Ingegneria Cellulare

(stiamo spacciando il nostro vettore come una sequenza “natuale” della

cellula, così l’RNAsi non degraderà il trascritto).

VETTORE D’ESPRES PER PROTEINE DI FUSIONE FLUORESCENTI:

clonaggio con ER,

classico

PUC ori: origine di

replicazione dal

PUC18

CMV: prom

MCS

SV40polyA: seq di

poliadenilazione

NeoR: resistenza

neomicina

KanR: resist

kanamicina

mCherry: unità di

trascrizione di una

prot fluorescente

(rossa)

Nota: più il fluoro

cromo emette

luce, meno colore

si sviluppa.

Generiamo una proteina di fusione. Tali sistemi sono utili per la

selezione/quantificazione delle proteine.

Con il vettore in analisi, la prot di fusione ha il tag fluorescente al C-

terminale. È fondamentale la scelta della posizione del tag (evito il

terminale che rende la funzionalità della proteina).

COME ESPRIMO la prot con tag fluorescente? Con CLONAGGIO in

FRAMEnon c’è seq di stop tra le due seq, al termine del codone di

espressione della prima proteina segue immediatamente quello d’inizio

della seconda proteina.

TRASFERIMENTO GENICO IN CELL EUCARIOTICA

Inserire DNA in una cell eucariotica non è semplice. L’apparato di difesa

della cell è costituito dalle DNAsi, che degradano DNA esogeno: questo è il

destino della maggior parte del DNA trasfettato nelle cellule.

Ecco perché il sub clonaggio in E.coli è fondamentale! Più μg di DNA

 aumentano la possibilità che la trasfezione avvenga.

Quello che faccio è letteralmente saturare il sistema lisosomico, così da

permettere ad un po’ di DNA esogeno di essere espresso.

Questa caratteristica differenzia le linee primarie dalle secondarie.

 Nelle primarie l’attività lisosomica è molto alta, mentre le secondarie

hanno subito già molte modificazioni. È diversa quindi la capacità di

trasformazione.

Le linee primarie presentano

- ambiente extracellulare: MATRICE, un coating naturale della

superficie di crescita. Le secondarie hanno solo la membrana

cellulare.

- Elevate attività di DNAsi

- Elevata refrattarietà all’endocitosi del complesso DNA/agente

trasfettante

Come si riflette questo sull’efficienza di trasfezione? Ovviamente è più

elevata per le secondarie. La differenza è che c’è

miglioramento dell’efficienza di

espressione di proteine..

Expr di Espressione di prot in ovociti di Xenopus



prot Metodo nato negli anni 60

ricombi  Vantaggi: sono cellule molto grandi, visibili ad occhio nudo, con

n anatomia ben precisa, si conosce persino la disposizione dei suoi

anti in ribosomi

ovociti Overview:

di - DNA plasmidico  linea rizzato  trascritto in vitro  c RNA (stabile)

xenop - Espianto di ovociti  inserimento di cRNA nell’ovocita  espressione di

us proteina  saggi biofisici

 Questa tecnica è particolare perché inseriamo in cellula il trascritto

che ci renderà la traduzione, mentre di solito usiamo un vettore che

verrà trascritto e poi tradotto. Non passiamo dal nucleo! Abbiamo già

RNA, per cui rimaniamo nel citoplasma.

 Tuttavia non può essere usata per l’espressione proteica massiva,

quindi per scopi di ricerca, non industriali

PER QUESTA TECNICA:

- Estrazione ovociti. Estrazione chirurgica da rane anestetizzata; gli

ovociti sono poi mantenuti in soluzione isotonica rispetto al

citoplasma dell’ovocita.

- Devo anzitutto scegliere il gene in cui intercalare la mia seq

eterologa. Prendo di mira il gene della beta-globina, che è un

trascritto molto stabile. Così uso quelle seq, inserendo il mio gene

eterologo +

seq UTR, al

fine di

ottenere un

trascritto

stabilissimo.

Cloniamo quindi

l’aquoporina4

umana

(sottoforma di

cDNA), il nostro

gene eterologo,

nel vettore pGEMHE, il nostro vettore. Linea rizziamo con Xbal.

- Trascrizione in vitro, con metodica mMessage mMachine KIT. Come

inserisco il CAP se è una trascrizione fatta in vitro? Uso una molecola

smile (NTP/CAP, miscela di nucleotidi e cap) al primo nucleotide inserito

dalla DNA pol: la 7 guanosintrifosfato (m7g), non una GTP. questa è

chimicamente analoga al primo nucleotide di un cap fisiologico.

(è come se prendessi in giro la DNApol e posso dare un CAP alla molecola)

Metodo: inserisco analogo al cap (m7g) ad una concentrazione

molto più elevata rispetto all’analogo GTP (1GTP:3m7G). Così la

cellula ha più probabilità di occupare l’m7G e di metterlo come primo

nucleotide del cap.

Così ho un cap funzionante per la tecnica.

- Trasfezione. Dobbiamo immettere l’RNA nell’ovocita, lo facciamo

con microiniezione. Dato che l’ovocita è la macchina utile ad

esprimere i geni materni e paterni, è ricolma di ribosomi. In qualche

qual modo il nostro trascritto troverà ribosomi disposti alla

traduzione! [l’ovocita si distingue

in polo animale e

vegetale. Al centro,

proprio nella fascia

centrale, c’è alta

concentrazione di

ribosomi. Con il

capillare da

microiniezione

dobbiamo proprio

centrare questo

punto. Evitiamo altre

zone; per esempio, il

polo vegetale è

ricolmo di lipidi.

Inserire il trascritto in questa zona significa farlo rimanere isolato e

inutilizzabile.

-Saggi biofisici: ovociti iniettati con il nostro trascritto vengono

confrontati con ovociti iniettati d’acqua. Inseriamo entrambi in una

soluzione di MND 96 isotonico. Con il passare del tempo, diluiamo 3

volte in acqua il mezzo. Osserveremo che il nostro ovocita si gonfierà

a causa della differenza di pressione osmotica.

[cinetica di swelling?]

Svantaggi/limiti: per ottenere l’espressione devo usare tantissimi ovociti, e i

sistemi sono piuttosto grezzi.

L’esperimento può avere successo su 20-30 ovociti su 200 di partenza: non

è un metodo efficiente al massimo.

Expr in Espressione proteica massiva in cellule d’insetto

cell di - Le cell di mammifero hanno costi elevatissimi per la trasfezione

insetto transiente (per ex le HEK). Questa situazione non può essere

trasposta in una produzione industriale. Una via di mezzo è l’uso di

cell di insetto, come la Spodoptera frugiperda  infettata con

baculovirus come vettore di espressione.

