Appunti di laboratorio di preparazione estrattiva e sintesi dei farmaci

Laboratorio di preparazione estrattiva e sintesi dei farmaci

Flash point di comuni solventi

→ Etanolo: punto di ebollizione 70° C – flash point 12
→ Acetone: punto di ebollizione 56° C – flash point -18

Il punto di infiammabilità è la temperatura più bassa alla quale si formano vapori in una quantità tale da determinare il fenomeno della combustione in presenza di ossigeno e di un innesco.

Lavori a pressione ridotta

• Filtrazione a pressione ridotta
• Rotavapor

Cromatografia su strato sottile (TLC)

Meccanismo messo in atto: adsorbimento solido-liquido. Tecnica semplice richiede minima quantità di sostanza: campioni dell’ordine di 10 g. Attraverso la TLC si possono ricavare informazioni diverse. Si basa sulla ripartizione di sostanze tra una fase stazionaria ed una fase mobile in base all’affinità che ogni sostanza ha per esse. Faremo solo la cromatografia ascensionale, non quella discensionale.

• → Fase stazionaria: materiale granulare omogeneo (es. gel di silice, allumina, ...)
• → Fase mobile: liquido che sale lungo lo strato sottile di fase stazionaria per capillarità

Possiamo avere diverse tipologie di TLC:

• Preparativa in cui lo spessore della FS è dell’ordine di 500-2000 μm e il diametro delle particelle è di 20-40 μm;
• Analitica in cui lo spessore della FS è dell’ordine di 250 μm e il diametro delle particelle è di 10-20 μm;
• HPTLC in cui lo spessore della FS è dell’ordine di 150 μm e il diametro delle particelle è di 5 μm.

Generalmente la fase stazionaria è addizionata a leganti (gesso, amido etc.) che permettono di farla aderire al supporto sotto forma di strato sottile su di un supporto di vetro o di alluminio. Maggiore è lo spessore dello strato e maggiore sarà la quantità di sostanza da mettere (maggiore nella preparativa). Altra differenza è la dimensione delle particelle della fase stazionaria es. gel di silice (maggiore nella preparativa). Maggiore è la suddivisione e la superficie della FS e maggiore è la capacità di suddivisione degli analiti. Nella preparativa abbiamo un minore grado di risoluzione; mentre con HPTLC saremo in grado di suddividere anche sostanze molto simili tra loro.

Possiamo seminare una maggiore quantità di miscela di sostanze ma avremo una minore capacità di suddivisione nella TLC preparativa.

• → Preparativa: vogliamo separare le varie componenti di una miscela. Quel componente verrà utilizzato per operazioni successive.
• → Analitica: non si attiva sull’intera miscela ma su una piccola aliquota

• Capisco quanti sono i componenti della miscela;
• Capisco qual è l’eluente migliore.

La TLC analitica precede generalmente la preparativa.

Informazioni ricavate dalla TLC

• Seguire andamento di una reazione;
• Controllare il grado di purezza della sostanza (mai fidarsi solo della TLC);
• Riconoscere prodotti incogniti paragonandolo ad una sostanza nota;
• Identificare l’eluente più adatto per poter poi procedere ad una separazione cromatografica su colonna;
• Seguire l’andamento di separazione cromatografica su colonna.

Poiché il numero di piatti teorici è correlato all’area di superficie espressa dalla fase stazionaria, particelle di dimensioni minori forniscono un maggior grado di risoluzione.

Procedure operative

Le TLC vengono comprate. Dopo aver preso la TLC, trasferire la soluzione della miscela nella TLC attraverso un capillare che riempiremo per 1-2 cm e metteremo a contatto con la fase stazionaria. Avremo così trasferito la soluzione. Per semine diverse far sì che le varie sostanze abbiano la stessa altezza e che questi spot (macchie) non siano molto grandi.

Prima dell’eluizione controllare la semina: andare sotto la lampada e vedere se gli spot abbiano la giusta dimensione e il giusto assorbimento. Le soluzioni che si mettono nelle TLC sono diluite e useremo solventi meno polari possibili. Capiterà che si usino solventi polari se la mia sostanza si scioglie solo in questi, ma avremo accuratezza nell’evaporare. L’eluente è la fase mobile (camera) dove porremo la nostra TLC. L’importante è che la FM incontri i nostri SPOT. L’eluente sale per capillarità fino a quando vi sarà la separazione delle sostanze dalla miscela in questione.

