Ingegneria Cellulare

Intro ingegneria cellulare

Ingegneria cellulare: scienza interdisciplinare che raccoglie la biologia cellulare, la biologia molecolare, la biochimica, la fisiologia classica e molecolare. Obiettivo dell'ingegneria cellulare è manipolare i processi biologici in modo mirato e prevedibile, al fine di ottenere biomolecole di interesse o modificare il fenotipo dell'ospite biologico. È una definizione in continuo sviluppo.

DNA ricombinante

La manipolazione di un processo o fenotipo biologico parte dalla costruzione di una molecola di DNA ricombinante (rDNA). Le tecnologie dell'rDNA (ingegneria genetica, proteica, metabolica) permettono la produzione di una grande varietà di peptidi, proteine, e molecole biochimiche da cellule che normalmente non ne produrrebbero. Il DNA ricombinante è una molecola chimerica costituita dall'unione covalente di frammenti di DNA di origine differente. La pietra miliare dell'ingegneria cellulare è l'esperimento di costruzione di plasmide batterico nel 1973 (Cohen-Chang).

Produzione di proteine ricombinanti

Una delle principali applicazioni delle tecniche di ingegneria cellulare consiste nell'espressione di proteine ricombinanti. Necessitiamo però di (1) definire una strategia efficace e (2) procedere sperimentalmente.

Schema generale

L'origine del tutto parte ovviamente dalla creazione di un opportuno vettore di espressione. Gli elementi che lo compongono si stabiliscono in base alla strategia di espressione più opportuna. Si può però definire un protocollo comune a tutte le strategie.

• Identificare il vettore più opportuno (con un prezzo contenuto che vanti una letteratura dettagliata e recente. Se non c'è o non è usato → sarà un fallimento o una genialata).
• Clonaggio del CDS (Coding DNA sequence) di interesse nel vettore.
• Amplificazione del vettore ricombinante in E.coli (alto numero di vettori ospitabili).
• Preparazione di quantità sufficienti di vettore ricombinante.
• Trasferimento genico nell'ospite scelto.
• Espressione della proteina eterologa.
• Purificazione della proteina eterologa.
• Saggi biochimici e funzionali.
• Stabilire il grado di purezza e la funzionalità.

Strategia per la produzione di una proteina ricombinante

Per produrre efficacemente una proteina ricombinante è necessario partire dalle proprietà biologiche e strutturali della proteina di interesse. Una proteina non è solo una sequenza di amminoacidi. Una strategia di successo permette di produrre grandi quantità di una proteina ricombinante, pura, e soprattutto funzionale.

Come procediamo

Studiamo in dettaglio le proprietà strutturali e funzionali della proteina di interesse. La proteina da sintetizzare serve per:

• Applicazioni industriali.
• Farmaceutiche.
• Nutrizione umana.
• Nutrizione animale.
• Ricerca scientifica.
• Diagnosi molecolare.
• Terapia.

Quali proprietà biologiche bisogna preservare? Che grado di purezza è richiesto? Quale scala di produzione è richiesta? I tipi di proteina con cui avremo a che fare saranno diversi:

• Peptide idrosolubile [bisogna far attenzione di ponti disolfuro che all'aria si ossidano].
• Proteina globulare solubile (mono-multimerica – ha già la sua io struttura secondaria, terziaria, etc.) [più complesse. Interazioni più complesse da conservare. Ricordiamo che la forma è strettamente legata alla funzione proteinca].
• Proteine fibrillari solubili (mono-multimeriche) [si assemblano!].
• Proteine di membrana monomerica [la membrana rappresenta un grande problema, è difficile da emulare in vitro].
• Proteine di membrana multimeriche (struttura quaternaria).
• Proteine di membrana multimeriche con organizzazione sovramolecolare.

Successivamente penseremo alla strategia per la costruzione del vettore di espressione più opportuno.

Donatore procariotico

Esempio: espressione di proteine in E.Coli

Dobbiamo mettere in confronto le proprietà della proteina con le capacità dell'ospite.