- Spodoptera frugiperda: insetto erbivoro, mangia foglie su cui il

baculovirus forma strutture complesse di poliedrina. Questi ammassi

proteici vengono lasciati da insetti già infetti, e quando un nuovo

insetto ingurgita gli ammassi, viene a sua volta infettato dal

baculovirus.

- Baculovirus come vettore di espressione.

 Alto livello di espressione genica (fino al 50% delle proteine totali

cellulari), e le prot espresse sono nella maggior parte dei casi solubili

e funzionali

 Permette modificazioni post-traduzionali (fosforilazione, corretto

folding, ponti disolfuro, glicosilazioni…)

 Facili da fare scale-up, dato che le cell di insetto sono semplici da

mantenere come sospensione cellulare (in confronto con quelle di

mammifero)

 Sistema eucariotico più economico tra tutti

Schema infezione da baculovirus

1. Viene ingerito dall’insetto sottoforma di ammassi di poliedrina

2. Dispersione della matrice proteica attorno al virus, che è libero nello

stomaco dell’ospite

3. Fusione con membrana cellulare ed endocitosi del virus

4. Le matrici proteiche rimaste sono degradate dalle proteasi lisosomi

che, questo permette ai singoli virus di essere del tutto liberi

5. Entrata nel nucleo, uncoating e replicazione

[infezione primaria, per replicazione]

6. La replicazione permette a nuovi virus di uscire dal nucleo, ed

uscendo dalla membrana plasmatica assumerano l’envelope

7. Si crea il budded virus (“germogliato”)

[infezione secondaria, tardiva]

8. Nell’espressione del virus rientra anche quella della poliedrina, che

viene rilasciata nell’intestino dell’insetto

9. La presenza di poche peptidasi nell’intestino fa sì che questa proteina

rimanga attiva

10.Espulsione della poliedrina e nuova infezione

Visto il ciclo di infezione, per l’espressione della nostra proteina dovremo

aspettare l’infezione II, tardiva. Il nostro obiettivo è quello di sostituire la

seq della poliedrina con il gene eterlogo di nostro interesse, sfruttando il

promotore della poliedrina. Come creo virus ricombinanti?

- TEMPO FA: sono presenti due geni in baculovirus, di cui uno è

fondamentale. Taglio enzimatico tra i due (Bsv36I) e faccio ligazione

con la mia CDS eterologa. “ricucio” il tutto e il vettore è pronto. Con

tale metodo, i virus ottenuti sono sicuramente ricombinanti.

- ADESSO:

1. Creo plasmide donatore

2. Creo il bacmide ricombinante in E.Coli DH10BAC

3. Trasfettare cellule sf9 con il bacmide ricombinante

4. Recuperare virus ricombinanti dopo 3-7 gg

5. Titolare i virus (pfu/ul) (unità formanti placche/vol di cell totali)

6. Infettare con i virus ricombinanti le cell di insetto Sf9 utilizzando un

preciso MOI (moltiplicty of infection)

7. Valutare i livelli di espressione della proteina di interesse e la sua

funzionalità

Nota: MOI, quanti virus devono infettare una cellula? Se i virus sono 10 e le

cell 5, la MOI è di 2. Questo valore dipende dalla situazione. Per il nostro

esperimento, da 2 a 10 virus per cellula è consono (non troppi, altrimenti la

cell muore). Questo valore viene dedotto sperimentalmente, anche perché

dipende dalla proteina che stiamo esprimendo.

OVERVIEW DEL PROCESSO

1. Abbiamo il nostro plasmide ricombinante donatore, con seq

direzionali ai lati (Tn7R – per la transposizione)

2. Transposizione della mia CDS su bacmide (in cellule competenti DH

10BAC). Questo evento avviene in presenza di un plasmide

helper,che catalizza la tansposizione

3. Il BACmide è usato per trasformazione di E.coli

4. Seleziono duramente con 3 antibiotici + selezione per beta-

galattosidasi, in modo da rendere un prodotto corretto

5. Selezioniamo gli E.coli positivi ed estraggo il BACmide ricombinante

per passarlo in cellule di insetto (Sf9)

6. Infezione di cellule di insetto con virus ricombinanti

7. Espressione della proteina d’interesse + replicazione del virus

Nota: i virus devono essere titolati, per valutare quanta proteina otterremo.

Per ottenere proteine nell’ordine dei mg, devo usare virus nella singola

9

cellula dell’ordine di 10 . Se dovessimo avere una concentrazione più bassa

6

di virus (10 ), posso ‘amplificare’ il virus.

Prendo i 106 virus e infetto 10 milioni di cellule. La MOI è di 0,1. Su 10

cellule, 1 è infetta. Questa produce ulteriori virus attivi, che infettano le

restanti 9. Dopo un certo periodo di incubazione avrò una buona infezione 

e quindi una concentrazione ottimale di virus.

[mi conviene partire da valori di virus più bassi se voglio amplificarli]

PLASMIDE DONATORE PLASMIDE HELPER

-Origine di replicazione -TetR (tetraciclina) (se la cellula è

-AmpR (per replicazione in batterio) resistente alla tetraciclina, allora

-pUC origine di replicazione (per presenta questo vettore)

replicazione in batterio)

-Tn7R/L: right /left

-GenR: gentamicina (la gentamicina è

compresa nell’unità che verrà trasposta

per ricombinazione omolga)

-Prom poliedrina

-MCS

-SV40 poliadenilazione il più diffuso

baculovirus:

Autographa cali fornica

multicapsed

nucleopolyhedrovirus

(AcMNPV).

STRATEGIA PER LA

PRODUZIONE DI VIRUS

RICOMBINANTI IN UN

OSPITE BATTERICO

TRANSGENICO

1. Si crea per

ricombinazione

omologa un

ceppo batterico

contenente un

plasmide

ricombinante (BACmide, con la resistenza alla kanamicina) e un

fago helper che codifica per la ricombinasi (resistenza alla

tetraciclina

)

2. Si

costituisce

un plasmide

donatore

3. Si trasforma

con il

plasmide

donatore le

cellule

DH10Bac

(lacz+,

KanR, TetrR)

Nota: lacZ

presenta

all’interno il sito

per la

ricombinazione.

Quando questa

avviene, la beta

galattosidasi non è

più espressa!

Quindi cerchiamo

cell lacz-. Al suo

posto viene

inserita la

gentamicina.

4. Si

selezionano

le colonie

con Bacmide ricombinante (Lacz-, GmR, KanR, TetrR) su piastre con i

tre antibiotici + IPTG + XGAL

Nota: NON l’ampicillina! Perché tutti i vettori usati ce l’hanno. Se

procedessimo con questa selezione ci ritroveremmo solo il bacmide WT. Mi

accorgo di questa situazione con una PCR.