Segnare il fronte dell’eluente dopo aver tirato fuori la TLC dall’eluente immediatamente. A volte, alcune miscele non saranno separate in maniera ottimale. Due sostanze sovrapposte parzialmente - sviluppo multiplo – rimettere la TLC nell’eluente dopo che si sarà asciugata.

Tempistiche dell’eluente per salire all’incirca 10 minuti. La camera di eluizione deve essere satura. Nelle camere è presente una carta da filtro che mantiene la saturazione della camera che garantisce lo sviluppo in un tempo più rapido. Le sostanze si spostano in relazione alla loro polarità.

Cromatografia diretta e inversa

→ Cromatografia diretta: FS polare
→ Cromatografia inversa: FS apolare

Le sostanze che vengono maggiormente trattenute (vicino al punto di semina) sono quelle polari e viceversa. La particella di gel di silice (FS) espone in superficie il polimero di biossido di silicio, presenta raggruppamenti che offre come interazioni con analiti gruppi Si-O-Si (silossanici) e Si-OH (silanoli). Parte polare che, infatti, tratterranno le sostanze maggiormente polari. I legami maggiormente coinvolti saranno legami a H e dipolo-dipolo.

→ Alcol benzilico: gruppo -OH che definirà la polarità della molecola e il fatto che questa venga maggiormente trattenuta e si differenzia dalla benzaldeide che ha un solo gruppo polare, accettore di legami a H. Sarà meno polare e quindi meno trattenuto. L’alcol benzilico è sia accettore che donatore di legami a H, quindi è una molecola più polare.

Fase mobile percorre la FS (90% gel di silice). La scelta opportuna della FM può essere solo uno o anche una miscela opportuna che permette di gestire la polarità dell’eluente. La FM dovrà avere quelle caratteristiche tali da competere opportunamente con il solido per l’adsorbimento sulla FS. Se la competizione è efficace il soluto passerà più tempo in fase liquida e scorrerà di più. Più gli eluenti sono polari (con un maggiore potere di sviluppo) e più la sostanza trascorre tempo nella FM. Per miscele di sostanze poco polari sceglieremo un eluente poco polare e viceversa. In alcuni casi si possono aggiungere acidi o basi alla FM per far sì che entrino in competizione eluendo acidi o basi fortemente trattenuti.

Acidi carbossilici e ammine sono le più polari che maggiormente competono e vengono trattenuti dalla FS. Questo avviene meno in ordine dal più polare al meno polare per alcoli, esteri, aldeidi, chetoni, idrocarburi aromatici, idrocarburi alogenati, eteri, alcheni, alcani. Acidi carbossilici e ammine non è che non migrano mai, ma necessiteranno di un eluente altamente polare. Una volta che abbiamo fatto tutto ciò, dobbiamo rivelare con la lampada UV che emettono tra 254 e 366 nm. Possiamo trovare sostanze fluorescenti ma queste sono davvero poche; o sostanze non fluorescenti la FS deve contenere una sostanza fluorescente ZnSi e Mg attivato: assorbe UV a 254 nm ed emette luce verde, ottenendo macchie scure su fondo fluorescente.

Serve una certa coniugazione della sostanza da permettere la colorazione e l’assorbimento UV di questa. Se una sostanza non assorbe UV:

• Reattivi ad uso generale:
• Iodio: utile per rilevare sostanze che contengono doppi legami e che formano complessi a trasferimento di carica con lo iodio – si ottiene spot giallo-marrone;
• H₂SO₄ in EtOH: spruzzato su lastra che vengono poi carbonizzate. Comparsa di spot scuri su fondo bianco.
• Reattivi maggiormente usati:
• KMnO₄ in NaOH: reattivo ossidante che porta alla formazione di macchie scure (MnO₂). La lastrina appare viola e le macchie giallo-marroni.
• Sali di molibdeno e di cerio: reattivo ossidante a base di (NH₄)₆Mo₇O₂₄, Ce(SO₄)₂, H₂SO₄, H₂O. Le macchie appaiono blu-viola su fondo giallo.
• Reattivi specifici: per gruppi funzionali o classi di sostanze es. ninidrina usata per il riconoscimento di amminoacidi e il 2,4-dinitrofenilidrazina per aldeidi e chetoni.

La medesima TLC può essere risolta con altri sistemi. Utilizzeremo una pistola termica senza fiamma che arriva ad avere 300-400°C per asciugare la TLC.

