Appunti di Microbiologia clinica

Appunti di microbiologia clinica

Corso di medicina di laboratorio

Diagnosi microbiologica di una malattia infettiva

L'individuazione di un agente microbico può avvenire secondo due modalità:

• Ricerca diretta: prevede la ricerca dell'agente patogeno o dei suoi prodotti (ad es. tossine) direttamente nel campione.
• Ricerca indiretta: avviene attraverso l'evidenza di un movimento immunitario (ricerca di anticorpi liberi nel siero).

Diagnosi indiretta

Nel caso di anticorpi liberi nel siero, ogni classe anticorpale (IgM, IgG, etc) fornisce indicazioni differenti circa il timing, cioè quando è avvenuto il contatto con il microrganismo. Infatti, nel caso in cui sono presenti IgG vorrà dire che l'infezione è datata nel tempo, mentre se sono presenti IgM probabilmente si tratta di un'infezione più recente o in atto.

Diagnosi diretta

Può essere:

• Rapida (non colturale): prevede l'applicazione di tecniche (ad es. PCR) che consentono di identificare il microrganismo in tempi molto limitati. Tuttavia, tali tecniche non consentono di valutare la sensibilità dei microrganismi nei confronti degli antibiotici.
• Tradizionale: avviene con un approccio multistep, che viene a sua volta suddiviso in due fasi:

Fase pre-analitica

A. Comprende:

1. Prelievo del campione: a questo scopo è importante:
   • Eseguire il prelievo sempre prima di iniziare una terapia antimicrobica;
   • Ottenere dati anamnestici: sulla base dell'anamnesi, infatti, è già possibile porre un primo sospetto;
   • Prelevare il campione in condizioni di contaminazione controllata (il "come", cioè rispettando rigorose norme di asepsi), allo scopo di evitare l'inquinamento da parte di microrganismi estranei. Infatti, la crescita di eventuali microrganismi contaminanti potrebbe:
     • Inibire o ridurre la crescita del germe di nostro interesse (come il micobatterio della tubercolosi che è presente in basse concentrazioni nell'espettorato e nelle urine poiché risente dell'overcrescita della flora contaminante);
     • Alterare i rapporti quali-quantitativi fra i componenti della flora microbica di un determinato campione;
   • Per ridurre la possibilità di contaminazione, si individuano i siti fisiologicamente sterili (cioè non in contatto con l'ambiente esterno, come il sistema cardiovascolare, sistema nervoso, scheletro, articolazioni, muscoli, reni-ureteri-vescica e polmoni). In tal caso, il lavoro del clinico e del microbiologo risulta avvantaggiato poiché ogni isolamento ha valore eziologico. La situazione si complica quando il campione viene prelevato da un sito fisiologicamente non sterile (cute, congiuntiva, intestino, nasofaringe, orofaringe e mucosa vaginale) poiché bisogna tener conto della flora potenzialmente contaminante, la quale può avere o meno un valore eziologico.
   • Prelevare il campione nel momento più appropriato dell'evoluzione della malattia (il "quando");
   • Prelevare il campione da un sito altamente rappresentativo della malattia (il "dove");
   • Verificare che venga prelevata una quantità di materiale sufficiente (il "quanto") o che vi sia una concentrazione sufficiente di microrganismi nel campione (ad es. nella ricerca del M. tuberculosis nelle urine è opportuno effettuare dapprima una centrifugazione, per aumentare la concentrazione, e successivamente l'esame del sedimento urinario);
   • Velocità nell'esecuzione: alcuni microrganismi possono essere piuttosto "fragili" e morire dopo brevi periodi di tempo;

   Il campione viene prelevato dal clinico in diverse sedi:

   • Gola e rinofaringe (tampone sterile ruotato lungo la faringe posteriore);
   • Vie aeree inferiori (escreato, aspirato transtracheale, broncoaspirato);
   • Urine (mitto intermedio, cateterismo vescicale, puntura sovrapubica, cateterismo ureterale e sacchetto di plastica adesivo, per soggetti che non hanno pieno controllo della minzione);
   • Ferite (aspirazione con siringa o tampone sterile);
   • Feci (contenitori con cucchiaino raccoglitore: 3-5g o 5-10ml non oltre 4 ore);
   • Liquido cefalorachidiano (puntura lombare in prossimità di L3-L4; 3 provette: la terza viene utilizzata per la coltura);
   • Sangue (prelievo 1-5ml o 10ml);
2. Identificazione: prevede che il campione venga contrassegnato prima dell'invio al laboratorio con un codice a barre che lo identifica in maniera univoca;
3. Conservazione dei campioni biologici: nel caso in cui il campione non possa essere inviato in tempi congrui (2 ore) al laboratorio di microbiologia clinica;
4. Trasporto dei campioni biologici: può avvenire in terreni (terreni di trasporto) semi-solidi con agar oppure in terreni liquidi a base di soluzione tampone priva di sostanze nutritive (brodi di coltura), allo scopo di evitare lo sviluppo microbico e nel contempo preservare la vitalità dei batteri durante il trasporto (prolungare la sopravvivenza senza favorire la crescita microbica, poiché ciò inficerebbe sulle interpretazioni di tipo quantitativo). Per garantire un corretto trasporto è necessario che vengano rispettati determinati parametri:
   • I contenitori devono essere adeguati per ogni tipo di campione e di indagine che si vuole effettuare. Inoltre, devono essere sterili, monouso, etichettati e con chiusura ermetica;
   • Il tempo che trascorre tra la richiesta dell'esame e l'ottenimento del risultato deve tener conto della gravità del sospetto: in particolare, si otterranno falsi positivi se il tempo di trasporto supera le 2 ore (gran parte dei microrganismi a crescita rapida ha un tempo di generazione di 20-25 minuti e quindi in 2 ore la popolazione sarà aumentata di 64 volte) e falsi negativi se i microrganismi da trasportare richiedono condizioni colturali molto stringenti. (ad es. meningococco e gonococco vanno incontro ad una riduzione del 50-60% della loro carica microbica in caso di trasporto protratto);
   • Deve essere mantenuto un range di temperatura adeguato: generalmente si utilizza la temperatura di frigo, di circa 2-8 °C, mentre, nel caso del sangue o del liquor, il campione viene mantenuto a temperatura ambiente;
   • Deve essere garantita la sicurezza di tutte le figure che ruotano all'iter diagnostico, attraverso l'utilizzo di camice, mascherine, occhiali e guanti in lattice;
5. Accettazione del campione: viene valutata la conformità del campione in termini di:
   • Quantità, tempo e temperatura, con i quali il campione viene inviato al laboratorio;
   • Grado di contaminazione sull'esterno del contenitore o all'interno di esso ad esempio con sangue o pus.

