etanolo sottostante in reazione della produzione di

acetaldeide (odore pungente di frutta matura che supera la soglia di percezione).

Quando poi la fermentazione viene bloccata o termina i lieviti muoiono e vanno sul fondo del

recipiente.

I vini fortificati ci sono diversi livelli di barrique che vengono poste in cataste dall’alto verso il

basso (vino più giovane a vino più vecchio), si produce vino ad una certa produzione di

etanolo. Si aggiunge una sorta di concentrato di mosto per aumentare la gradazione alcolica

e si fortifica il vino perché si produce etanolo dall’aumento di mosti concentrati. Arrivano a

concentrazioni di etanolo molto alti 18°C, il velo genera ossidazione dell’etanolo ad

acetaldeide.

LIEVITI FLOR: i ceppi di S. cerevisiae sono in grado sia di svolgere la fermentazione

alcolica, sia di risalire in superficie per formare il biofilm e condurre l’affinamento dei vini

sotto flor, in presenza di ossigeno.

L’assolvimento di queste due funzioni comporta che i lieviti flor devono essere in grado di

adattarsi ai numerosi fattori di stress cui sono sottoposti in fermentazione ed in fase di

affinamento.

Durante la formazione del biofilm l’alcol etilico, principale fonte C, in assenza di glucosio,

viene ossidato ad acetaldeide.

Nella maturazione dei vini florizzati si formano grandi quantità di acetaldeide. Glicerolo ed

acido acetico vengono drasticamente consumati. Si ha rilascio e consumo di AA, in

particolare di prolina. La selezione per i caratteri di QUALITA’

Legati alla qualità del prodotto e all'attività microbiologica di un lievito di caratteri secondari

quando la fermentazione è avviata.

PUREZZA FERMENTATIVA: rapporto tra acidità volatile (come acido acetico in g/L) ed

etanolo (%volume) alla fine del processo fermentativo.

PRODUZIONE DI GLICEROLO: dopo etanolo e CO2, il glicerolo è il composto prodotto in

maggiore quantità durante la fermentazione alcolica. Esso contribuisce a impartire ai vini il

carattere di “dolcezza” (soglia di percezione circa 5,2 g/L), di “corposità” e di “pienezza”.

I Saccharomyces possono produrne dai 2 ai 10 g/L in funzione delle caratteristiche del

mosto e delle condizioni di fermentazione.

La produzione di glicerolo è a carattere di specie e di ceppo, soprattutto in Saccharomyces.

Ceppi alto produttori :

● Saccharomyces cerevisiae (7-8 g)

● Saccharomycodes ludwigii (8-9 g)

● Zygosaccharomyces bailii (6-7 g)

Ceppi basso produttori:

● H. uvarum (3g/L)

PRODUZIONE DI ALCOLI SUPERIORI: si formano nel corso della fermentazione alcolica

per via catabolica dagli AA corrispondenti e per via anabolica dal glucosio.

S. cerevisiae comunemente produce H2S (solo una parte di quella prodotta viene utilizzata

nella biosintesi, la parte eccedente viene secreta nel mezzo) in piccole quantità nella FA.

Il solfuro in cellula si direziona a livello di aminoacidi solforati o si detossifica sotto forma di

solfiti. La formazione di H2S è correlata a:

- Metabolismo di S e N da parte dei lieviti

- Elevata temperatura di fermentazione ed alto pH

- Elevato contenuto di cisteina nel mosto

- Deficienza di acido pantotenico (Vitamina B6) che si riflette in una carenza di

coenzima A e in accumulo di cisteina

Autolisi: un lievito in seconda fermentazione deve autolisarsi molto velocemente.

Meccanismo regolato a livello genetico di programmazione di morte della cellula attivando

certi geni che permettono alla cellula di autolisarsi.

Azione su acido malico: cerevisiae non fa questo metabolismo, ma certi lieviti amaricanti

(sintetizzano acido malico).

Quando passa tutti i caratteri tecnologici di qualità, deve essere venduto e subire un

processo che permette la commercializzazione e poi diffusione.

I lieviti starter vengono liofilizzati (disidratati).

La selezione per ORIGINE

Grazie al sequenziamento dei genomi i lieviti crescono e si evolvono in determinati ambienti.

Tendenza a considerare la qualità superiore di certi prodotti dovuta alla tipicità, uso di

pratiche tradizionali e legame con il territorio (terroir).

1. Isolamento ceppi da vitigno

2. Isolamento ceppi da cantina

Si arriva a LIEVITI AUTOCTONI, i singoli isolati non hanno caratteristiche enologiche

interessanti, spesso presentano performance inferiori agli starter già selezionati

(popolazione mista, è una squadra di ceppi).

Le fermentazioni spontanee sono condotte da popolazioni misti che cambiano ogni anno

Caratteri secondari TECNOLOGICI e di QUALITA’

Collegati ad aspetti secondari della fermentazione e della tecnologia produttiva come:

● Attività enzimatiche (β-xilosidasica, β-glucosidasica, β-glucanasica, proteasica,

pectinolitica, esterasica, decarbossilasica)

Saccharomyces e non-Saccharomyces esprimono nella vinificazione caratteri “non

convenzionali” in quanto capaci di idrolizzare molecole complesse di origine vegetale e di

riversare nel vino macromolecole di origine parietale.

ATTIVITA’ PROTEASICA: le proteine nei mosti (20-100 mg/L) e nei vini (in quantità inferiori)

sono presenti in concentrazione dipendente dal tipo di uva, dal grado di maturazione e dalle

tecniche di vinificazione.

La diminuzione del contenuto proteico solubile nel corso della FA ed in post-fermentazione è

riconducibile a fenomeni di denaturazione proteica, di idrolisi enzimatica, di precipitazione

per reazione con fenoli o ioni metallici e per trattamento con bentonite.

PROTEINE DEL VINO: le proteine del vino, soprattutto quelle a più basso PM (12-30 kDa),

rappresentano uno dei principali fattori di instabilità nel corso della sua conservazione (pH,

T). Un abbattimento del contenuto proteico si traduce in una maggiore stabilità dei vini

all’intorbidamento dovuto alla flocculazione delle proteine.

La rimozione delle proteine è generalmente effettuata mediante aggiunta di bentonite.

ATTIVITA’ ESTERASICA NEI LIEVITI ENOLOGICI: gli esteri sono composti volatili

importanti per il profilo sensoriale del vino.

Il contenuto di esteri di un vino è la conseguenza della sintesi, dell’idrolisi enzimatica o

spontanea e del livello della molecola substrato.

Gli esteri etilici e gli esteri acetati formati dal lievito nella FA contribuiscono a definire il

carattere floreale e fruttato del vino, soprattutto l’etilacetato (< 200 mg/L).

La quantità di esteri formati è ceppo dipendente e dipende dalla disponibilità di nutrienti, pH,

contenuto di acidi grassi, T e presenza di O2.

Sono attività metaboliche legate al lievito, essendo legati alla forma di legame con l’etanolo

sono responsabili all’aumento della produzione di acidi grassi in funzione del lievito.

ATTIVITA’ β-GLUCOSIDASICA: gli aromi varietali sono legati alla presenza di composti

terpenici volatili.

Durante la maturazione dell’uva queste sostanze si trovano in forma libera (odorosa) ed in

forma glicosilata (non odorosa). L’attività β-glucosidasica si esp