• Ha modificazioni particolari? (fosforilazioni, acetilazioni, glicosilazioni) (NO FORME TETRAMERICHE).
• Ha funzione biologica legata alla struttura sec o terz? (nel caso di prot che assumono conformazioni secondarie o terziarie spontaneamente, allora sì).
• Se è sì, qual è il sito maggiormente coinvolto? (la sua posizione, se è modificata in modo complesso – glicosilata, oppure in un ripiegamento specifico – non può usare E.coli come sistema di espressione. Solo in zone lineari sì).

Ergo, proteine piuttosto semplici.

Vantaggi e svantaggi

Inoltre, spesso le proteine espresse sono tossiche per il batterio: la sovra espressione di una proteina "estranea" al batterio ne comporta spesso la morte → la resa proteica si abbassa. Una soluzione è l'espressione inducibile della CDS esogena (per esempio, l'espressione può avvenire sull'orlo della fase di plateau, così da avere il massimo delle cell ad esprimere). Il sistema di regolazione della trascrizione migliore è quello repressore/attivatore. Il meccanismo di traduzione richiede il sito RBS nei vettori (Ribosome Binding Site, seq di Shine-Delgarno).

Esempio di vettore inducibile è quello che usa il meccanismo dell'operone Lac. (perché regolo la trascrizione e non la traduzione? Perché l'mRNA si degrada quasi subito).

Sistema di regolazione

Che sistema di regolazione posso scegliere?

• Con attivatore.
• Per mezzo di de repressione.
• Repressore + attivatore → è la regolazione sicuramente più fine disponibile, poiché non è ON/OFF ma graduale. Questo per impedire che l'espressione sia immediata e uccida il batterio. Questi sistemi sono ripresi dall'operone LAC o quello del TRP.

Oltre alla repressione, fondamentale è la seq di traduzione → nei procarioti e negli eucarioti è diversa (negli eukarya è a causa del cap, che attira e orienta il ribosoma) (nei prokarya è a causa del RBS). La regolazione non è solo amministrata dal repressore, ma dal promotore stesso. Spesso viene usato il repressore del fago T7. Tuttavia, questo necessita di una RNApol del fago T7, che a sua volta dev'essere regolato. Usiamo ancora un sistema repressore/attivatore, il promotore LAC in presenza di IPTG. In mancanza di IPTG, il repressore può posizionarsi sulla seq operatrice e bloccare l'espressione della pol T7. In presenza di IPTG, questo occupa il repressore e permette l'espressione della pol. In commercio esistono ceppi di E.Coli modificati che possiedono nel loro genoma il gene Lac I ed esprimono, in presenza dell'induttore gratuito IPTG, la T7 RNApol. Se questi ceppi sono trasformati con opportuni vettori di espressione ricombinanti, in presenza di IPTG, avremo l'espressione della proteina di interesse.

Identificazione dell'ospite migliore

Quale ceppo di E.coli?

• BL21 (De3) E.coli sono ideali per l'uso di sistemi T7. Questo ceppo porta geni riguardanti il lisogeno DE3. Le proteine non tossiche sono generalmente espresse a livelli più alti in BL21.

Il genoma del lisogeno T7 è stato modificato per produrre RNApol T7 sotto induzione di lac. Il vettore usa l'RNA pol del T7 per esprimere le proteine del vettore di espressione. In tutti i due casi uso IPTG per indurre l'espressione.

Esempi di vettori di espressione utili in E.coli lisogeni per T7 e regolati mediante IPTG

Esempi di vettori di espressione utili in E.coli lisogeni per T7 e regolati mediante IPTG (espressione inducibile di proteine di fusione in E.coli + seq per la purificazione):