5. Recupero il bacmide ricombinante (dimensioni 100 kb circa), con un

grado di purezza compatibile con la trasfezione (non ci devono essere

endotossine). Questa purificazione del BACmidico ricombinante

avviene mediante resine a scambio ionico (NON resine silicee, perché

queste non sono adatte alle dimensioni del bacmide. Al massimo

20Kbp)

6. Progetto una PCR in modo da discriminare in modo univoco se

l’inserzione della CDS è avvenuta o no. Il prodotto dell’amplificazione

con inserto da 2400 basi sarà in totale da 3200 basi circa, mentre il

WT ha circa 300 basi.

7. Una volta confermata la trasposizione, si utilizza il bacmide

ricombinante per trasfettare le cell di insetto Sf9 e si procede con la

raccolta di virus ricombinanti. Fondamentale è la titolazione, in

multiwell su monolayer (con matrice, mezzo di coltura, e agarosio).

Ottengo: una well in cui il virus è assente, quindi le cellule sono vive.

Per le altre well, inserisco una alta concentrazione di virus, poi

estraggo la sospensione e la diluisco per ogni well, fino ad arrivare a

10^-7.

Dopo alcuni giorni vado a osservare le placche formate. La well in cui

ci sarà una sola placca determinerà il titolo, in questo caso 10^-7

pfu/ml. In tal modo posso rispettare la MOi per l’amplificazione e

l’espressione.

Nota: come faccio a sapere se la proteina funziona? Dioi 24/48h di infezione

per l’espressione, estraggo le cell, purifico la prot di interesse e la

trasferisco su filtro di nitrocellulosa. Con un Immunoblotting (dotblot),

utilizzando anticorpo, potrò valutare rapidamente i livelli di espressione.

Exp in I lieviti sono eucarioti abbastanza articolati, quindi permettono di esprimere

lieviti prot anche complesse.

S.cerevisiae Svantaggi

Vantaggi • Resa piuttosto bassa: 5% delle proteine totali

• GRAS (Generally Regarded As Safe); non • Controllo dell’ espressione genica meno

patogeno per l’uomo e approvato dall’FDA facile (non ci sono sistemi

• Manca di endotossine repressione/induttori ma solo induttori)

• Genetica nota: sono disponibili plasmidi, • Perdita del plasmide

linee cellulari ingegnerizzate e può essere • Manipolazione dei plasmidi per lieviti

trasformato complessa

• Sono disponibili promotori forti • Sono disponibili pochi plasmidi di clonaggio

• Fermentazioni con lieviti relativamente • Glicosilazione in lieviti non è identica alla

ecomoniche; processi di produzione su larga glicosilazione in mammiferi

scala sono noti e ben studiati • Proteine ricombinanti eterologhe spesso

• Solo 0.5% delle proteine native sono escrete: trattenute nello spazio

facilitazione nell’isolamento della proteina periplasmatico: downstream process

ricombinante secreta complessi

• Possiede compartimentazione cellulare

che permette modificazioni post-

traduzionali

P.pastoris

Vantaggi Svantaggi

• Tutti i vantaggi di S. cerevisiae: •Manipolazione dei

– GRAS (Generally Regarded As Safe) plasmidi complessa

– approvato dall’FDA •Glicosilazione in lieviti

– manca di endotossine non è identica alla

– disponibili plasmidi, linee cellulari ingegnerizzate e glicosilazione in

può essere trasformato mammiferi

– disponibili promotori forti •Tutto il sistema di

– fermentazioni economiche espressione, compreso il

• Integrazione genomica e stabilità dei trasformati ceppo è brevettato:

pagamento dei diritti

• buon controllo dell’espressione genica alla compagnia

• processi di produzione su larga scala sono noti e ben proprietaria!

studiati (400 proteine prodotte)

• resa molto alta (30-50% proteina ricombinante)

• solo 0.5% delle proteine native sono escrete:

facilitazione nell’isolamento della proteina ricombinante

secreta

• poche proteasi nel mezzo

• possiede compartimentazione cellulare che permette

modificazioni post‐traduzionali

Per produrre proteine in lievito sono stati identificati marcatori metabolici

auxotrofici: nei batteri si tratta di restenze ad antibiotico, mentre per gli eucarioti

(lieviti) si tratta dell’assenza di sintesi di un enzima per un pathway biosintetico di un

aa.

Metodo: clonazione per complementazione in E.coli.

Esempio: identificazione del marcatore X = LEU

1. Genoteca di lievito in vettore di espressione procariotico

2. avremo a disposizione degli E.coli difettivi, -X (ex: enzima difettivo per la sintesi

della leucina, -LEU). I frammenti derivanti dalla genoteca sono stati clonati in cell di

batteri.

3. Dopo la trasformazione questi stessi batteri sono stati cresciuti e hanno espresso il

gene derivante dal genoma di lievito, dando vita a E.coli +X, ricombinante per il

marcatore X su un terreno senza leucina

4. il gene LEU viene così isolato come marcatore metabolico utile in lieviti LEU-

Vettori a spoletta per il lievito, vettori integrativi e di replicazione

Presentano, come seq generali:

LEU2 (determina l’espr di una proteina per il pathway della leucina)

o Origine di replicazione pUC118

o AmpR

o

Poi, con altri elementi, prenderanno ulteriori nomi



Ori 2μ: origine di replicazione plasmidica YEP, yeast episomic plasmid. [Nel

o DNA di lievito ci sono plasmidi naturali che si replicano autonomamente. Da qui si

origina la seq Ori2 μ] 

Ori ARS: autonomous replication sequence YRP, yeast replicating plasmid

o 

Ori ARC e CEN YCP, yeast centromere plasmid

o 

YCP + TEL YAC, yeast artificial chromosomes

o In S.cerevisiae solo le proteine

secrete possono essere glicosilate

Durante il processo di esportazione si verificano: 1. La formazione di ponti disolfuro

2. Il taglio proteolitico

3. Le modificazioni post‐traduzionali

4. la proteina si libera nel mezzo

extracellulare

Es. Produzione della proteina irudina

(anticoagulante)

(gene proveniente dalla

sanguisuga Hirudo medicinalis)

I vettori YAC sono utili per

clonare frammenti di DNA

>100kb

Il vettore in analisi (pYAC) porta

due marcatori positivi, TRP1 e

URA3, oltre a seq CEN, TEL e

ARS

Il vettore viene clivato vicino le

seq telomeriche (BamHI), per

linea rizzare il vettore. Un altro

taglio viene determinato a

livello dell’MCS (per esempio

con SmaI), e in questa posizione

verrà ligato la CDS eterologa.

