Ingegneria Cellulare

VIRALI

Possono essere usati solo in lab specifici, a causa di patogenicità

o Derivano generalmente dall’HIV (lentivirus).

o

Gp41/gp120: interagiscono con la cell ospite per l’ingresso

Problematiche: non sappiamo dove si inserisce il DNA e la freq di integrazione è

o bassa (seppure possa migliorare con espressione di una integrasi)

Il vettore virale è quindi bello e pronto, identico ad un virus, ma con una porzione

o di genoma contenente delle CDS di mio interesse

Entrata in cellula:

o 1. Il vettore virale si avvicina alla cellula e con Gp41/gp120 passa attraverso la

membrana, lasciando l’envelope

2. All’interno del capside ci saranno due seq di RNA e due proteine: trascrittasi

inversa e integrasi. Gli RNA vengono retro trascritti in dsDNA, che

accompagnati dall’integrasi nel nucleo, andranno a far parte del genoma

cellulare. Il DNA virale integrato prende il nome di pro virus.

3. Si determina così RNA che, tradotto, esprime la nostra proteina. Si preferisce

accoppiarla ad una proteina reporter per confermare il successo della tecnica

4. Ci sarebbe anche una

fase di diffusione, con

due RNA virali

incapsidati e inviati in

nuove cellule ospiti

Ottengo così una linea

stabilmente trasfettata!

Struttura genomica ed

espressione genica dei retrovirus

Contiene 3 geni:

o GAG (componenti del core

nucleo proteico)

POL (replicazione e

ricombinazione) ENV

(componente della membrana esterna)

A confronto, il vettore retro virale sarà così: Psi: packaging virus

X: CDS voluta

Neo: resistenza

neomicina

Questo vettore verrà

inserito nelle cell eucariotiche con bassissima efficienza tramite

trasfezione/elettroporazione, oppure con massima efficienza mediante infezione.

Nota: se il vettore non ha Psi, significa che è solo un vettore di espressione. Nasceranno

virus nuoti. Se presenta Psi, significa che vogliamo che infetti anche ulteriori cellule,

perché nasceranno virus ricombinanti.

 Linea cell di packaging: non presenta il vettore virale di nostro interesse.

Produzione unica di proteine virali e virioni vuoti, perché sono psi-deleti.

 Linea cell produttrice: presenta anche il vettore virale, che porta con sé un sito

psi attivo. Permette al nostro vettore RNA di essere ulteriormente

confezionabile, e quindi utile per infettare nuovi ospiti.

Le particelle virali prodotte sono difettive per la replicazione

o Possiedono un gene marcatore selezionabile

o Infettano facilmente cell in attiva replicazione

o Si integrano stabilmente nel genoma ospite e producono la nostra proteina

o

Nota: i lentivirus possono permettere l’espressione e l’infezione sia di cell in vitro che

in vivo.

Animali Generazione di topi transgenici mediante cellule ES: per scopi commerciali

trasnge o scopi di ricerca.

ni Procedure:

ci A)Cellule staminali di embrione (ES) (motivi commerciali), scelte rispetto

alle esigenze tecniche del laboratorio (alta efficienza di trasfezione)

B)Inserimento del costrutto. Questo contiene un frammento di DNA

contenente un gene modificato, di cui conosciamo tutto, compresa la

posizione nel genoma delle cellule. Presenta una resistenza alla Neo; quindi

quando la ricombinazione sarà possibilmente avvenuta, faremo crescere

ogni singola cellula per formare colonie. Quelle sopravvissute saranno

colonie transgeniche.

C)Tali cellule transgeniche vengono inserite nell’embrione di una femmina

WT di topo pseudogravida. Le ES prendono a dividersi, a differenziarsi nella

massa embrionale.

Nella blastula (lo stadio embrionale) ci saranno varie cellule le la cui

posizione è fondamentale,

poiché rappresenterà l’ordine

dei tessuti del topolino

nascituro. Inserendo le cell

embrionali, queste

giungeranno in livelli

sconosciuti della nostra

blastula, creando embrioni

chimerici (devono essere

molteplici).

D)Ottengo una progenie

chimerica, in cui l’espressione

del mio transgene può essere

ovunque: nella pelle, nella

coda, etc etc. Come faccio a

sapere se la mia progenie è

chimerica o no? Uso una linea

da modificare col pelo bianco,

e le cellule embrionali di topi

col pelo nero: se ottengo

topini F1 con manto

nero/bianco, allora stiamo

procedendo bene.

E)Tra tutta questa progenie, ci

interessa il topo che presenta

il trasngene nella linea

germinale. Incrociando questi

topi F1 con transgene nella

linea germinale, otterrò una

F2 con topi geneticamente

modificati  tutte le cellule

che li compongono esprimono il transgene.

La modifica del gene di interesse conta due

metodi principali: uno classico e uno innovativo.

Quello classico è quello che abbiamo visto.

Quello innovativo è più veloce e più

performante!

Un esempio sarebbe quello di

o

lavorare non a livello embrionale, ma sulla

fecondazione dell’ovocita (ancora prima della

fusione dei pronuclei!). in particolare, lavoriamo

sulla trasfezione del sistema del pronucleo

maschile (il gamete maschile, che è aploide la

trasfezione avviene su un corredo aploide).

La microiniezione permetterà quindi

o

di inserire il trasgene nel pronucleo, ma

l’incubazione di tanti targeting vectors avverrà

nell’ovocita. NON lo facciamo sullo zigote,

perché questo parte immediatamente verso le

numerose divisioni cellulari.