Fattore di ritenzione Rf o fattore di ritardo

Capacità di separare una sostanza di interesse da altri componenti interferenti (selettività) permettendone l’identificazione- in TLC è legata dalla mobilità cromatografica dei componenti la miscela.

• → Può avere valori da 0 (non abbiamo separato nulla, sostanze non migrano)
• → 1 (non abbiamo separato nulla, migrano completamente)

Quindi sia un fattore di ritenzioni pari a 0 e pari a 1 non ci danno nessuna informazione. Il fattore di ritenzione è dato dal rapporto fra la distanza percorsa dalla sostanza (d_sost) e quella percorsa dal solvente (d_solv). Il valore è compreso fra zero (sostanza completamente trattenuta dall’adsorbente) e uno (sostanza non trattenuta che migra con il fronte dell’eluente) e viene espresso fino alla seconda cifra decimale. È una costante per precise condizioni cromatografiche difficilmente riproducibile a parità di fase stazionaria e fase mobile:

• Uniformità delle particelle e spessore della fase stazionaria;
• Temperatura può influenzare la fase mobile;
• Il grado di saturazione della camera di sviluppo;
• Quantità di miscela da separare seminata (per strati di FS di 250 μm, 5-10 mg di campione).

Difficile confrontare Rf ottenuti da lastrine diverse.

Fattore di ritenzione relativo R_rel: determinato nella medesima corsa della TLC. Proprio per ciò è meglio effettuare confronto diretto. Per effettuare un’analisi identificativa di una sostanza tramite TLC è necessario seminare sulla medesima lastrina, accanto alla miscela in esame, i componenti puri (standards) che ci si aspetta di trovare effettuando il riconoscimento per confronto diretto tra gli Rf degli spot incogniti con quelli degli standards seminati. Rf simili ma non identici definiscono la stessa sostanza? Si può risolvere attraverso TLC in miscela dove semino:

• Il composto da identificare
• Il campione di riferimento
• Una miscela dei due

Se dopo lo sviluppo tutte e tre le macchie sono perfettamente allineate con buona probabilità si tratta della stessa sostanza oppure vuol dire che non c’è stata risoluzione quindi bisogna provare a rifare la TLC usando un altro eluente.

• Efficienza: esprime la capacità della TLC di tenere compatta la macchia evitandone l’espansione durante l’eluizione. Dipende dalla granulometria della FS, dall’eluente, dalle condizioni sperimentali, dall’impaccamento della FS.
• Risoluzione: esprime la capacità della TLC di fornire al termine dell’eluizione delle macchie ben separate. Dipende da efficienza e selettività. Le macchie si considerano risolte se Rs> 1.
• Capacità: quantità di campione che può essere depositata sulla TLC per ottenere una buona separazione. Quantità eccessive determinano, infatti, macchie di forma irregolare che possono rendere scarsa la separazione e/o equivoca l’identificazione dei componenti della miscela. In tal caso rifare la TLC diluendo maggiormente la miscela.
• Effetto bordo: salita non uniforme della fase mobile dovuta alla non uniformità della fase stazionaria o alla cattiva saturazione della camera di eluizione. Effettuare la semina in modo che gli spot siano più centrali e lontani dai bordi per rendere meno probabile la presenza di questo effetto.

N.B. Una sostanza molto polare (come gli acidi carbossilici) non dà macchie tonde regolari, ma l’effetto strisciata perché l’analita abbandona con difficoltà la fase stazionaria.

TLC bidimensionale

Viene usata per miscele complesse (come amminoacidi) - viene usato un solo eluente e non permette di avere una risoluzione ottimale. La TLC è quadrata e la semina viene fatta di lato in un angolo (seminare un singolo spot). Possiamo verificare se ciascuna delle macchie contiene al suo interno ulteriori altre sostanze: giriamo di 90° la lastrina, si possono così eluire ulteriormente le macchie ottenute con un eluente diverso. Una TLC bidimensionale viene usata quando si pensa che quella sostanza con la TLC normale viene degradata. Quindi permette anche di verificare se nella miscela sono presenti sostanze che decompongono durante lo sviluppo cromatografico, come ad esempio composti sensibili agli acidi in gel di silice. In questo caso la TLC viene sviluppata con un determinato eluente, ruotata di 90° ed eluita nuovamente con lo stesso eluente. Se le macchie non appaiono tutte in diagonale significa che c’è stata decomposizione. Se le macchie appaiono extra diagonali ci indica il fatto che probabilmente la sostanza si degrada in gel di silice (dovremo cambiare la fase stazionaria).