Il costrutto finale reca DNA clonato e si può mantenere stabile in una cell di

lievito ospite Ura- e Trp- , determinandone la possibilità di vita.

Genoteche così costruite hanno contribuito al sequenziamento del genoma umano.

La bassa complessità del genoma di lievito aumenta le probabilità

di ricombinazione omologa

Pur essendo un eucariote, il

suo genoma è poco

complesso. Ne deriva che la

manipolazione è molto più

semplice di altri eucarioti.

Genoma più piccolo=maggiore controllo del transgene

Controllo del transgene = frequenza della ricombinazione omologa (posso

ingegnerizzare con più semplicità il genoma del lievito, perché so dove si integra la mia

seq)

La ricombinazione omologa permette esperimenti di gene targeting

Taglio con A: Taglio con B:

Avremo il vettore linea rizzato in Avremo il vettore linea rizzato in

o o

alto a destra. URA3 è una seq alto a sinistra. VPG è una seq

integra, mentre la VPG è integra, mentre la URA3 è

interrotta interrotta

La ricombinazione avviene La ricombinazione avviene

o o

proprio per la seq VPG del lievito proprio per la seq URA3 del

diploide, e si inserisce il vettore lievito diploide, e si inserisce il

nell’allele. Sappiamo certamente vettore nell’allele. Abbiamo

dove si trova, poiché il genoma ricostituito il fenotipo WT per

del lievito è ben conosciuto URA3

Faccio sì che il lievito diploide Faccio sì che il lievito diploide

o o

vada in sporulazione, in modo vada in sporulazione, in modo

da rendere spore con solo un da rendere spore con solo un

allele. allele.

La selezione avviene per La selezione avviene per

o o

crescita su terreno senza crescita su terreno senza

uracile. Le cellule capaci ci uracile. Le cellule capaci ci

crescervi sono sicuramente crescervi sono sicuramente

quelle che hanno integrato il quelle che hanno integrato il

vettore! vettore!

Avere un target di integrazione è fondamentale perché ci permette di

scegliere porzioni eucromatiniche,

ad alta espressione.

La ricombinazione omologa

permette esperimenti di

rimpiazzamento per trans

collocazione

Ex: rimpiazzare un gene da

lievito (per esempio, i geni che

impediscono alla proteina voluta di

funzionare o essere stabile)

Usiamo un targeting vector del

gene che vogliamo rimpazzare.

Con i terminali omologhi, la ricombinazione porterà un allele a perdere la

seq WT (in questo caso rimpiazzata da URA3).

In questo modo, dopo la sporulazione, su una piastra senza uracile

cresceranno lieviti senza il gene di partenza, ma con URA3 funzionante.

Esempio di uso: glicosilazione non voluta. Posso rimpiazzare il gene che

l’amministra e fare knock-out di quello originale!

EX: espressione della superossido dismutasi (SOD) umana in S.cerevisiae

Cu/Zn Superossido Dismutasi (citosolica): - infiammazione; -riperfusione

dell’organo; - potenziale agente terapeutico (osteoartrite, artrite,

reumatoide)

Nota: metabolismo dell’ox parzialmente ridotto

O2+e-O2- (ione superossido) // O2- + O2- + 2H+ --[SOD] H2O2 + O2 –

[catalasi o per ossidasi]  detossificazione

Problema: Durante l’espianto di organi si creano molteplici specie reattive

dell’ox. Se si continua così l’organo potrebbe non essere più re-impiantato.

Si può tecnicamente esprimere la SOD e ridurre il problema.

Metodica:

Usiamo un costrutto di questo

o tipo:

 LEU2 (marcatore positivo)

 cDNA di Cu/Zn-SOD

 promotre GAPD

(gliceraldeide 3P DH di

lievito) e terminatore

GAPD (tali seq esprimono

ad alto livello, perché è

una proteina della glicolisi)

 ampR

 OriE

L’ospite è un ceppo di lievito LEU2-

o Trasformiamo il cell con tale vettore, in modo da esprimere

o costitutivamente la Cu/Zn SOD acetilata in ALA all’N terminale (quello

umano è acetilato sulla prima alanina, ecco perché – l’E.coli non è

capace di rendere questa modificazione, per cui ci affidiamo

all’espressione eucariotica)

Ex: Promotore pAOX di P.pastoris (Questa volta si tratta di un modello

regolabile.)

• Pichia è un lievito metilotrofo in grado di utilizzare il metanolo

• la prima tappa del processo è l’ ossidazione a formaldeide e perossido di idrogeno ad

opera dell’ alcol ossidasi, il cui controllo è a livello trascrizionale

L’ enzima è codificato dai geni AOX1 e 2, omologhi tra loro al 92% per sequenza

o nucleotidica

La regione del promotore ha una repressor region che guida la repressione del gene

o e una activation region che guida l’aumento dell’espressione del gene

L’enzima non è rilevabile quando la cellula cresce su glicerolo, ma raggiunge il

o 30% del totale delle proteine cellulari in cellula cresciuta su MetOH

• Gli enzimi chiave coinvolti sono nei perossisomi: quando le cellule

crescono su glicerolo ci sono pochi

perossisomi, che invece raggiungono l’80%

del totale del volume della cellula cresciuta

su MetOH.

 Il promotore pAOX1 o 2 è quindi forte e

finemente regolabile. Indotto da metanolo,

represso da glicerolo e glucosio

Usiamo un vettore integrativo di

espressione dell’antigene di superficie del

virus dell’epatite B umana (HBsAg) in Pichia

pastoris. Essendo un vettore integrativo,

non ha origine di replicazione.

-AOX; -HIS4 (marker positivo)

Questo vettore si esprimerà solo in cellule contenenti metanolo, in cui

l’Alcol ossidasi sarà il 30% delle prot totali

Strategia del gene targeting sul gene AOX1. Uso il vettore contenente la

nostra CDS , sfruttando le due seq AOX per determinare una ricombinazione

omologa.

Inoltre, con il promotore AOX1, sicuramente l’espressione sarà notevole e

soprattutto regolabile dalla presenza/assenza di metanolo.

tali tecniche sono notevolmente usate a livello di diagnostica, sintesi

vaccini, agenti terapeutici

Nota: fondamentale per l’espressione corretta della nostra proteina è il

CODONE USAGE, ossia la freq di uso di codoni, che tra diverse specie è

differente. Alcune specie “preferiscono” usarne alcuni invece di altri, poiché

dipende dalla disponibilità dei tRNA in cellula. Questo vuol dire che se

esprimo una prot eterolga, devo conoscere a proprio il codone usage della

cellula per non incappare in problemi.

