Appunti completi Microbiologia applicata

La cellula

Unità fondamentale strutturale e funzionale in cui è organizzata la materia vivente; le cellule animali e vegetali sono simili ma si differenziano per il metabolismo, per la parete cellulare assente nella animale, parete che è molto diversa rispetto a quella delle procarioti. Gli organismi pluricellulari hanno cellule eucarioti, così come alcuni organismi unicellulari: protozoi, funghi, alghe (unicellulari fotosintetici), muffe.

Differenze tra cellule procariote e eucariote

• Il nucleo nelle cellule eucarioti ha una membrana per il riassortimento dell'informazione genetica, nei procarioti non c'è.
• Nei procarioti è presente la parete cellulare, completamente diversa da quella delle piante.
• Nei procarioti mancano organelli come Golgi, mitocondri, reticolo, cloroplasti, ma non mancano le funzioni associate ad essi che sono svolte in strutture diverse, come il processo di respirazione che avviene nella membrana citoplasmatica.
• Altre differenze: replicazione DNA, apparato di trascrizione, traduzione e membrana cellulare.

Le differenze riscontrate tra processi eucarioti e procarioti ci hanno permesso di trovare molecole che inibiscono selettivamente i processi di replicazione, trascrizione o traduzione nei procarioti ma non negli eucarioti: antibiotici. Gli organismi composti di cellule procariote possono essere divisi in due gruppi: Batteri e Archea, due gruppi molto distinti.

Organismi procarioti

Gli organismi procarioti non costituiscono un gruppo filogeneticamente omogeneo, infatti, gli archea hanno avuto un periodo di coevoluzione con organismi che sono diventati eucarioti moderni. Questa origine evolutiva diversa si riflette in grosse differenze tra i due gruppi e nel fatto che gli archei hanno aspetti simili agli eucarioti. Bacteria rappresentano il gruppo più numeroso e vivono per la maggior parte in ambienti dalle condizioni non estreme, mentre gli archei vivono in habitat molto particolari con elevate temperature, pressione, salinità; alcuni di quest'ultimi producono metano, abilità non riscontrata in alcuna specie batterica mentre esistono batteri fotosintetici e non organismi archea. Inoltre, tutti i microorganismi patogeni conosciuti appartengono ai bacteria.

Microbiologia

La microbiologia si occupa di "organismi microscopici" tipicamente non visibili ad occhio nudo (perciò si può dire nasca dopo l'invenzione del microscopio ottico), procarioti ed eucarioti, ma anche di virus, ancora più piccoli. La microbiologia ruota attorno a due temi fondamentali: comprendere i fenomeni della vita, funzionamento dei microrganismi e applicazioni della scienza alle necessità umane (usare i microrganismi a proprio vantaggio-difendersi dai microrganismi dannosi).

Esempio: sapere come funziona un microrganismo patogeno è fondamentale per trovare metodi che servano per difenderci da essi, antibiotici e altre strategie; i microrganismi per lo più però sono buoni, sono utili: industria agroalimentare, opera del metabolismo di alcuni microrganismi, fermentazione. Le dimensioni medie di una cellula batterica bastoncellare sono una lunghezza: 1-5 µm, larghezza circa 1 µm, i virus batterici sono di minori dimensioni mentre procarioti presenti sui fondali oceanici possono avere dimensioni maggiori.

Classificazione scientifica

Nome genere: prima lettera maiuscola in italico, nome specie: lettera minuscola in italico. Antony van Leeuwenhoek: mercante di stoffe olandese, voleva esaminare le trame dei suoi tessuti e usando il microscopio notò organismi non visibili a occhio nudo, numerosissimi come numero di individui e come numero di specie; ne dà una descrizione solo morfologica, ma i suoi disegni sono fondamentali e presi in esame da contemporanei e posteri che hanno cominciato a studiare microrganismi microscopici, li definisce come "piccoli animali".

Teoria della generazione spontanea

Nello studio degli organismi una delle teorie più diffuse era quella della generazione spontanea; questa viene smantellata da Francesco Redi per gli organismi più grossi dimostrando che le larve di insetto originano dalla carne solo quando le mosche vi depositano le uova mentre per i microrganismi si pensava si generassero spontaneamente da materia organica, dovuto ad una errata interpretazione di fenomeni.