Fase analitica

B. Comprende:

6. Colorazione:
   • Colorazione semplice: prevede l'utilizzo di un unico agente colorante, come il cristalvioletto e il blu di metilene;
   • Colorazione di Gram (colorazione differenziale): è in grado di dare informazioni in tempi molto ridotti, fornendo nell'arco di 10-15 minuti, un'indicazione sull'eziologia microbica in caso di positività. Invece, in caso di negatività, essendo la microscopia scarsamente sensibile, questa indagine deve essere confermata da tecniche più sensibili. La colorazione di Gram è una tecnica regressiva, cioè si attua dapprima una ipercolorazione e successivamente una decolorazione, la quale ci consente di differenziare i microrganismi in Gram positivi e Gram negativi sulla base della complessità della parete cellulare. Tuttavia con la colorazione di Gram non è possibile differenziare un patogeno dalla flora commensale e non consente di individuare il Mycoplasma poiché non possiede parete cellulare;
   • Colorazione di Ziehl-Neelsen (colorazione differenziale) con carbolfucsina: è un esame di laboratorio che consente di riconoscere la presenza dei micobatteri in un campione sfruttando la caratteristica alcool-acido resistenza di tali microrganismi. I micobatteri, per la particolare struttura e composizione della parete cellulare, hanno la capacità di trattenere la colorazione della fucsina basica di Ziehl anche quando trattati con decoloranti come l'alcool;
   • Colorazione della capsula, con inchiostro di china o rosso Congo: è una colorazione di tutto ciò che si trova all'esterno della capsula batterica, poiché il colorante non riesce a penetrare all'interno. È importante per porre diagnosi finale di infezioni fungine, dato che la capsula, nel caso dei funghi, viene prodotta solo da Cryptococcus Neoformans;
   • Colorazione di Albert: importante per targettare i granuli di volutina, classici del Corinebacterium; diagnosi "presuntiva",
7. Esame microscopico: consente di effettuare un'analisi finale, sulla base dell'organizzazione cellulare, della colorazione e della forma (morfologia). Tale tecnica ha però delle limitazioni in termini di sensibilità (si osserva solo la millesima parte del campione!), sebbene si tratti di un esame le cui informazioni abbastanza grossolane possono comunque essere utili per indirizzare l'iter diagnostico.

   L'esame microscopico può essere effettuato con:

   • Tecniche di microscopia ottica:
     • In campo chiaro: è una tecnica preceduta dalla fissazione (in tal modo le cellule microbiche sono morte e vi è un rischio più contenuto per l'operatore) e dalla colorazione. Si parte da una fonte luminosa che, successivamente, attraverso un sistema di lenti, viene più o meno indirizzata sul campione. In questo caso i fasci di sorgente luminosa impattano direttamente sul campione e per ridurre la dispersione della luce si utilizza olio per immersione. Il microscopio in campo chiaro non consente lo studio di materiale biologico "a fresco" poiché fornisce solo un debole contrasto;
     • In campo scuro: è una metodica utilizzata per microrganismi di difficile colorazione. Infatti, si effettua generalmente su campioni a fresco, non colorati. "A fresco" significa che il campione non subisce il processo della fissazione, conditio sine qua non per effettuare una colorazione di Gram o una colorazione di Ziehl-Neelsen. Pertanto, nel preparato "a fresco" le forme microbiche conservano la vitalità e quindi può essere individuato, oltre all'organizzazione e alla forma, anche il tipo di moto cellulare e la reattività sierologica (interazione complementare dell'antigene con l'anticorpo). Nel microscopio in campo scuro si sostituisce il normale condensatore in campo chiaro con un condensatore "paraboloide", in modo tale da creare un cono di luce cavo che colpisce l'oggetto con forte obliquità. La luce, colpendo lateralmente il campione e non verticalmente, viene poi riflessa dal preparato ma non dal vetrino: in questo modo i microrganismi appaiono luminosi in un campo scuro. Pertanto nel campo scuro vengono evidenziati i contorni cellulari, aumentando notevolmente il potere di risoluzione (portandolo praticamente al doppio). Ciò permette di individuare strutture molto sottili, dimensionalmente poco rilevanti come un Treponema o delle Spirochete. L'inconveniente della microscopia in campo scuro è che la luce non attraversa i campioni e quindi è possibile studiarne soltanto le superfici.