Vettore Come si costruisce un vettore di espressione ricombinante?

ricombi Amplificazione mediante PCR della CDS si interesse

o

n Analisi del prodotto di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio

o

ante Eluizione del prodotto di PCR da gel

o Digestione con un opportuno enzima di restrizione del prodotto di PCR e

o del vettore scelto

Ligazione PCR vettore

o Trasformazione di cellule competenti per la propagazione

o Estrazione del DNA plasmidico ricombinante

o 1. PCR

 La PCR allestita deve necessariamente presentare la seq Kozak nel

primer forward, almeno per le cell di mammifero. Per i batteri basta

l’AUG.

 Codone Usage, potrebbe essere diverso per organismi usati. (per ex,

la GFP ha un codone usage che per uomo e medusa è simile)

 Sempre attenzione alla costruzione dei primer

2. Elettroforesi su agarosio

 Visualizzazione prodotto di amplificazione (se c’è)

 Misura del peso molecolare (in presenza di marker)

3. Eluizione prodotto di PCR

 Al termine della corsa taglio la banda d’interesse con eluizione di

affinità

 Con il DNA si usano membrane silicee (con biglie); mettendo le biglie

in contatto con l’agar e sollevando la temperatura, avremo un

insieme di gel solubilizzato e particelle. La resina silicea, avrà ioni Na

esposti verso il centro della colonna. Na ha carica positiva, ed

interagisce con i gruppi P del DNA. Eliminiamo tutto ciò che non è di

nostro interesse, ed eluiamo il DNA usando acqua.

4. Dosaggio spettofotometrico del DNA

 Non possiamo applicare la legge di Lambert-Beer a causa

dell’assenza di epsilon (coefficiente di estinzione, dato che è

strettamente legato alla concentrazione molare).

Metteremo quindi in relazione la capacità di assorbimento del DNA su

volume totale. Questo valore è diverso per DNA (coeff di

assorbimento:30) e RNA (coeff di assorbimento: 50. Assorbe di più

perché le molecole che lo formano sono più larghe).

Quindi l’assorbimento non è in funzione dell’integrità del DNA.

5. Digestione con un opportuno enzima di restrizione del prodotto di

PCR e del vettore scelto

 Attenzione alla compatibilità di terminali tagliati e alla direzionalità

dell’inserto

6. Ligazione PCR vettore

 Uso DNA ligasi

 La ligazione può avvenire in modo particolare, per esempio con i

vettori T/A. in questo caso non serve il precedente step di digestione

enzimatica. I prodotti di PCR hanno una A aggiuntiva al 3’,

indipendentemente dallo stampo. Questa A sporgente è usata come

gradino per legare la T del vettore!

7. Colony PCR

 PCR con F che si appaia su promotore. (attenzione alla direzionalità di

F e R)

 Il template è rappresentato da batteri lisati in acqua

 Estrazione con lisi alcalina del plasmide ricombinante (lisi cellulare,

aggiunta di liquido alcalino e centrifugazione; sia DNA cromosomico

che plasmidico sono nel sovranante; cromatografia di affinità con

resina di silice; sequenziamento)

(questa metodica si può fare perché dopo la denaturazione, il pDNA si

rinatura più velocemente del gDNA, e quest’ultimo sedimenta mentre

l’altro rimane in soluzione)

8. Sequenziamento

 È la prova diretta e sicura per confermare che ciò che abbiamo

prodotto è quello che volevamo

9. Allineamento

 Con tool bioinformatici, allineamo la seq ottenuta con quella teorica.

Se combaciano, abbiamo fatto bene, altrimenti la PCR a monte è

sbagliata.

Rilevar Identificare il trascritto

o

e  RT PCR quantitativa (qPCR)

la prot  Northen blot

di  Ibridazione in situ

interess Identificare la prot

o

e  Western blot

 ELISA

 immunofluorescenza

Identificare e isolare le cellule che esprimono in una popolazione mista

o  Citometria di flusso e FACS

Saggi funzionali

o

RT PCR QUANTITATIVA

1. Tissue sample con metodi di sampling

2. RNA per mezzo di isolamento di acido nucleico (ex con colonne

cromatografiche. Generalmente poi l’integrità dell’RNA viene testata)

(l’isolamento avviene per esempio per estrazione fenolica acida)

3. cDNA con uso di retrotrascrittasi (avviene a precisa temperatura, con

determinati primer, può essere una one step o two step)

4. PCR real time amplification (classica; studio dei primer, abbondanza

di mRNA)

Nota: fondamentale per questo metodo è l’inibizione dell’RNAsi.

Problematiche note:

a. Come si disegnano i primer per tale PCR?

Uso primer che portano con sé molecole fluorescenti proporzionali al

trascritto presente

SYBER green I: il più usato ma aspecifico. L’incorporazione è random e

o fluoresce se in doppia elica. Quindi mano a mano che si procede con

l’amplificazione, la fluorescenza aumenterà.

sonde fluorescenti: per esempio, una sonda FRET. Quando questa viene

o distrutta dall’elongamento del DNA, assume fluorescenza differente. La

vicinanza originaria con il quencher faceva sì che la fluorescenza fosse

rossa. Quando la molecola fluorescente si allontana da questo, fluoresce

di un altro colore. È un sistema più raffinato del SYBR, dato che la sonda

si lega in modo specifico.

b. Come faccio analisi dei dati?

Dato l’aumento progressivo di fluorescenza, si può creare una curva di

amplificazione di fluorescenza.

Sull’asse delle X c’è il ciclo di PCR del caso, mentre sull’asse delle Y c’è il

o valore Rn, la fluorescenza del reporter normalizzata rispetto alla

fluorescenza passiva del florocromo.

Dobbiamo calcolare una deviazione standard dei dati di background, così

o da poter fissare un threshold; questo mi permetterà di osservare

l’effettivo inizio della PCR (con il Ct: threshold cycle)

Più sarà alta la quantità di template presente, pià la PCR partirà

o velocemente

c. Quantificazione: assoluta o relativa?

Assoluta: stabilisco il n° di copie del trascritto target, per esempio in due

o cellule.

Relativa: ho un target (un transgene) che seguo durante il metodo. È il

o nostro riferimento, un gene esogeno che si esprime sempre nello stesso

modo (per esempio la beta actina).

Useremo tale espressione come “standard” di confronto con il mio

campione.

Equazione generale per la quantizzazione relativa

R: livelli di espressione del target

E target: il mio target

ΔCP target control: le cellule

NON trasfettate OPPURE la cellula

trasfettata che non esprime la

nostra proteina (controllo

negativo). In questo caso il CT è

molto spostato a destra.

