Appunti di Microbiologia clinica

Appunti di

Microbiologia

Clinica

Corso di Medicina di Laboratorio

Diagnosi microbiologica di

una malattia infettiva

L’individuazione di un agente microbico può avvenire secondo due modalità:

ricerca dell’agente patogeno o dei suoi prodotti

- diretta: prevede la (tossine)

direttamente nel campione.

attraverso l’evidenza di un movimento immunitario

- indiretta: (ricerca di anticorpi

liberi nel siero).

Diagnosi indiretta

Nel caso di anticorpi liberi nel siero, ogni classe anticorpale (IgM, IgG, etc) fornisce

indicazioni differenti circa il timing, cioè quando è avvenuto il contatto con il

che l’infezione è datata

microrganismo. Infatti, nel caso in cui sono presenti IgG vorrà dire

nel tempo, mentre se sono presenti IgM probabilmente si tratta di un’infezione più recente o

in atto.

Diagnosi diretta

Può essere: prevede l’applicazione di tecniche (ad es. PCR) che consentono di

RAPIDA (non colturale):

identificare il microrganismo in tempi molto limitati. Tuttavia, tali tecniche non consentono

di valutare la sensibilità dei microrganismi nei confronti degli antibiotici.

TRADIZIONALE: avviene con un approccio multistep, che viene a sua volta suddiviso in

due fasi:

Fase pre-analitica

A. , che comprende:

1) Prelievo del campione: a questo scopo è importante:

→ Eseguire il prelievo sempre prima di iniziare una terapia

antimicrobica;

→ Ottenere dati anamnestici: sulla base dell’anamnesi, infatti, è già

possibile porre un primo sospetto;

→ Prelevare il campione in condizioni di contaminazione controllata

(il “come”, cioè rispettando rigorose norme di asepsi), allo scopo

di evitare l’inquinamento da parte di microrganismi estranei.

Infatti, la crescita di eventuali microrganismi contaminanti

potrebbe:

- inibire o ridurre la crescita del germe di nostro interesse

(come il micobatterio della tubercolosi che è presente in

basse concentrazioni nell’espettorato e nelle urine poiché

risente dell’overcrescita della flora contaminante);

- alterare i rapporti quali-quantitativi fra i componenti della

flora microbica di un determinato campione;

Per ridurre la possibilità di contaminazione, si individuano i siti

(cioè non in contatto con l’ambiente

fisiologicamente sterili

esterno, come il sistema cardiovascolare, sistema nervoso,

scheletro, articolazioni, muscoli, reni-ureteri-vescica e polmoni). In

tal caso, il lavoro del clinico e del microbiologo risulta

avvantaggiato poiché ogni isolamento ha valore eziologico. La

situazione si complica quando il campione viene prelevato da un

sito fisiologicamente non sterile (cute, congiuntiva, intestino,

nasofaringe, orofaringe e mucosa vaginale) poiché bisogna tener

conto della flora potenzialmente contaminante, la quale può avere o

meno un valore eziologico.

→ Prelevare il campione nel momento più appropriato dell’evoluzione

della malattia (il “quando”);

→ Prelevare il campione da un sito altamente rappresentativo della

malattia (il “dove”)

→ Verificare che venga prelevata una quantità di materiale sufficiente

(il “quanto”) o che vi sia una concentrazione sufficiente di

microrganismi nel campione (ad es. nella ricerca del M.

tuberculosis nelle urine è opportuno effettuare dapprima una

centrifugazione, per aumentare la concentrazione, e

successivamente l’esame del sedimento urinario);

→ nell’esecuzione: alcuni microrganismi possono essere

Velocità

piuttosto “fragili” e morire dopo brevi periodi di tempo;

Il campione viene prelevato dal clinico in diverse sedi:

- gola e rinofaringe (tampone sterile ruotato lungo la faringe

posteriore);

- vie aeree inferiori (escreato, aspirato transtracheale,

broncoaspirato);

- urine (mitto intermedio, cateterismo vescicale, puntura

sovrapubica, cateterismo ureterale e sacchetto di plastica adesivo,

per soggetti che non hanno pieno controllo della minzione);

- ferite (aspirazione con siringa o tampone sterile);

- feci (contenitori con cucchiaino raccoglitore: 3-5g o 5-10ml non

oltre 4 ore);

- liquido cefalorachidiano (puntura lombare in prossimità di L3-L4;

3 provette: la terza viene utilizzata per la coltura);

- sangue (prelievo 1-5ml o 10ml);

2) Identificazione: prevede che il campione venga contrassegnato prima

dell’invio al laboratorio con un codice a barre che lo identifica in maniera

univoca;

3) Conservazione dei campioni biologici: nel caso in cui il campione non

possa essere inviato in tempi congrui (2 ore) al laboratorio di

microbiologia clinica;

4) Trasporto dei campioni biologici: può avvenire in terreni (terreni di

trasporto) semi-solidi con agar oppure in terreni liquidi a base di

soluzione tampone priva di sostanze nutritive (brodi di coltura), allo

scopo di evitare lo sviluppo microbico e nel contempo preservare la

vitalità dei batteri durante il trasporto (prolungare la sopravvivenza senza

favorire la crescita microbica, poiché ciò inficerebbe sulle interpretazioni

di tipo quantitativo). Per garantire un corretto trasporto è necessario che

vengano rispettati determinati parametri:

→ i contenitori devono essere adeguati per ogni tipo di campione e di

indagine che si vuole effettuare. Inoltre, devono essere sterili,

monouso, etichettati e con chiusura ermetica;

