Appunti di Istologia

Istologia

Introduzione all'istologia e anatomia

Più tessuti formano gli organi, i quali collaborano a formare un apparato, che contiene organi anche molto diversi tra loro, ma preposti alla stessa funzione e obiettivo. Lo studio dei tessuti è l'argomento dell'istologia, mentre la loro aggregazione in organi e apparati è parte dello studio dell'anatomia.

I primi studi risalgono al 1520, grazie a diversi e semplici strumenti che permisero di definire i tessuti fondamentali. Nel 1665 fu inventato il microscopio da Hooke, il quale per primo utilizzò la definizione di "cellula", dopo aver identificato con il microscopio da una fettina di sughero.

Nel 1770 Bichat eseguì delle dissezioni attraverso cui definì 21 tessuti primitivi diversi tra loro. In realtà i tessuti fondamentali sono solo 4, da cui successivamente si diramano le ulteriori ramificazioni. Nel 1810 Koelliker affermò che tutte le cellule derivano dalla cellula uovo, in un periodo in cui vigevano teorie bizzarre.

Nel 1830 Schwann e Schleiden definirono la prima teoria cellulare: "la cellula è l'unità fondamentale, non ulteriormente scomponibile", ma con alcune concezioni errate come la riproduzione cellulare dovuta a "gravidanza della cellula".

Caratteristiche delle cellule

Le cellule, unità morfologiche e funzionali fondamentali degli organismi viventi, che costituiscono i tessuti umani sono cellule eucariotiche, rivestite da una membrana plasmatica che delimita il citoplasma (con matrice citoplasmatica o ialoplasma e organuli). Alcune cellule sono dotate di specializzazioni apicali, come i microvilli.

Gli elementi hanno diverse dimensioni: per descrivere le strutture istologiche utilizziamo grandezze come i nanometri (10^-9) e i micrometri (10^-6).

Principio di Ruffini

La trattazione dell'istologia e dell'anatomia va riferita al principio fondamentale di Ruffini (XIX-XX secolo) per cui "la forma è l'espressione plastica della funzione", immaginando la funzione svolta da un preciso dispositivo biologico correlata con la sua forma più adatta. Un neurone, per esempio, con i suoi prolungamenti ha una forma adatta a ricevere e trasmettere informazioni. Una cellula muscolare, invece, ha una forma allungata, poiché la contrazione muscolare è tanto più efficiente quanto più una cellula è lunga e, quindi, si può accorciare.

Nel caso delle cellule epiteliali, queste possiedono tutte una forma regolare, poiché tendono ad allinearsi formando giunzioni che ancorano le cellule tra loro (es. epiteli di rivestimento che ricoprono una superficie corporea). Altre cellule hanno, invece, forme più bizzarre: gli spermatozoi, ad esempio, hanno una forma allungata e una coda che permette loro di muoversi agilmente.

• Cerca foto di: linfocita, condrocita, cardiocita

Variabilità della forma cellulare

La forma cellulare può variare in funzione di:

• Ambiente: se liquido causa una forma sferica
• Funzione: es. emazie hanno forma concava, neuroni hanno forma ramificata, cellule epiteliali sono regolari.
• Tempo: propaggini ameboidi, secrezione
• Differenziamento: gli eritrociti, per esempio, nascono da cellule staminali nel midollo osseo, ricche di organelli e con nucleo; man mano che procedono nel loro differenziamento cambiano la loro forma, arrivando ad avere una struttura priva di nucleo.

Quando una cellula è alterata, dobbiamo considerare vari parametri. Una cellula, pur rimanendo normale, può cambiare forma nel caso in cui venga posta in un altro ambiente.

Legge di Driesch

Il volume delle cellule è:

• Costante per ciascun tipo cellulare nell'ambito della stessa specie o di specie affini. Organi di diverse dimensioni possiedono diverso numero di cellule, e non cellule più grandi.
• Indipendente dalle dimensioni dell'organismo. La diversa dimensione degli organismi dipende dal numero di cellule presenti.

Neuroni, cellule muscolari sono delle eccezioni: alcuni tipi cellulari, infatti, non rientrano nella legge delle dimensioni costanti.

Esistono cellule che normalmente possiedono più nuclei (cellule polinucleate), come i sincizi (derivano dalla fusione di più elementi singoli posti in correlazione tra loro, come le fibre muscolari statte scheletriche - osteoclasti) e i plasmodi (si formano con modalità diversa: separazione del materiale genetico ma senza citodieresi, dando origine a un’entità polinucleata come il megacariocita, grossa cellula che si trova nel midollo osseo e da origine alle piastrine), i cui diversi nuclei controllano la diversa distribuzione di citoplasma.