Louis Pasteur smantellò definitivamente la teoria della generazione spontanea con il suo famoso esperimento delle fiasche a collo di cigno. Pasteur lo dimostrò riempiendo una fiasca con un liquido organico non sterile ricco di nutrienti; il liquido viene sterilizzato mediante il calore e lasciato raffreddare lentamente. I microrganismi nell'aria non raggiungono il liquido, a causa del collo a cigno: il materiale rimane sterile, trasparente. Quando il liquido viene rovesciato i microrganismi in pochissimo tempo contaminano il brodo e iniziano a crescere, rendendo il liquido torbido, da trasparente.

Pasteur studiò inoltre il fenomeno della fermentazione di zuccheri in alcol, che si pensava dovuto semplicemente alla somministrazione di calore. Pasteur scoprì che il processo che converte zuccheri in alcol (fermentazione) è opera di diversi ceppi di lievito. Pasteur è inoltre tra i primi che comprende la relazione tra le malattie infettive e un determinato patogeno; inoltre, si rende conto del fatto che microorganismi meno virulenti possono essere utilizzati per vaccinare.

Un altro importante scienziato tedesco, Koch, prova che il Bacillus anthracis è l'agente eziologico del carbonchio; inoltre ha sviluppato tecniche per la coltivazione dei microrganismi utilizzate ancora oggi utilizzando terreni solidi, permettendo di sviluppare il concetto di cultura pura, una popolazione microbica originata da un solo tipo di batterio, senza avere problemi di contaminazione da altri microrganismi. Infine, ha isolato l’agente responsabile della tubercolosi, chiamato appunto anche il bacillo di Koch.

Koch e i suoi postulati

Koch inoltre ha sviluppato dei postulati, regole per individuare la regolazione causa-effetto tra un microrganismo e la malattia che questo causa:

• Copia
• Copia
• Copia
• Copia

I nomi hanno studiato l’azione dei micro e li hanno determinati come importanti agenti nei cambiamenti ambientali ad esempio riciclo di determinati elementi. Hanno sviluppato il concetto di cultura di arricchimento: cultura con le condizioni che favoriscono la crescita di un determinato tipo di organismo e non altri. Sviluppano poi le interazioni di microorganismi con altri organismi, in particolare la relazione di simbiosi, dove entrambi i membri traggono vantaggio dall'associazione.

Lo studio dei microrganismi ha permesso di passare dalla biologia di base a quella molecolare; per esempio, la trasformazione osservata nei batteri suggerisce che il DNA. Inoltre, Beadle e Tatum la teoria un gene-un enzima usando un fungo come organismo modello. Inoltre, Escherichia coli fu usato per scoprire la natura di DNA, RNA e proteine.

Fleming scoprì gli antibiotici studiando i microrganismi che li producono. Luria-Delbruck provano che l’origine della mutazione nei batteri è analoga a quella degli organismi pluricellulari. Avery, Macleod, McCarthy permettono la nascita della biologia molecolare grazie al fatto che un batterio viene trasfro. Cohen-Boyer, nascita ingegneria genetica con la costruzione in vitro di una molecola di DNA funzionante, grazie agli enzimi di restrizione prodotti dai batteri; enzimi difensivi che permettono al materiale genetico della cellula di non venire modificato. Sanger: sequenziamento del DNA di un batteriofago. 1985: scoperta della PCR che permette l'amplificazione di qualsiasi sequenza di DNA più di un milione di volte grazie a una polimerasi termoresistente proveniente dal Thermus aquaticus. 1995: TIGR viene sequenziato completamente il genoma di un microorganismo.

I batteri

La maggior parte ha dimensione tra 1-2 micrometri e possono avere forme diverse: cocchi, bastoncelli, spirilli, spirochete, prostecati, filamenti. Possono vivere isolati o in aggregati multicellulari, tra questi le colonie che possiamo osservarle quando i batteri sono fatti crescere su terreni solidi, il biofilm: non tutti i batteri formano biofilm quando crescono, è un polisaccaride che viene secreto dalla cellula e racchiude le cellule che li hanno prodotti e all'interno di questi aggregati le cellule sono particolarmente protette, problematica nel caso dei batteri patogeni, diventa più difficile eradicarli. Possono aggregarsi in strutture di poche cellule come lo stafilococco che si aggrega in grappoli o le sarcine che formano gruppi regolari di otto cellule.