ΔCP target sample: la cellula

trasfettata

E ref: controllo, il gene di

riferimento

Stiamo quindi

confrontando i livelli di espressione del target con quelli del

riferimento.

Quando R è 2 (E target/E ref), 2 è l’efficienza di amplificazione. Tra ciclo n e

n+1, il n° di ampliconi raddoppia! L’efficienza dell’amplificazione è del

100%!

NORTHEN BLOTTING

Non possiamo usarlo per fare screening di un trascritto, però possiamo

o ottenere un dato in più, ossia la dimensione del mio trascritto + i

prodotti di splicing alternativo (anche se è un dato più utile alla biologia

molecolare). È quindi un metodo semi-quantitativo.

è una tecnica che permette di visualizzare ed identificare l'RNA purificato da un

o campione, in particolare per studiare l'espressione genica.

Tecnicamente, è simile al Southern Blotting, con la differenza sostanziale che

o l'RNA tende a formare strutture secondarie stabili in soluzione; per fare in modo

che la mobilità elettroforetica sia solo dipendente dalla lunghezza del frammento,

l'RNA deve essere preventivamente denaturato (solitamente esponendolo ad alte

temperature). Inoltre, la corsa elettroforetica deve essere eseguita in presenza di

agenti denaturanti, solitamente formaldeide e formammide.

Successivamente, l’RNA verrà trasferito su un filtro, genralmente di

o nitrocellulosa, e quindi incubato con probes di RNA fluorescenti, o

radioattivi. Dopo l’incubazione osserveremo la presenza di fluorescenza

o radioattività nelle bande dove il mio RNA di interesse è presente.

ELISA

Tecnica immunochimica, usa anticorpi per identificare la presenza di una

o proteina. È solitamente performata a livello di piastre di micro titolazione

È una tecnica semplice e ad alta risoluzione, sicuramente più semplice

o del western blot

Può essere indiretta o a sandwich (la prima per la rivelazione

o dell’anticorpo, la seconda per la rivelazione dell’antigene, ossia la nostra

proteina d’interesse).

 Sandwich (anticorpo primario + proteina + anticorpo secondario

recante una HRP e rivelazione con luminolo)

 Indiretta (proteina + anticorpo primario + anticorpo secondario

recante una HRP e rivelazione con luminolo)

Ovviamente, tra tecniche dirette ed indirette, le dirette avranno segnale

luminoso molto inferiore a quello indiretto

Per ex, posso usare questa tecnica direttamente su cellule se la nostra

o prot espressa è di membrana

Nota: FLUORESCENZA

Fluorescenza =/= fosforescenza (la differenza dipende dai secondi con

o cui si esprime la luce)

Cofluorescenza: possibilità di marcare due proteine diverse con due

o anticorpi primari e secondari diversi nella stessa metodica. I due fluoro

cromi usati devono NECESSARIAMENTE avere spettri di assorbimento e

di espressione diversi, che non si accavallano.

Spettro di assorbimento/eccitazione: relazione tra assorbimento e

o lunghezza d’onda.

Spettro di emissione: relazione tra emissione e lunghezza d’onda.

o I fluoro cromi stessi sono stati ideati in modo da avere picchi di

o assorbimento ed

emissione molto

stretti, così da

1.Flusso ad

essere più

alta pressione

specifici e più

con al centro il

distanti tra loro.

campione,

Tra

o

schiaccia le

assorbimento ed

cell in una sola

Flusso al alta Campion

4.gocce

fila 2.Cella di

pressione e

3.“muzzle

Purifica Tecniche di purificazione di prot ricombinanti: compromesso

z purezza/funzionalità biologica

di Scelta della tecnica più opportuna: l’utilizzo commerciale e

o

protein farmacologico di prot ricombinanti necessita specifici gradi di purezza e

e funzionalità. La maggiore tecnica di purificazione dovrebbe conferire

100% di purezza e 100% di attività biologica.

Il compromesso purezza/funzionalità biologica è strettamente

o dipendente dal

grado di

complessità

strutturale della

proteina di

interesse

Struttura/funzione

prot  scelta della

tecnica più

opportuna

Tecniche più

o utilizzate per la

purificazione di

prot ricombinanti

(a sinistra)

Conoscere le

o proprietà

biochimiche per

stabilire la giusta strategia di purificazione:

Peso molecolare, forma, contenuto di aa (per la carica), punto

isoelettrico, distribuzione di carica, solubilità (influenzata da forza ionica

e pH), densità (lipoproteine <proteine <fosfoproteine), idrofobicità

(distribuzione dei residui idrofobici), capacità di legare metalli o altre

molecole, capacità di associazione e dissociazione, specificità di seq o di

struttura, presenza i modifiche post traduzionali, etc

Posso stabilire tali proprietà durante lo sviluppo del costrutto di espressione.

I. SALING OUT CON SOLFATO D’AMMONIO

Una concentrazione troppo elevata di sale rende l’intacco del guscio di

solvatazione della proteina, e quindi la possibilità di agglomerarsi ad alte

proteine e precipitare. Questo metodo, il salting out, è solitamente

performato con solfato d’ammonio perché è estremamente solubile in

acqua.

Il metodo fornisce prot a basso grado di purezza, tendenzialmente

denaturare dall’elevata forza ionica utilizzata.

II. BLUE NATIVE PAGE / SDS PAGE

Tecnica del 1991, è più che altro una metodica analitica descritta come

o una elettroforesi atta alla solubilizzazione di complessi proteici dalla

membrana di origine.

è definita ‘native’ perché non denatura le proteine, ‘blue’ perché usiamo

o il comassie blue G250, che rende una parziale carica negativa assoluta

al campione (lega aa basici e idrofobici).

Usiamo detergenti non forti, ma blandi, come la digitonina, il

o dodecilmaltoside.

Determineremo le strutture delle sub unità di un complesso, ma anche

o interazione prot-prot e funzionalità di queste

Generalmente questa tecnica è la “prima dimensione” di una metodica

o che vede come seconda dimensione l’SDS PAGE, in modo da avere

ancora più alta risoluzione in una condizione di denaturazione proteica.

Questi metodi, come la maggior parte delle elettroforesi, sono dette

o “zonali” perché utilizzano supporti solidi, nel nostro caso agarosio o

poliacrilammide. Per tirar via le proteine dal gel di solito si procede con

diffusione semplice o elettroeluizione, ma in questo modo la funziona

biologica viene compromessa

III. CROMATOFRAFIE

La tecnica più utilizzata. Una miscela di componenti (C) dispersi in una

o fase mobile (M), fatta muovere in una fase stazionaria (S) si distribuirà

lungo la faste stazionaria secondo un coefficiente di distribuzione (K).