Tecniche di studio delle cellule e tessuti

Quando si studiano cellule e tessuti si utilizzano tecniche diverse. Nel caso di cellule e tessuti viventi, queste vengono coltivate all’interno di un incubatore con temperature costanti (37°C) e percentuali costante di CO₂ (5%). In questo caso, però, non posso utilizzare dei coloranti per evidenziare parti specifiche, in quanto la maggior parte dei coloranti uccidono le cellule.

Un altro metodo consiste nell’osservazione dei preparati cito-istologici fissati e colorati. Per preparare un vetrino possono insorgere dei problemi:

• I tessuti vanno incontro a processi degradativi e alterazioni della struttura. Il tessuto deve, quindi, essere preservato dalle alterazioni di struttura e dai processi putrefattivi.
• La luce del microscopio ottico e il fascio di elettroni del microcopio elettronico possono attraversare solo materiale di spessore molto ridotto. Il tessuto deve essere sezionato in fettine molto sottili (5-20 micrometri) con specifici apparecchi detti microtomi o ultramicrotomi (70 nm di spessore).
• I tessuti biologici sono in genere molli. Per poterli tagliare, quindi, devo indurirli mediante inclusione, la quale prevede che il campione sia tutto infiltrato con una cera che a temperatura ambiente è solida, o congelamento.
• I tessuti normalmente sono quasi incolori e privi di contrasto. Prima dell’osservazione al microscopio il tessuto deve essere colorato o contrastato. I coloranti con affinità diverse per i componenti cellulari e tissutali possono essere combinati nella stessa sezione istologica.

Procedura per il prelievo dell'organo

1. Fissazione: blocca tutti gli eventi putrefattivi dovuti all’attivazioni di enzimi litici e il blocco di infezione. Il campione viene "ucciso", preservando la sua integrità morfologica. Blocca i processi di degenerazione del tessuto prelevato rendendolo stabile nel tempo ed inalterabile all’azione dei successivi trattamenti. Può essere:
   • Fisica: a temperature molto alte o molto basse, congelamento rapido in N₂ o -30°C. Calore.
   • Chimica: sostanze chimiche (perfusione, ovvero sostituire nei vasi sanguigni il sangue con fissativi, immersione, con vapori). Formaldeide e glutaraldeide.
2. Inclusione: con paraffina (idrofoba, cera come quella delle candele che si scioglie a circa 60°C) o in resine sintetiche che conferisce al campione biologico la consistenza necessaria per essere sottoposto al sezionamento. Devo disidratare il tessuto pucciando il frammento in scale crescenti di alcol (70% - 90% - 100%) al fine di disidratarlo. In seguito, eseguo chiarificazione e infiltrazione, ovvero l’immersione in un solvente ei mezzi di inclusione (xylene e acetone) e sua sostituzione con il messo di inclusione in forma liquida. Taglio delle sezioni del mio campione ottenendo sezioni con paraffina e al centro il campione, a sua volta infiltrato di paraffina. Dovrò quindi svolgere ulteriori procedure per poterlo colorare. Se dobbiamo preparare un campione da analizzare al microscopio elettronico non utilizzo la paraffina, ma delle resine.
3. Taglio: mediante microtomi o ultramicrotomi, simili ad affettatrici. Questi sono costituiti da una lama e una manopola che permette di far scivolare il blocchetto di paraffina lungo la lama. Le sezioni molto sottili permettono il passaggio delle onde luminose o del fascio di elettroni. Ottengo delle fette con al centro la sezione istologica. Se, invece, ho congelato il tessuto, si utilizza il criostato per eseguire il taglio. Questo permette di mantenere il campione a -20°C.
4. Colorazione: le diverse strutture protoplasmatiche vengono impregnate con sostante coloranti. I coloranti per MO sono di solito in soluzione acquosa, quindi le sezioni devono essere sparaffinate (tolta la paraffina) in xitolo e reidratate con scala decrescente di alcool (100% - 90% - 80% - 70% - 50% - H₂O). La colorazione si svolge sotto cappa con diversi solventi. Per la microscopia ottica i tessuti assumono i coloranti in base alle caratteristiche delle strutture che li compongono. Due categorie di coloranti:
   • Acidi (es. eosina) colorano i componenti acidofili come le proteine, i quali hanno affinità per i componenti basofili.
   • Basici (es. pironina, verde di metile, blu di metilene, blu di toluidina) colorano i componenti basofili, come il DNA, i quali hanno affinità per gli acidi.
   • Colorazioni complesse: comprendono più coloranti nella stessa procedura (es. tricromica di Mallory).
   La colorazione di base sono l’ematossilina, in grado di colorare i nuclei, e l’eosina, la quale permette di mettere in luce il citoplasma. Altre colorazioni più specifiche permettono di mettere in luce particolari parti della cellula, come per l’impregnazione argentica (salid’argento + sostanza riducente → liberazione di Ag metallico che si deposita sulle strutture biologiche argentofile). Il tetrossido di osmio permette di ossidare i grassi del tessuto e formare una sostanza nera o marrone scuro che è facilmente osservata al microscopio ottico. Se uso colorazioni diverse ottengo informazioni diverse: uno stesso componente cellulare può assumere diversi colori a seconda delle colorazioni che ho eseguito (la colorazione è variabile!).
5. Montaggio: il vetrino per essere preparato in modo permanente devo montarlo. Il mezzo per montare il vetrino, la colla, è idrofobico, quindi devo disidratarlo nuovamente.