• pEcoli-Cterm 6HN (5769 bp) - ampR - l'origine di replicazione del pBR322 - lacI (repressore del lac) - PT7 (promotore) - RBS (Shine-delgarno) - MCS (multiple cloning site) - Thrombine cleavage site - 6XHN tag - T7 terminator. Tale vettore è strettamente regolato, eppure molto inducibile per espressione batterica; permette di esprimere le proteine d'interesse con una tag di HIS al C-terminale. La risultante proteina di fusione può essere facilmente purificabile (generalmente con resina His60Ni). Il vettore è basato sul sistema pET (una serie di vettori). Contiene il promotore ibrido T7 lac, che combina il forte promotore T7 con l'operatore lac. L'espressione è naturalmente bloccata dal repressore lacI, che si lega alle seq operatrici lac del promotore impedendo la trascrizione. In presenza di IPTG, il repressore è eluso e il prom T7 può essere trascritto dalla RNApol T7. Il tag 6XHN (istidina + asparagina) comprende 6 ripetizioni di His-Asn. Il sito di cleavage della trombina (leu-val-arg-gly-ser) per la successiva rimozione del tag di HN. L'ampR e l'origine di replicazione pBR322 fanno sì che il vettore si mantenga a bassa copia nell'ospite.

Metodo di clonaggio: “in frame” con 6HN tag. Clonaggio direzionale basato sulla restrizione enzimatica.

• pEXP5-CT/TOPO: un vettore di espressione procariotico che sfrutta l'operone LAc e permette l'espressione indotta di una proteina di fusione con tag His termnale. Utilizza la topo isomerasi per la reazione di ligazione, dato che il vettore ha protruding A/T. Il 5’ del prodotto di PCR non ha inizio con gruppo P, ma con OH (perché i primer per PCR hanno terminale 5’ OH)! Per fortuna, altrimenti andrebbe a fare interferenza con il gruppo P della topo isomerasi. Questo clonaggio bidirezionale basato su topo isomerasi modificate è diverso da quello per restrizione, perché il secondo garantisce la direzionalità dell'inserto. Questo metodo invece NO. Bisognerà anzitutto selezionare i cloni con l'inserto giusto (selezione per PCR).

Vettore veloce, NON direzionalità d'inserto. Proteina con tag HIS. Nota: tali tag servono a semplificare la fase di purificazione. Servirà una cromatografia di affinità con resina HIS-Ni, e successiva eluizione con imidazolo (da 250 a 500 mM di imidazolo). Tuttavia, non possiamo usare l'imidazolo se la nostra proteina necessita di un ambiente specifico, che potrebbe rendere la denaturazione della nostra proteina (dato che l'imidazolo è carico). Per evitare il problema, posso usare un tag enzimatico, come la glutatione-s-transferasi. La stessa proteina può essere espressa con il tag di HIS e quello enzimatico, così se posso evitare l'eluizione con imidazolo, tanto meglio! La purificazione della prot di fusione con GST usa glutatione (tripeptide), il suo substrato, che viene espressa direttamente in cellula (regola i processi di detossificazione dall'ossigeno). Quindi uso una molecola biologica che la proteina riconosce. Difatti, le prot eluite con il metodo GST sono molto più stabili di quelle eluite con imidazolo!

Metodi di induzione di espressione senza IPTG

Nota: l'IPTG costa molto. Come faccio ad indurre l'espressione senza spendere molto? Con i PL promoter. Sono promotori termosensibili regolati da un repressore → cambiando la temperatura vario l'affinità repressore-promotore e posso renderla nulla.

• I promotori pL sono regolati dal repressore cI (del batteriofago lambda).
• Il repressore I è espresso dal gene cI.
• Il gene cI è usato in una condizione mutante (CI857).

1. 28/30°C: attività del repressore, non ci sarà espressione.

2. 42°C: il repressore non si ripiega in modo corretto, c'è espressione.

Questo metodo ha permesso alle industrie di produrre proteine che altrimenti non si sarebbero espresse. Tale sistema non usa l'induzione a IPTG, ma attraverso il triptofano (meno costoso).

• Quando il triptofano è mancante nel mezzo, la proteina cI è sintetizzata (de repressa) e quindi impedisce l'espressione della seq di interesse.
• Quando il triptofano è presente, la proteina cI è repressa, quindi la prot di interesse è espressa.