K è il rapporto delle concentrazioni del componente C tra la fase S ed M

(K = Cs/Cm), è specifico per ogni componente della miscela, e questo ci

aiuta a differenziare i composti.

Ogni componente della miscela sarà in equilibrio fra le due fasi: Cm↔Cs

La cromatografia di affinità è la più usata. Useremo una resina che

o espone, con un braccio spaziatore, un ligando per cui la nostra

macromolecola è sensibile. In questo modo la divideremo dal resto dei

composti.

Con questo metodo posso purificare proteine con un tag di affinità! Per

o esempio, con il tag di HIS c’è la IMAC (Immobilized Metal Affinity

Chromatography), per esempio con ligando di Nickel.

La resina in biglie (speharose) usata espone il braccio spaziatore con

acido iminodiacetico (funge da collante) per un atomo di Ni, che ha

carica positiva. Ad un pH fisiologico, l’HIS ha un azoto nell’anello

imidazolico che è carico negativamente ed entra in interazione con il Ni.

Nota: le HIS del tag DEVONO essere libere e non nascoste in tasche

ripiegate della prot.

L’eluente sarà l’imidazolo, che ha la stessa struttura, e quindi può

sbalzare via le HIS e permettere l’eluizione (eluizione specifica).

Ovviamente, per evitare che l’imidazolo permanga in soluzione,

o ripassiamo l’eluito in una cromatografia ad esclusione molecolare.

Essendo una molecola più piccola della proteina, rimarrà intrappolata

per più tempo nelle maglie della resina della colonna, permettendo a noi

di eluire immediatamente le prot di interesse.

Oppure con dialisi. Teniamo la colonna cromatografica n un sacchetto da

dialisi. Il parametro di discriminazione sarà la porosità del sacchetto; le

macromolecole rimangono all’interno e quelle più piccole escono.

Abbiamo applicato il principio di diffusione.

[dopo eluizione: SDS PAGE, colorazione con comassie, elettroblotting per

trasferimento su filtro, immunoblotting con anticorpo specifico]

Oltre a quella c’è anche una IMAC con atomo di cobalto. (stesso

o funzionameno)

Oppure possiamo gettarci sulla proteina di fusione. La più usata è la GST

o (glutatione S trasnferasi), poiché ha attività biologica nota. Allo stesso

modo, dobbiamo progettare tale situazione fin dal vettore di

espressione, ed inserire la CDS della GST accanto alla frame della mia

seq eterologa.

La cromatografia avrà quindi come ligando il glutatione stesso

(tripeptide), che tratterrà la prot di fusione in colonna. L’eluizione

avviene con glutatione ridotto, ancora più affine per l’enzima, che lo

trascinerà verso l’eluizione.

Successivamente dovremo pensare ad eliminare tale eluente (dialisi) e a

tagliare chimicamente (1mM Calcio + 1mM EDTA) o enzimaticamente la

prot di fusione per ottenere la nostra.

ANTIBODY-BASED AFFINITY CHROMATOGRAPHY

Tecnica ad alta specificità, dato che utilizza un anticorpo che riconosce

o naturalmente il proprio elemento di legame

Sistemo l’ab legato alla fase stazionaria della colonna; ma dopo

o l’adsorbimento, come divido l’ab dalla macromolecola? (sono molecole

avide, non si dividono) Uso quindi un buffer a pH molto acido (3 o 2) per

diminuire l’affinità tra le due molecole. Ma così rischio di denaturare la

proteina; per evitare, tampono con un pH basico all’uscita dalla colonna.

Abbiamo rischiato, ma la proteina all’uscita avrà alto grado di purezza

o (quasi 100%!) purtroppo la funzionalità è in dubbio.

Compromesso purezza/funzionalità: in alcuni casi la presenza di tag

compromette in modo irreversibile il folding e la funione della prot di

interesse. Anche se è possibile eliminarlo, il suo effetto negativo si esplicita

durante la sintesi e le modificazioni post-traduzionali della prot. In questi

casi non è possibile utilizzare la cromatografia di affinità. Si utilizzano

teniche meno performanti di purezza, ma compatibili con la funzione

biologica, come:

CROMATOGRAFIA AD ESCLUSIONE MOLECOLARE

Uso una matrice inerte (biogel P, biogel A),composta di sfere di resina

o attivate dall’acqua. Facendo colare la mia

soluzione contente proteine, le molecole più

piccole occuperanno il volume interno delle

sfere di resina, che riterranno le molecole

piccole molto a lungo.

Le molecole grandi, impossibilitate ad entrare

nelle sfere, sgusciano tra queste a più alta

velocità, dato che occupano solo il vol esterno

alle sfere. Tempo di eluizione minimo.

È sia denaturante che nativa, dipende dalla

o funzione.

Questo metodo dipende dalla lunghezza della colonna e dalla natura

o dell’impaccamento ( n° piatti teorici, la superficie di relazione tra fase

stazionaria e fase mobile)

Ex: uso la tenica per separare proteine con strutture sovra molecolari. In

cellula ci sono pochi concorrenti di composti così voluminosi. Ma bisogna

mantenerne l’integrità strutturale o non funzionerà. Possiamo applicare la

cromat ad esclusione molecolare in forma nativa, e avremo un buon 60% di

grado di purificazione.

A SCAMBIO IONICO

Scambiatori ionici sono usati nella resina, e l’interazione avverà per carica

opposta. Scambiatori anonici: DEAE (dietilaminoetil) cellulosa // scambiatori

cationici: fosfocellulosa

Trasferi Metodi di trasformazione genica per prokarya:

m CLORURO DI CALCIO: trattandole con cloruro di calcio, la membrana

o

ento cellulare è più permeabile al DNA. Questa tecnica si utilizza per quelle

genico cellule che non sono naturalmente competenti come E.coli.

ELETTROPORAZIONE

o SHOCK TERMICO: l’E.coli competente è posta da una temperatura da 0° (20min)

o ++

a 42° (50 sec) a -4°C, in presenza di CaCl2. I cationi Ca hanno lo scopo di

neutralizzare le cariche negative dei fosfolipidi della membrana cellulare, creando

le prime fratture della membrane stessa, mentre la continua e rapida variazione di

temperatura ne aumenta le permeabilità.

Nota: è errato pensare che 1 molecola di DNA entri in un solo batterio. Più molecole

permeano al suo interno, non c’è controllo su questo.

Nota: di solito gli E.coli sono trasformati in modo ‘sconosciuto’, perché le aziende non

lo rivelano. Sono usati principalmente per il clonaggio.