Esistono processatori automatici, in cui si mettono i campioni che interessano, coloratori automatici e montatori automatici.

Per preparare vetrini con il sangue la metodologia è differente, poiché è liquido. Si esegue uno striscio, vale a dire una goccia di sangue periferico viene strisciata e lasciata asciugare a secco.

Immunoistochimica e immunofluorescenza

Per studiare l’espressione di una certa proteina in un particolare tessuto utilizzo anticorpi in grado di riconoscere in modo specifico una certa proteina. L’anticorpo y si lega alla sua specifica proteina se questa è presente e avrà legato un anticorpo x. L’anticorpo secondario y è legato a un sistema di riconoscimento, il quale permette di rilasciare un segnale in presenza della proteina, segnale che può essere, appunto, una colorazione.

Utilizzando il microscopio posso guardare oggetti di dimensioni molto piccole, ma anche aumentare il potere di risoluzione (diverso dal potere di ingrandimento) dei nostri occhi. La risoluzione è, infatti, correlata alla qualità dell’immagine.

Due oggetti molto piccoli e molto vicini non sono risolti se non capisco che sono separati tra loro. Se, invece, questi oggetti riesco a distinguerli come separati, allora il campione è risolto. Il potere di risoluzione, infatti, è definito come la possibilità di vedere distintamente due punti molto vicini. Nell’occhio umano il potere di risoluzione è di 0,2 mm, nel microscopio ottico è di 0,2 micrometri e nel microscopio elettronico di 0,0002 micrometri (0,2 nm). Il potere di risoluzione è calcolato attraverso la formula di Abbe: R = λ / (2 NA) dove:

• λ: lunghezza d’onda
• n: indice di rifrazione del materiale posto tra l’oggetto e l’obiettivo
• α: metà dell’angolo di apertura dell’obiettivo

La capacità di un obiettivo di catturare i raggi di luce deviati dal campione dipende da:

• NA (apertura numerica)
• n: indice di rifrazione del mezzo attraverso cui passa la luce

Si utilizza un olio per aumentare il potere di risoluzione. Al microscopio elettronico non si utilizzano coloranti, ma dei metalli pesanti che interagiscono in maniera differenti: le strutture che si presentano nere sono elettrondense (molti elettroni attaccati), mentre le strutture più chiare sono elettrontrasparenti (hanno meno elettroni attaccati) e sono attraversate dal fascio di elettroni. È comunque possibile colorare successivamente con coloranti artificiali. Diverse tecniche corrispondono a diverse prospettive: una stessa struttura può avere aspetti diversi a seconda della metodologia che si utilizza.

Con il microscopio elettronico a scansione SEM vedo la forma delle cellule tridimensionalmente, non i suoi componenti.

• Campo chiaro
• Contrasto di fase/Nomarski (differential interference contrast): mi permette di vedere la struttura tridimensionale della cellula. Uso i fluorocromi, molecole che, eccitate da una radiazione luminosa, in parte l’assorbono e in parte la restituiscono ad energia minore e lunghezza d’onda maggiore. Uso degli anticorpi che portano il fluorocromo collegato. Alcune sostanze, invece, in natura sono autofluorescenti. Esistono sostanze dette fluorocromi che sono fluorescenti. Una sostanza viene eccitata a una certa lunghezza d’onda ed emette fluorescenza a una lunghezza d’onda diversa, di inferiore energia rispetto a quella che l’ha eccitata.
  1. Eccito un fluorocromo e un elettrone sale di orbita
  2. L’elettrone torna spontaneamente a un orbitale di energia inferiore ed emette energia sotto forma di luce

Combino colori diversi per molecole diverse. Eccito a una certa lunghezza d’onda; emette a un’altra lunghezza d’onda diversa. Es. Se eccito nel blu, la luce bianca è di tutti i colori. Metto un filtro che seleziona la luce blu e ottengo una luce verde. Per GFP si intende la Green Fluorescent Protein, ovvero una proteina spontaneamente fluorescente. Questa è vantaggiosa poiché è possibile coniugarla con altre proteine, formando delle chimere. Scoperta la GFP di vari colori. Introducendo nella GFP singoli amminoacidi si possono avere emissioni diverse e quindi diversi colori.