La cellula procariote

Esternamente presenta la capsula, al di sotto la parete cellulare e al di sotto la membrana plasmatica e all'interno c'è il citoplasma che accoglie il materiale genetico. Spesso sono presenti i pili, strutture accessorie e possono avere il flagello, struttura proteica che ne permette il movimento in un ambiente liquido. Le cellule batteriche sono composte da più elementi, principalmente il carbonio, seguono poi ossigeno, azoto, idrogeno, fosforo e zolfo (CNOPS). Il carbonio è il principale componente del materiale cellulare; l'ossigeno costituisce i composti organici e l'acqua cellulare e rappresenta l'accettore di elettroni nella respirazione degli organismi aerobi; l'azoto è costituente base di aminoacidi, basi azotate, coenzimi. Questi elementi costituiscono le macromolecole, principalmente proteine, poi polisaccaridi, lipidi e lipopolisaccaridi, esclusivamente nei batteri Gram-.

La membrana citoplasmatica

La membrana nei batteri è a mosaico fluido, doppio strato fosfolipidico con proteine integrali/periferiche di membrana o lipoproteine, molto simile a quella eucariote; sono presenti però gli opanoidi, molecole lipidiche associate alla membrana, hanno la funzione di rafforzare la membrana, sostituendo gli steroli. I tre principali fosfolipidi sono la fosfatidiletanolammina, il fosfatidilglicerolo e fosfatidilcolina. La membrana citoplasmatica degli archea si differenzia da quella batterica, questo è dovuto al fatto che buona parte degli organismi vive in ambienti dalle condizioni estreme; nei fosfolipidi delle membrane degli Archea, il glicerolo è legato con un legame eterico e non esterico alle catene idrocarburiche, perché quest'ultimo è più resistente alla rottura termica alle alte temperature; inoltre, nelle membrana degli archea c'è un L-glicerolo legato al C3; e il gruppo PO4^- è legato al C1. Quindi riassumendo:

• Negli eucarioti e batteri: legami esteri tra due idrocarburi e il glicerolo.
• Negli Archea: due catene isoprenoidi e un glicerolo oppure eteri tra quattro catene isoprenoidi che legano due molecole di glicerolo; permette di avere un monostrato lipidico; questa struttura è ancora più resistente alle alte temperature perché non può avvenire lo scollamento del doppio strato lipidico, che invece potrebbe accadere nella normale membrana.

La membrana ha numerose funzioni, oltre a quelle canoniche svolge funzioni che nella cellula eucariote sono portate a termine da organelli:

• Isola dall'ambiente extracellulare (barriera di permeabilità).
• Mette in contatto e controlla gli scambi con l'ambiente cellulare (permeabilità, trasporti passivi e attivi).
• Accumula energia chimica ed elettrica (forza protonmotrice).
• Trasforma energia elettrica, chimica o luminosa in forza protonmotrice: è responsabile dei processi di respirazione e fotosintesi, gli elettroni per svolgere questi processi provengono dalla fotolisi dell'acqua che avviene grazie all'energia luminosa.
• Trasforma la forza protonmotrice in energia chimica (ATP), cinetica (flagelli).
• Percepisce le variazioni ambientali e trasmette segnali ai sistemi metabolici, chemiotattici (per avvicinarsi a sostanze benefiche e allontanarsi da quelle tossiche) e genetici.
• Secerne prodotti extracellulari tramite proteine di trasporto ed è la sede della biosintesi di costituenti delle strutture extra-citoplasmatiche.

Sistemi di trasporto tipici delle cellule procariote

• Sistema della permeasi Lac: viene utilizzato per il trasporto del lattosio con simporto con una molecola di H⁺.
• Sistema di trasporto del fosfato e del solfato: fondamentali per la crescita dei batteri.
• Traslocazione di gruppo: sistema della fosfotrasferasi: lavora in batteri enterici per trasportare il glucosio all'interno della cellula tramite 5 diverse proteine, di cui 4 sono proteine solubili di natura lipidica (1 è associata alla membrana) mentre l'enzima 2c è una proteina integrale di membrana; l'energia per svolgere questo trasporto proviene dal fosfoenolpiruvato che è idrolizzato a piruvato e il gruppo P è trasferito da una proteina all'altra e infine all'enzima 2c dove avviene anche la fosforilazione del glucosio come glucosio-6P e può così entrare direttamente nel processo di glicolisi. Questo tipo di trasporto viene utilizzato anche per mannosio e fruttosio; l'enzima 1 e la proteina HPr, presenti anche nel trasporto del glucosio, hanno un ruolo importante nel trasporto di queste molecole sono promiscue; questo permette alla cellula di ridurre l'energia necessaria per produrre le proteine per il sistema di traslocazione di queste molecole.