La scelta del vettore

La scelta del vettore può essere fatta anche con tool bioinformatica, per orientarci tra vettori e ospiti. In alcuni browser bioinformatici possiamo scegliere una serie di parametri di nostro interesse, come: tipologia di ospite (S.cerevisiae, E.coli), proprietà di replicazione (i marker), numero di copie di vettore in ospite (capacità di replicazione), promotore, seq di secrezione, RBS, proteina di fusione.

Come aumento la stabilità delle proteine ricombinanti

Ci sono proprietà che dipendono dalla proteina stessa. Come il tempo di emivita (il tempo richiesto per ridurre del 50% la quantità di una proteina). Questo parametro dipende dalla funzione della proteina (ex quelle strutturali come l'actina hanno lungo tempo di emivita). Come possiamo risolvere il problema di una proteina con un tempo di emivita di minuti? Per fortuna, in E.coli questo valore di stabilità è migliorabile.

• Spesso la degradazione dipende dalle seq N-terminali! La sintesi dell'N terminale determina due nozioni fondamentali per la prot:
• Il segnale di localizzazione (trafficking).
• L'informazione sul tempo di emivita.

Studi dell'86 hanno definito che cambiando gli aa dell'N terminale, il tempo di emivita della prot cambia! Quindi, posso inserirne alcuni mediante mutagenesi sito-specifica e variare la stabilità della prot. (questo se disturba meno possibile la funzione biologica).

• Ceppi carenti in protesi (o con proteasi termolabili).
• Mutanti in isoforma sigma della RNApol attivata dallo shock termico (RpoH).
• Proteasi temperatura dipendente (degP).

In questo modo, abbassando le proteine digerite dalle proteasi, la resa si solleva notevolmente.

• Ceppi mutanti che variano la stabilità dell'mRNA.
• Anche questo varia la resa della proteina. Si determina una attenuazione dell'attività dell'RNAsi, permettendo così a RNA esogeno non di non essere degradato → migliore stabilità dell'RNA.

Stabilità del costrutto di espressione

Il sovraccarico metabolico indotto dalla gestione della replicazione, trascrizione e traduzione del costrutto di espressione induce la perdita progressiva di costrutto, anche a causa della presenza di DNAsi. Su piccola scala si risolve usando antibiotici e marcatori positivi di resistenza. Su larga scala questo è impossibile. Possiamo determinare l'integrazione del costrutto di ex nel genoma del batterio per mezzo di ricombinazione omologa (ma dobbiamo conoscere le seq genomiche bersaglio! → vengono costruiti su misura e si chiamano targeting vectors).

Espressione massiva di proteine esogene in E.coli induce l'accumulo di acetato (espressione dell'acetolattato sintasi). L'espressione di acetato è causata dall'apporto di glucosio elevato, che determina un'attività glicolitica che termina in lattato e acetato. Questi diminuiscono il pH cellulare, causando la morte cellulare. Ovviamo a questo problema esprimendo l'acetolattato sintasi, che converte le molecole acide in acetonio/acetoina (non acido).

Corpi di inclusione

Sono accumuli di particelle che il batterio non sa come impiegare. Forma, con i lipidi, un corpo isolato insolubile. Recuperare le proteine da questa formazione è molto complesso. Posso gestirli grazie alla progettazione del vettore di espressione: i corpi di inclusione rappresentano l'incapacità del batterio di funzionalizzare le proteine. Se nel vettore inseriamo una sequenza che esemplifichi il "modo d'uso", potrei risolvere il problema. Determino quindi l'espressione di chaperonine, proteine che aiutano il batterio a rendere una conformazione corretta della proteina espressa. Tali vettori prendono il nome di "chaperon vectors".

Espressione di proteine eterologhe ricombinanti in cellule di mammifero

Abbiamo già visto l'espressione in procarioti, con l'obiettivo di ottenere la proteina in alta concentrazione. Negli eucarioti, oltre a questo, necessitiamo di un sistema biologico che assecondi il ripiegamento e le modificazioni necessarie al funzionamento della proteina, alla sua corretta localizzazione. Questo perché ci troviamo in una situazione più "familiare".

Vantaggi e svantaggi