Microscopia confocale

Al posto del raggio luminoso utilizza un laser, il quale permette di ottenere delle sezioni del preparato, ottenendo immagini tridimensionali di alta qualità. È un tipo speciale di microscopia ottica. Con la microscopia ottica vedo tutta la cellula nel suo insieme, e sarebbe difficile identificare strutture particolari. Nel caso fosse utile focalizzarsi su una specifica parte della cellula uso il microscopio confocale, che permette di vedere un determinato piano della cellula. L’illuminazione avviene tramite laser e la luce prodotta viene riflessa in modo da mettere a fuoco un punto preciso della cellula.

1. Emissione della fluorescenza concentrata grazie a speciali filtri affinché venga focalizzata in un buco. L’emissione altrove non viene raccolta; l’unico punto dove raccolgo l’emissione è quello del piano focale. Sfrutto specchi dicroici.

Il vantaggio di questo sistema è che posso avere una maggiore risoluzione in grado di mostrarmi le strutture cellulari e offre la possibilità di raccogliere i più piani individuati che poi posso ricostruire.

Istologia (9/03/2018) + (13/03/2018)

Struttura dei tessuti

Tutti i tessuti contengono sia cellule sia una matrice extracellulare, con quantità diverse a seconda del tessuto che stiamo prendendo in considerazione. Molti organi possono essere suddivisi in un parenchima, costituito dalle cellule responsabili dello svolgimento delle funzioni principali specifiche dell'organo, e in uno stroma, ovvero il tessuto di sostegno, quasi sempre costituito da tessuto connettivo con l'eccezione dell'encefalo e del midollo spinale.

I tessuti fondamentali

Si riconoscono quattro tessuti fondamentali definiti dall'istologia, con caratteristiche morfologiche e derivazione embrionali diverse:

• Epiteliale: prevede la presenza di cellule e di una scarsa matrice extracellulare. Ha la funzione di rivestire cavità, la superficie corporea e di produrre dei secreti. È costituito, infatti, da cellule poliedriche aggregate strettamente attaccate mediante giunzioni, formando delle lamine che ricoprono superfici e tappezzano cavità o aggregati per la secrezione di sostanze, come le ghiandole. Caratterizzati da cellule fittamente stipate con poca matrice extracellulare interposta. Lo spazio extracellulare è molto ridotto, tra i 15 e i 30 nm, talmente piccolo che non è apprezzabile al microscopio ottico. Le cellule sono strettamente adese, connesse da giunzioni. Hanno un dominio basale aderente ad una membrana basale, un dominio laterale e una parte apicale che può presentare strutture specializzare. Sulla zona apicale presentano una superficie libera. Si ha, quindi, una polarità morfologica: gli organelli non sono organizzati in maniera casuale all’interno di queste cellule, ma in modo polarizzato, influendo sull’aspetto che questa assume. La membrana avrà diverse funzioni, caratteristiche biochimiche e morfologiche nelle porzioni basale, laterale e apicale. Se le cellule possiedono specializzazioni apicali, come i microvilli, queste possederanno filamenti di actina con parti finali dette terminal web (rete che sta subito al di sopra della membrana plasmatica apicale). Nelle cellule epiteliali vi sono anche filamenti intermedi (o tonofilamenti), coinvolti nella formazione delle giunzioni e nella stabilità di queste, contribuendo alla loro stabilità. La polarità morfo-funzionale diventa evidente se abbiamo un solo strato di cellule. Vi sono diversi tessuti epiteliali nel corpo, con diversa derivazione embrionale:
  • Ectoderma: epidermide (superficie corporea), epitelio della cornea e del cristallino, epitelio della mucosa orale e anale, ghiandole sebacee, sudoripare e mammarie, smalto dei denti (tessuto mineralizzato)
  • Endoderma: epitelio delle mucose (es. tubo digerente) e ghiandole annesse (es. fegato) (tranne mucosa orale e anale)
  • Mesoderma: e