Un altro trasporto specifico dei procarioti è quello ABC=ATP binding cassette. All'interno della cellula c'è una ATPasi che lega ATP e lo idrolizza, fornendo energia per il trasporto di una particolare sostanza; questo trasporto è poi caratterizzato dalla proteina legante periplasmatica che ha alta affinità per il substrato da trasportare e aumenta anche l'affinità che questa ha per la proteina canale. Questo sistema è utilizzato dall'Escherichia coli per importare il maltosio; a livello della membrana esterna sono presenti le porine che permettono il passaggio di sostanze tramite diffusione facilitata (la membrana esterna non è energizzata a differenza di quella plasmatica). La proteina porina LamB è specifica per il maltosio e si trova sulla membrana esterna; una volta che questo raggiunge il periplasma la proteina MalE con alta affinità per il maltosio la lega e la trasporta fino al canale presente sulla membrana citoplasmatica; a livello della membrana ci sono le proteine F e G e il canale è formato dalla somma di queste due mentre la proteina MalK svolge l'idrolisi dell'ATP necessaria per questo trasporto. Viene utilizzato questo sistema perché nel periplasma non c'è energia; serve proteina ad alta affinità per la molecola trasportata che mantenga bassa la concentrazione della molecola libera e quindi la cellula possa trasportare la molecola attraverso la membrana esterna e periplasma una molecola senza utilizzare energia.

Agenti antibatterici che agiscono sulla membrana

• Detergenti
• Alcuni antibiotici che danneggiano la membrana (polimixine) agiscono come detergenti cationici interagendo con i fosfolipidi e aumentano la permeabilità cellulare.
• Peptidi antimicrobici: piccoli peptidi (12-100 aa) cationici si legano ed interagiscono con la membrana dove formano pori che la destabilizzano. Il peptide entra nella cellula e ne altera le funzioni vitali.
• Daptomicina: lipopeptide ciclico a sintesi non ribosomiale. Agisce sulla membrana batterica in presenza di Ca⁺⁺ (si inserisce nella membrana, oligomerizza e forma pori, distruzione forza proton-motrice).
• Composti “ionofori” (Es Valinomicina che distrugge la funzione de mitocondri e lavora anche sulla membrana plasmatica).

Parete cellulare

La sua struttura permette di distinguere i batteri in due grandi gruppi: quelli Gram+ e quelli Gram-, che rispondono in modo diverso alla colorazione di Gram con il microscopio elettronico a trasmissione. È una struttura rigida immediatamente esterna alla membrana cellulare e determina la forma della cellula, proteggendola dalla lisi osmotica. Essa può essere circondata dalla capsula composta da polisaccaridi o da strati S con una struttura quasi cristallina e composti da proteine.

Per verificare la reazione alla colorazione di Gram il batterio viene stemperato su un vetrino e fatta evaporare l'acqua e fissati al vetrino tramite una fiamma e si procede poi alla colorazione e analisi con un obbiettivo a immersione. Vengono colorati con il colorante cristallo violetto e in seguito si aggiunge il mordente che serve a fissare il colorante alle strutture cellulari; i batteri vengono trattati con dell’alcool che porta alla diversa reazione di gram + e gram -: la colorazione è rimossa dai batteri gram- non da quelli +; segue poi il processo di contro-colorazione con safranina.

La parete dei gram + può essere schematizzata come uno spesso strato di peptidoglicano a cui sono associati gli acidi tecoici e lipoteicoici e proteine legate covalentemente a questo strato. Nei gram - è molto più complesso: tra le due membrane c’è un sottile strato di peptidoglicani immerso nel periplasma; la membrana esterna è di natura lipidica ed è asimmetrica perché i lipidi che costituiscono i foglietti interno e esterno sono diversi: nel foglietto interno ci sono i fosfolipidi, gli stessi della membrana citoplasmatica; in quello esterno invece sono presenti lipopolisaccaridi con una porzione lipidica e una saccaridica che protrude verso l’esterno. La diversa reazione è dovuta al fatto che nei batteri gram+ lo spesso strato di peptidoglicano è resistente all'alcool.