TLC preparativa

Vogliamo isolare una sostanza da un quantitativo di miscela. Lastra di vetro (20x20 cm) come fosse TLC con strati di adsorbente più spessi nelle quali è possibile seminare 15-100 mg di miscela a seconda dello spessore della fase stazionaria (0,5-2 mm). La semina viene fatta con l’aiuto di una pipetta e non viene fatta in punto ma lungo una linea tracciata a qualche centimetro dal bordo inferiore della lastra. Otteniamo una separazione in bande - con pazienza si scalfisce la fase stazionaria dal supporto di vetro per andare a recuperare quello che è il nostro prodotto di interesse. Questa polvere viene trattata con un opportuno solvente che è in grado di sciogliere la mia sostanza (ma non il gel di silice), poi filtriamo e in questo modo tiriamo a secco (evaporiamo il solvente) e abbiamo recuperato la sostanza interessata.

N.B. questo tipo di TLC è molto importante se si hanno quantità piccole, infatti per quantità maggiori vengono utilizzate colonne cromatografiche. Differentemente dalla TLC analitica dove noi vediamo il risultato e lo buttiamo, qui abbiamo recuperato la sostanza che è di nostro interesse.

Posso ottenere informazioni quantitative da un’analisi TLC? Le dimensioni e l’intensità dei punti possono essere utilizzate come misura approssimativa delle quantità relative delle sostanze. Questi parametri possono essere fuorvianti, tuttavia, specialmente con la visualizzazione fluorescente. Alcuni composti organici interagiscono molto più intensamente con le radiazioni ultraviolette rispetto ad altri, facendo apparire un punto più concentrato di un altro quando ciò potrebbe non riflettere le loro quantità relative. Le informazioni quantitative non sono uno dei punti di forza della cromatografia su strato sottile.

È possibile analizzare i composti volatili mediante TLC? Un campione liquido con un punto di ebollizione minore di 160° C può evaporare dalla piastra TLC prima che la piastra venga visualizzata.

Criteri di purezza

Come si fa a capire se una sostanza è pura? Se sottoposta a continui e ripetuti processi di purificazione presentano valori invariati, valori di tutte le sue grandezze fisiche caratteristiche.

“Un composto è considerato puro quando il tenore delle impurezze che contiene è minore al limite di sensibilità dei sistemi analitici impiegati per rivelarla”.

• Quando bisogna controllare la purezza di una sostanza?
• Per sostanze che vengono sintetizzate o isolate da estratti;
• Per verificare la conservazione di sostanze che si degradano nel tempo;
• Per verificare il grado di purezza di campioni commerciali.

Pochi milligrammi di sostanza e in poco tempo sono le caratteristiche che caratterizzano tale processo.

Controllo della purezza

Quando pubblichiamo i nostri lavori, magari la sintesi di una nuova molecola, dobbiamo dichiarare che quella sostanza che abbiamo sintetizzato, che è stata sottoposta ad un test farmacologico, è pura oltre il 95%. Fino a poco tempo fa questa era la maniera attraverso la quale ci si chiedeva di dimostrare che quella sostanza era pura oltre questo determinato valore.

L'analisi elementare è quella metodologia attraverso la quale, da una sostanza, riusciamo, con un opportuno sistema di combustione, a determinare con specifiche sostanze il suo contenuto di carbonio, idrogeno, da cui poi è possibile determinare la formula bruta ai fini identificativi. Ma questa stessa tecnica analitica è anche in grado di darmi una valutazione della purezza perché se io so esattamente che la mia sostanza deve contenere 20% di carbonio, 3% di idrogeno e così via e so che la mia sostanza è quella, se faccio l'analisi elementare e questa percentuale non torna rispetto al teorico, significa che la mia sostanza non è pura - prova regina.

Limiti dell’analisi elementare: se abbiamo una miscela racemica, una coppia di enantiomeri che avranno la stessa formula bruta è ovvio che l’analisi elementare non sarà capace di dirci se è uno o l’altro. Se abbiamo degli isomeri di posizione che hanno la stessa formula bruta, ancora una volta, l’analisi elementare non ce lo dice.

Controllo della purezza:

• Punto di fusione per solidi cristallini.
• Punto di ebollizione per sostanze liquide.
• Indice di rifrazione per sostanze liquide.
• Potere rotatorio specifico [α] per composti chirali: In questo caso la purezza viene vista in una miscela di enantiomeri per verificare quello che è l’eccesso enantiomerico (l’impurezza dovuta agli enantiomeri).