Appunti di Microbiologia clinica

PCR.

Un particolare tipo di PCR real time è quella

con trascrittasi inversa che si basa sull’mRNA,

il quale ci dice se c’è trascrizione oppure no,

cioè se un gene è attivo o meno.

b) sonde geniche: sono sequenze a singolo filamento

di DNA o RNA complementari alla sequenza

genica da ricercare, con la quale formeranno un

“ibrido” (ibridazione), l’equivalente di un

immunocomplesso.

Le sonde utilizzate nelle tecniche di ibridazione si

possono riunire in due gruppi principali:

- radioattive (sonde calde): sono marcate con

radioisotopi e rappresentano quelle più sensibili,

sebbene possiedano diversi svantaggi;

- non radioattive (sonde fredde): derivano da

modifiche chimiche dei nucleotidi, a cui

vengono legate sostanze come la biotina

(vitamina H), gruppi solfonici (sonde solfonate),

digossigenina o enzimi (fosfatasi alcalina,

perossidasi, etc.).

In seguito, un sistema rivelatore (reporter)

l’avvenuta formazione dell’ibrido.

mostrerà

Esistono generalmente due sistemi di rivelazione:

- diretto, basato sul legame di un enzima o di un

fluoroforo alla sonda;

- indiretto, basato su sistemi che sfruttano

molecole intermediarie per il riconoscimento dei

marcatori fissati sulla sonda.

L’ibridazione è dunque una tecnica che permette di

verificare la specificità del prodotto della PCR e

può essere effettuata:

- in fase solida: la sonda è fissata su un supporto

solido, generalmente una membrana di

nitrocellulosa (che è incapace di ritenere DNA

bicatenario, per cui questo deve essere prima

denaturato) o di nylon. Il trasferimento di

molecole su un supporto solido per capillarità è

detto blotting e si divide in:

• southern blotting (si cerca il DNA con

una sonda a DNA): il DNA viene prima

frammentato con l’aiuto degli enzimi,

successivamente viene separato nei vari

frammenti su un gel di agarosio (non di

poliacrilammide, come accade nel

western blot). A seguito di corsa

elettroforetica si trasferisce il pattern

elettroforetico per capillarità su un

substrato solido (membrana di

nitrocellulosa) e questa successivamente

viene cimentata col sistema rivelatore

(sonde marcate con un fluorocromo

oppure con un enzima). L’avvenuto

legame si potrà evidenziare con

l’autoradiografia, ovvero l’esposizione

diretta di una lastra a particelle β, la quale

si impressionerà in corrispondenza dei

siti in cui c’è un decadimento

dell’elemento radioattivo;

• (si cerca l’RNA con

northern blotting

sonde a DNA): si basa su un principio del

tutto simile a quello del southern, soltanto

che si ricerca RNA;

• dot blot: metodica che consiste

nell’applicare una goccia o comunque

volumi ridotti di DNA o RNA (a singolo

filamento) direttamente sul filtro di

nitrocellulosa, che poi verranno ibridati

con una sonda marcata. Sul substrato è

presente la singola elica del DNA che

dovrà riconoscere la singola elica del

target. Il sistema di rivelazione è di tipo

autoradiografico oppure si basa

di luminescenza;

sull’emissione

• checkboard DNA-DNA hybridization:

consente di identificare un gran numero

di specie batteriche su molti campioni

clinici. Le sonde (una per ciascuna specie

batterica che si vuole ricercare) vengono

preparate dal DNA estratto dai ceppi di

riferimento delle specie corrispondenti e

marcato con digossigenina e vengono

rilevate poi con anticorpi anti-

digossigenina;

- in fase liquida: è una tecnica molto più rapida

perché la sonda è in soluzione;

- in situ: permette la localizzazione di acidi

nucleici su cromosomi, nuclei e citoplasma, con

un metodo molto simile a quello

dell’immunoistochimica. L’ibridazione in situ

sfrutta la complementarietà della sonda con la

sequenza target e la fluorescenza. Quindi in

questo caso si ha una FISH, cioè un’ibridazione

fluorescente in situ, che si effettua direttamente

sul campione. La FISH generalmente serve non

soltanto per l’identificazione ma anche per la

localizzazione, quindi per individuare ad

esempio l’intracellularità di un determinato

patogeno.

Le reazioni di ibridazione possono essere applicate

su varie tipologie di campione, quindi su colonie,

su preparazioni di DNA purificato oppure

direttamente su campioni clinici. La performance

del test è molto buona in termini di sensibilità ed è

più efficace se applicata sulla coltura e non sul

campione clinico perché sulla coltura c’è una più

alta concentrazione di target che non sul campione

clinico dove il target è fortemente diluito dalla

matrice;

9) Sensibilità agli antimicrobici: viene valutata attraverso:

→ Antibiogramma: indica se un batterio è resistente o meno ad un

determinato antibiotico. Può essere effettuato con diverse

metodiche:

- disco-diffusione (metodo di Kirby-Bauer): una volta isolato

e identificato un microrganismo da un campione biologico

(mediante coltura su terreni particolari oppure con

colorazioni specifiche), se ne preleva una colonia con un

tampone e lo si striscia su un terreno di coltura adatto

(tipicamente piastre Agar sterili) in modo uniforme di modo

che lo sia anche la crescita microbica. A questo punto si

applicano sulla piastra alcuni dischi di carta bibula

impregnati di antimicrobici a concentrazioni note e si mette

il tutto ad incubare per 18-24 ore a 35 gradi °C, per

consentire la crescita dei germi. Terminato il periodo

dell’incubazione si va a misurare il diametro degli aloni di

inibizione della crescita che si sono formati attorno al disco

per la diffusione del farmaco nel terreno di coltura e le cui

dimensioni sono proporzionali alla sensibilità del germe al

farmaco (più è sensibile, più sarà grande il diametro). Il

diametro dell’alone viene confrontato con tabelle standard: il

microrganismo potrà essere definito sensibile (S), resistente

(R) o a sensibilità intermedia (I);

- brodo-diffusione (test di diluizione in brodo): è un

antibiogramma su terreno liquido: in questo caso si

preparano delle provette con uguale quantità di terreno a cui

vengono aggiunte diluizioni scalari del farmaco da saggiare.

Quindi si inocula una quantità standard di microorganismo e

dopo 18-24 ore di incubazione si valuta la presenza di

crescita microbica. La provetta con più alta diluizione in cui

non si sono replicati i microbi (basta vedere la torbidità del

liquido) dà il valore della MIC (Concentrazione Minima

Inibente), cioè la più piccola quantità di antibiotico

necessaria a inibire il batterio testato;

- sistemi automatici: sono metodi automatizzati per eseguire

la brodo-diffusione, con più file di pozzetti con i diversi

farmaci alle diverse diluizioni;

- gradiente di antibiotico E-test (Epsilometer test): si

applicano sulle piastre Agar delle strisce imbevute di

farmaco, con una concentrazione scalare di antibiotico: il

principio è analogo a quello del metodo Kirby-Bauer, e in

questo caso la MIC si legge sulla tacchetta relativa al punto

di intersezione dell’alone sulla striscia. Con tale metodica si

possono testare più antibiotici in contemporanea.

Estrazione di acidi nucleici

L’estrazione di acidi nucleici consiste nell’isolamento di DNA o RNA da un tessuto o da

cellule eucariotiche o procariotiche. E’ quindi possibile estrarre acidi nucleici da varie fonti,

quali procarioti, eucarioti, virus, organelli e liquidi biologici. La tecnica di estrazione deve

permettere di ottenere acidi nucleici puri, non degradati e adatti a manipolazioni successive.

Fasi dell’estrazione

L’estrazione di acidi nucleici da materiale biologico procede in diverse fasi:

 Rottura e lisi cellulare: può essere:

- Fisica: omogeneizzatore a pestello (potter), vibrazioni ultrasoniche,

congelamento/scongelamento, shock osmotico;

- Chimica: detergenti, etc;

- Digestione enzimatica;

 Allontanamento delle membrane, attraverso centrifugazione, che permette la

separazione di due fasi:

- una superiore (sopranatante) che contiene gli acidi nucleici in soluzione;

- una inferiore (pellet) che comprende membrane e frammenti cellulari;

 Allontanamento lipidi, proteine e carboidrati (estrazione fenolica): il fenolo viene

aggiunto al sopranatante che diventa lattescente dopo agitazione. Il fenolo si lega al

core delle proteine causando denaturazione e, dopo centrifugazione, permette di

ottenere tre fasi:

- una superiore, che contiene la soluzione di acidi nucleici;

un’interfase di proteine denaturate;

-

- una inferiore, che rappresenta la fase fenolica contenente lipidi e proteine ricche

di amminoacidi idrofobi;

 Estrazione eterea: il surnatante viene trattato con etere per allontanare eventuali

l’etere presente sulla parte superiore della

residui di fenolo. Dopo centrifugazione,

provetta viene allontanato e la soluzione risultante costituisce la miscela di acidi

nucleici;

 Allontanamento e distruzione di DNA o RNA (facoltativo): a questo scopo si usano:

- DNAsi, per eliminare il DNA che contamina le preparazioni di DNA;

per eliminare l’RNA in preparazioni di DNA;

- RNAsi,

 alcolica e purificazione dell’acido nucleico:

Precipitazione il DNA viene miscelato

con 2 volumi di etanolo assoluto, in presenza di cationi monovalenti, e viene lasciato

precipitare a -80°C. Dopo centrifugazione, i pellet di DNA vanno lavati in etanolo al

70% per allontanare i sali e ricentrifugati. Il pellet, dopo essicazione, viene risospeso

in un tampone a bassa forza ionica (in genere tris-EDTA) a Ph 7.6-8.0.

 l’acido nucleico può quindi essere dosato ed essere utilizzato per ulteriori

Dosaggio:

procedure.

Metodi di separazione/purificazione

 Precipitazione differenziale (centrifugazione per gradiente): si basa sul principio

che la densità dell’RNA sia superiore a quella del DNA. Il campione viene sottoposto

ad una ultracentrifugazione su un cuscino di cloruro di cesio e, dato che soltanto

l’RNA è in grado di attraversare lo spessore di cesio, esso può essere recuperato sul

fondo di un pellet molto puro. L’RNA viene poi lavato con isopropanolo, precipitato

con etanolo e quindi risolubilizzato in acqua. Questa tecnica permette di pottenere

un’eccellente qualità di RNA, sebbene sia onerosa e lunga e necessiti di materiali

speciali;

 Tecnica di Chomczynski: si basa sulla differenza di solubilità degli ac