→ il tempo che trascorre tra la richiesta dell’esame e l’ottenimento del

risultato deve tener conto della gravità del sospetto: in particolare,

si otterranno falsi positivi se il tempo di trasporto supera le 2 ore

(gran parte dei microrganismi a crescita rapida ha un tempo di

generazione di 20-25 minuti e quindi in 2 ore la popolazione sarà

aumentata di 64 volte) e falsi negativi se i microrganismi da

trasportare richiedono condizioni colturali molto stringenti.(ad es.

meningococco e gonococco vanno incontro ad una riduzione del

50-60% della loro carica microbica in caso di trasporto protratto);

→ deve essere mantenuto un range di temperatura adeguato:

generalmente si utilizza la temperatura di frigo, di circa 2-8 °C,

mentre, nel caso del sangue o del liquor, il campione viene

mantenuto a temperatura ambiente;

→ deve essere garantita la sicurezza di tutte le figure che ruotano

all’iter diagnostico, attraverso l’utilizzo di camice,

attorno

mascherine, occhiali e guanti in lattice;

5) Accettazione del campione: viene valutata la conformità del campione

in termini di:

- quantità, tempo e temperatura, con i quali il campione viene inviato

al laboratorio;

grado di contaminazione sull’esterno del contenitore o all’interno

- di esso ad esempio con sangue o pus.

Fase analitica

B. , che comprende:

6) Colorazione:

→ prevede l’utilizzo di un unico agente

colorazione semplice:

colorante, come il cristalvioletto e il blu di metilene;

→ colorazione di Gram (colorazione differenziale): è in grado di

dare informazioni in tempi molto ridotti, fornendo nell’arco di 10-

un’indicazione sull’eziologia microbica in caso di

15 minuti,

positività. Invece, in caso di negatività, essendo la microscopia

scarsamente sensibile, questa indagine deve essere confermata da

tecniche più sensibili. La colorazione di Gram è una tecnica

regressiva, cioè si attua dapprima una ipercolorazione e

successivamente una decolorazione, la quale ci consente di

differenziare i microrganismi in Gram positivi e Gram negativi

sulla base della complessità della parete cellulare. Tuttavia con la

colorazione di Gram non è possibile differenziare un patogeno

dalla flora commensale e non consente di individuare il

Mycoplasma poiché non possiede parete cellulare;

→ colorazione di Ziehl-Neelsen (colorazione differenziale) con

carbolfucsina: è un esame di laboratorio che consente di

riconoscere la presenza dei micobatteri in un campione sfruttando

la caratteristica alcool-acido resistenza di tali microrganismi. I

micobatteri, per la particolare struttura e composizione della parete

cellulare, hanno la capacità di trattenere la colorazione

della fucsina basica di Ziehl anche quando trattati con decoloranti

come l'alcool;

→ colorazione della capsula, con inchiostro di china o rosso Congo:

è una colorazione di tutto ciò che si trova all’esterno della capsula

batterica, poiché il colorante non riesce a penetrare all’interno. E’

importante per porre diagnosi finale di infezioni fungine, dato che

la capsula, nel caso dei funghi, viene prodotta solo da

Cryptococcus Neoformans;

→ colorazione di Albert: importante per targettare i granuli di

volutina, classici del Corinebacterium; diagnosi “presuntiva”,

7) Esame microscopico: consente di effettuare una

non finale, sulla base dell’organizzazione cellulare, della colorazione e

della forma (morfologia). Tale tecnica ha però delle limitazioni in termini

di sensibilità (si osserva solo la millesima parte del campione!), sebbene

si tratti di un esame le cui informazioni abbastanza grossolane possono

indirizzare l’iter diagnostico.

comunque essere utili per

L’esame microscopico può essere effettuato con:

→ Tecniche di microscopia ottica:

- in campo chiaro: è una tecnica preceduta dalla fissazione (in

tal modo le cellule microbiche sono morte e vi è un rischio

più contenuto per l’operatore) e dalla colorazione.

Si parte da una fonte luminosa che, successivamente,

attraverso un sistema di lenti, viene più o meno indirizzata

sul campione. In questo caso i fasci di sorgente luminosa

impattano direttamente sul campione e per ridurre la

dispersione della luce si utilizza olio per immersione. Il

microscopio in campo chiaro non consente lo studio di

materiale biologico “a fresco” poiché fornisce solo un debole

contrasto;

- in campo scuro: è una metodica utilizzata per

microrganismi di difficile colorazione. Infatti, si effettua

non colorati. “A fresco”

generalmente su campioni a fresco,

significa che il campione non subisce il processo della

fissazione, conditio sine qua non per effettuare una

colorazione di Gram o una colorazione di Ziehl-Neelsen.

Pertanto, nel preparato “a fresco” le forme microbiche

conservano la vitalità e quindi può essere individuato, oltre

all’organizzazione e alla forma, anche il tipo di moto

cellulare e la reattività sierologica (interazione

complementare dell’antigene con l’anticorpo).

Nel microscopio in campo scuro si sostituisce il normale

condensatore in campo chiaro con un condensatore

“paraboloide”, in modo tale da creare un cono di luce cavo

l’oggetto con forte obliquità.

che colpisce La luce, colpendo

lateralmente il campione e non verticalmente, viene poi

riflessa dal preparato ma non dal vetrino: in questo modo i

microrganismi appaiono luminosi in un campo scuro.

Pertanto nel campo scuro vengono evidenziati i contorni

cellulari, aumentando notevolmente il potere di risoluzione

(portandolo praticamente al doppio). Ciò permette di

individuare strutture molto sottili, dimensionalmente poco

rilevanti come un Treponema o delle Spirochete.

della microscopia in campo scuro è che la

L’inconveniente

luce non attraversa i campioni e quindi è possibile studiarne

soltanto