Cellule per clonaggio: efficienza di Cellule per sub clonaggio: efficienza di

trasformazione alta. Abbiamo intenzione trasformazione bassa. Abbiamo

di esprimere la CDS. Di solito sono intenzione di amplificare il vettore. Di

cellule provenienti da aziende. solito sono cellule di lab trattate con

cloruro di calcio.

Selezione di cellule trasformate: con antibiotico (quello di cui si porta la resistenza nel

costrutto utilizzato)

Metodi di trasformazione genica per eukarya:

INFEZIONE VIRALE: il DNA di un virus viene maneggiato e modificato per poter

o esprimere una CDS desiderata, quindi ri-impacchettato in un virus. Sfortunatamente

deve essere maneggiato con grande prudenza

Svantaggi: i tempi di definizione sono lunghi. Ci vogliono abilità.

Vantaggi: alta efficienza di trasferimento di DNA in cellula.

TRASFEZIONE: il plasmide è trasferito in cellule in coltura, in alcuni casi anche in

o vivo.

Vantaggi: metodo rapido e facile da eseguire.

Svantaggi: alcuni tipi cellulari non si trasfettano efficacemente.

INIEZIONE IN CELLULA: il DNA è iniettato direttamente in cellule

o Vantaggi: metodo diretto

Svantaggi: può essere tecnicamente difficile da eseguire

Metodi di trasfezione

1. DEAE destrano

2. Precipitazione con fosfato di calcio

3. Elettroporazione

4. Liposomi cationici

DEAE destrano: l’utilizzo dei reagenti chimici per la trasfezione è stato introdotto nel

1965 con la scoperta del DEAE destrano, un polimero cationico che si lega strettamente

ai gruppi fosfato de DNA carichi negativamente (dalla sua parte ha una N che a pH

fisiologico è carica positivamente). Queste grosse particelle contenenti DNA aderiscono

alla superficie delle cellule e vengono introdotte al loro interno mediante endocitosi.

Questo metodo, sebbene sia semplice, è poco efficiente per molti tipi cellulari, e quindi

poco affidabile per saggi di routine dall’attività biologica di una preparazione di DNA

purificato.

 Primo metodo usato per l’introduzione di DNA in cell eukarya

 Destrano: polisaccaride di unità di D-glucosio legate con legami alfa1/4 o

alfa1/6 glicosidici. Quando viene associato a gruppi carichi positivamente

DEAE è in grado di legare DNA e di mediarne l’ingresso attraverso membrane

 Vantaggi: semplice

Svantaggi: poco efficiente, solo trasfezioni transienti

COPRECIPITAZIONE CON FOSFATO DI CALCIO

Tale metodica venne introdotta nel 1970 grazie alla scoperta che le cell sono in grado di

captare in maniera efficiente il DNA sottoforma di un precipitato con fosfato di calcio.

Il protocollo base per questo tipo di esperimento prevede che si isoli il Dna che viene

poi miscelato con una soluzione accuratamente tamponata contenente fosfato.

L’addizione di cloruro di calcio forma un fine precipitato di fosfato di calcio e DNA,

che si distribuisce su un monostrato di cell, lasciate poi in incubazione a 37°C per

diverse ore (4/16h), durante le quali molte di esse captano il DNA esogeno. Il

precipitato viene poi rimosso dalle cell alle quali viene aggiunto terreno di coltura

fresco.

 Il DNA a contatto con la doluzione di fosfato di calcio forma dei precipitati i

quali, con meccanismo poco noto, entrano in cellula

 Gli ioni bivalenti possono promuovere l’ingresso di acidi nucleici attraverso le

membrane

 Vantaggi: economico

Svantaggi: delicato (forma e dimensione del precipitato + influenzato da

variazioni anche minime di pH), efficienza bassa, elevata citotossicità, non

funziona con alcuni tipi cellulari

ENTRAMBI I METODI CHIMICI CITATI sono poco dispendiosi e garantiscono una

moderata efficienza di trasfezione in numerosi tipi cellulari. Tuttavia presentano alcuni

svantaggi: sono infatti abbastanza tossici (soprattutto il metodo DEAE destrano); sono

soggetti ad una certa variabilità. Inoltre il DEAE destrano pià essere usao solo per

trasfezioni transienti in cui il campione viene testato 72 ore dopo l’introduzione del

DNA esogeno nelle cellule. È stato quindi necessario mettere a punto differenti

metodiche in grado di assicurare efficienze di trasfezione elevate anche in tipi cell

poco sensibili alla trasfezione con le due metodiche chimiche sopracitate.

MICROINIEZIONE: permette l’introduzione direttamente di acidi nucleici nel nucleo o

nel citoplasma della cellula, attraverso l’ausilio di un elettrodo con una punta molto

fine, montato su uno specifico iniettore. Nonostante l’elevata efficienza, tale metodo

non viene utilizzato spesso a causa dei costi non indifferenti dell’apparato e delle

difficoltà tecniche.

 Il DNA è inserito in cellula attraverso un capillare di vetro, con un sistema ad

alta pressione.

 Vantaggi: trasferimento selettivo, aumenta efficienza di espressione, modulare

facilmente livello di espressione

Svantaggi: tecnicamente impegnativa, poche cellule alla volta, costoso

ELETTROPORAZIONE: le cell, poste in una soluzione contenente il DNA, sono

sottoposte ad un breve impulso elettrico che produce pori transitori nelle membrane,

attraverso cui il DNA esogeno può entrare. Tale tecnica richiede però un numero molto

elevato di cell di partenza, a causa dell’elevato tasso di morte cellulare che si osserva

nel corso degli esperimenti. Occorre quindi bilanciare l’efficienza di trasfezione con la

percentuale di morte cellulare.

 Vantaggi: utile su quei tipi cellulari in cui non si ottengono risultarti con metodi

classici

Il DNA entra direttamente senza passare attraverso il compartimento

endosomiale, dove può aver luogo la degradazione dell’ac nucleico

Si può usare su cell in vivo! (per ex, su cellule tumorali per seguirne lo sviluppo

in vivo. Ovviamente la dpp è rivolta sulla massa tumorale solamente.

Per ex, su topi. Supponiamo di conoscere una prot della cancerogenesi, e di

voler andare ad interferire con i messaggeri della proteina (RNA interfearence).

Nel nostro caso, usiamo siRNA per interferire con l’espressione di prot

cancerogene. Più concentrazione di siRNA, più il melanoma diminuisce di

massa, quindi l’elettroporazione servirà a immetterne molto.)

Esistono veri e propri metodi che rientrano nell’elettochemioterapia, così da poter

inibire la crescita di tumori.

 Svantaggi: necessità di ottimizzare le condizioni del campo elettrico (intensità e

durata)

Elevato livello di tossicità