Lo zigote, difatti, nasce in vitro, e poi impiantanto nella femmina. La

o fecondazione è quindi in vitro!

Come posso determinare la mancanza di un gene WT e l’espressione di un

gene di mio interesse? Con il metodo di KnockOUT & KnockIN.

1. Conventional KnockOUT: eliminazione di un gene.

Nel nostro caso, l’obiettivo è sostituire l’esone 2, in modo da

compromettere l’espressione dell’intero gene. Il targeting vector è una

molecola di DNA lineare con 2 seq laterali omologhe alle seq fiancheggianti

la porzione che vogliamo disattivare. In questo caso, l’esone 1 e 3. Con un

evento di ricombinazione omolga, ci sarà sostituzione della CDS per la

neomicina (con promotori forti) con l’esone 2. La selezione avverrà per

mezzo della seq DTA.

L’allele che ha subito ricombinazione non avrà l’esone2, quindi abbiamo

compromesso il prodotto di sintesi. La generazione di ES ottenuta avrà

quindi quel gene in knockOUT.

2. Conditional KnockOUT

È una tecnica molto vantaggiosa, perché il gene di nostro interesse viene

eliminato in un organo a nostro piacimento, e non in tutto l’organismo. È

vantaggioso perché questo gene potrebbe essere vitale per l’animale in

altre locazioni.

Il targeting vector è identico all’allele, solo che presenta una CDS tra due

esoni (2 e 3), seq FRT per la flippasi e LOXP. Con la ricombinazione omolga

avremo la sostituzione dell’intera seq, dall’esone 1 al 3, con comparsa della

CDS della neomicina. Questo trasngene sarà passato alla seconda

generazione, che sarà omozigote per tale allele.

A questo punto la ricombinazione è modulata.

Topo 1: la cassetta NEO è in un introne, ma destabilizza la reading frame

o e quindi determina un trascritto errato. Incrociamo questo topo con uno

che esprime una flippasi. NON esprime la proteina il cui allele è stato

preso di mira.

Topo2: in presenza di terminali FRT, la flippasi espressa in questo topo

o permette l’eliminazione della cassetta della Neo. Ho quindi solo la

presenza di seq LOXP nella stessa direzione (topi ‘flippati’). Incrocio

questo esemplare con un topo che esprime la ricombinasi CRE.

ESPRIME la proteina il cui allele è stato preso di mira.

Topo 3: l’espressione (può essere costitutiva o inducibile) della

o ricombinasi CRE agisce sulle LOXP, che elimina tutto cià che si trova nel

mezzo, cioè l’esone2.

NON esprime la proteina il cui allele è stato preso di mira.

 Se scegliamo la CRE costitutiva, otterrò un conventional

knockOUT, dato che avremo un topo con seq delete fin dalla

nascita.

 Se scegliamo quella inducibile, siamo noi a determinare il

knockOUT del gene. L’induttore in questione è un chemioterapico

chiamato tamoxifen. Se lo introduciamo nell’animale, otterremo il

knockOUT finale.

Nota: la selezione di NEO serve per selezionare le cell embrionali staminali

che presentano il transgene. La sua espressione è indipendente

dall’espressione del gene che stiamo modificando.

Questo procedimento ci permette di determinare anche modificazioni

minute, come la modifica di un solo nucleotide: il knockIN.

1. Conditional KnockIN: (l’immagine è al contrario)

per questo targeting vector, le seq LOXP hanno due orientamenti

o opposti. Affiancano l’esone 2 mutato (anche di un solo nucleotide, uno

SNIP), seq FRT e CDS della neomicina. Al difuori delle seq LOX, gli esoni

1, 2, 3, 4. Solo l’esone mutato codifica in antisenso, cioè al contrario.

Dato che non è riconosciuto come codificante, l’esone II viene

considerato introne e non espresso.

Nota: le cell che assumono questo costrutto sono >1%!

Topo1: presenza della cassetta NEO. La proteina non si esprime. Viene

o incrociato con un topo che porta con sé l’espressione della flippasi.

Topo2: eliminazione della cassetta NEO a causa dell’espressione della

o flippasi. La proteina viene espressa (la controlliamo con RT PCR, se

necessario). Viene incrociato con un topo che eprime la CRE in modo

indotto.

Topo3: l’espressione indotta della ricombinasi CRE termina, per la

o posizione delle seq LOX, il ribaltamento della porzione tra queste.

Otteniamo quindi la ‘disattivazione’ dell’esone2 WT e l’espressione

dell’esone 2 mutato, con lo SNIP: esprimeremo la forma mutata della

proteina.

Nota: la CRE può essere espressa costitutivamente o inducibile in diverse

citotipi (solo nel muscolo, o solo astrociti…).

Nota: metodi del genere possono occupare anche 2, 3 anni. I problemi sono

molti: l’efficienza della ricombinazione omologa (su cui non ho potere).

Problematica: come trovo la posizione del mio filamento nel genoma

ospite? Solo con la ricbominazione omologa posso essere certa che sia in

una posizione conosciuta.

Come confermo che sia in cellula? Selezione con neomicina. Ma non con

l’antibiotico, con la PCR!

Selezione di cellule embrionali per mezzo di PCR.

Estraggo il DNA genomico e ne faccio una PCR con primer F per la

o cassetta della neomicina. Questo sarà specifico per il locus d’interesse!

Se l’amplificato presenta effettivamente questa cassetta, allora il<