Ingegneria Cellulare
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(stiamo spacciando il nostro vettore come una sequenza “natuale” della
cellula, così l’RNAsi non degraderà il trascritto).
VETTORE D’ESPRES PER PROTEINE DI FUSIONE FLUORESCENTI:
clonaggio con ER,
classico
PUC ori: origine di
replicazione dal
PUC18
CMV: prom
MCS
SV40polyA: seq di
poliadenilazione
NeoR: resistenza
neomicina
KanR: resist
kanamicina
mCherry: unità di
trascrizione di una
prot fluorescente
(rossa)
Nota: più il fluoro
cromo emette
luce, meno colore
si sviluppa.
Generiamo una proteina di fusione. Tali sistemi sono utili per la
selezione/quantificazione delle proteine.
Con il vettore in analisi, la prot di fusione ha il tag fluorescente al C-
terminale. È fondamentale la scelta della posizione del tag (evito il
terminale che rende la funzionalità della proteina).
COME ESPRIMO la prot con tag fluorescente? Con CLONAGGIO in
FRAMEnon c’è seq di stop tra le due seq, al termine del codone di
espressione della prima proteina segue immediatamente quello d’inizio
della seconda proteina.
TRASFERIMENTO GENICO IN CELL EUCARIOTICA
Inserire DNA in una cell eucariotica non è semplice. L’apparato di difesa
della cell è costituito dalle DNAsi, che degradano DNA esogeno: questo è il
destino della maggior parte del DNA trasfettato nelle cellule.
Ecco perché il sub clonaggio in E.coli è fondamentale! Più μg di DNA
aumentano la possibilità che la trasfezione avvenga.
Quello che faccio è letteralmente saturare il sistema lisosomico, così da
permettere ad un po’ di DNA esogeno di essere espresso.
Questa caratteristica differenzia le linee primarie dalle secondarie.
Nelle primarie l’attività lisosomica è molto alta, mentre le secondarie
hanno subito già molte modificazioni. È diversa quindi la capacità di
trasformazione.
Le linee primarie presentano
- ambiente extracellulare: MATRICE, un coating naturale della
superficie di crescita. Le secondarie hanno solo la membrana
cellulare.
- Elevate attività di DNAsi
- Elevata refrattarietà all’endocitosi del complesso DNA/agente
trasfettante
Come si riflette questo sull’efficienza di trasfezione? Ovviamente è più
elevata per le secondarie. La differenza è che c’è
miglioramento dell’efficienza di
espressione di proteine..
Expr di Espressione di prot in ovociti di Xenopus
prot Metodo nato negli anni 60
ricombi Vantaggi: sono cellule molto grandi, visibili ad occhio nudo, con
n anatomia ben precisa, si conosce persino la disposizione dei suoi
anti in ribosomi
ovociti Overview:
di - DNA plasmidico linea rizzato trascritto in vitro c RNA (stabile)
xenop - Espianto di ovociti inserimento di cRNA nell’ovocita espressione di
us proteina saggi biofisici
Questa tecnica è particolare perché inseriamo in cellula il trascritto
che ci renderà la traduzione, mentre di solito usiamo un vettore che
verrà trascritto e poi tradotto. Non passiamo dal nucleo! Abbiamo già
RNA, per cui rimaniamo nel citoplasma.
Tuttavia non può essere usata per l’espressione proteica massiva,
quindi per scopi di ricerca, non industriali
PER QUESTA TECNICA:
- Estrazione ovociti. Estrazione chirurgica da rane anestetizzata; gli
ovociti sono poi mantenuti in soluzione isotonica rispetto al
citoplasma dell’ovocita.
- Devo anzitutto scegliere il gene in cui intercalare la mia seq
eterologa. Prendo di mira il gene della beta-globina, che è un
trascritto molto stabile. Così uso quelle seq, inserendo il mio gene
eterologo +
seq UTR, al
fine di
ottenere un
trascritto
stabilissimo.
Cloniamo quindi
l’aquoporina4
umana
(sottoforma di
cDNA), il nostro
gene eterologo,
nel vettore pGEMHE, il nostro vettore. Linea rizziamo con Xbal.
- Trascrizione in vitro, con metodica mMessage mMachine KIT. Come
inserisco il CAP se è una trascrizione fatta in vitro? Uso una molecola
smile (NTP/CAP, miscela di nucleotidi e cap) al primo nucleotide inserito
dalla DNA pol: la 7 guanosintrifosfato (m7g), non una GTP. questa è
chimicamente analoga al primo nucleotide di un cap fisiologico.
(è come se prendessi in giro la DNApol e posso dare un CAP alla molecola)
Metodo: inserisco analogo al cap (m7g) ad una concentrazione
molto più elevata rispetto all’analogo GTP (1GTP:3m7G). Così la
cellula ha più probabilità di occupare l’m7G e di metterlo come primo
nucleotide del cap.
Così ho un cap funzionante per la tecnica.
- Trasfezione. Dobbiamo immettere l’RNA nell’ovocita, lo facciamo
con microiniezione. Dato che l’ovocita è la macchina utile ad
esprimere i geni materni e paterni, è ricolma di ribosomi. In qualche
qual modo il nostro trascritto troverà ribosomi disposti alla
traduzione! [l’ovocita si distingue
in polo animale e
vegetale. Al centro,
proprio nella fascia
centrale, c’è alta
concentrazione di
ribosomi. Con il
capillare da
microiniezione
dobbiamo proprio
centrare questo
punto. Evitiamo altre
zone; per esempio, il
polo vegetale è
ricolmo di lipidi.
Inserire il trascritto in questa zona significa farlo rimanere isolato e
inutilizzabile.
-Saggi biofisici: ovociti iniettati con il nostro trascritto vengono
confrontati con ovociti iniettati d’acqua. Inseriamo entrambi in una
soluzione di MND 96 isotonico. Con il passare del tempo, diluiamo 3
volte in acqua il mezzo. Osserveremo che il nostro ovocita si gonfierà
a causa della differenza di pressione osmotica.
[cinetica di swelling?]
Svantaggi/limiti: per ottenere l’espressione devo usare tantissimi ovociti, e i
sistemi sono piuttosto grezzi.
L’esperimento può avere successo su 20-30 ovociti su 200 di partenza: non
è un metodo efficiente al massimo.
Expr in Espressione proteica massiva in cellule d’insetto
cell di - Le cell di mammifero hanno costi elevatissimi per la trasfezione
insetto transiente (per ex le HEK). Questa situazione non può essere
trasposta in una produzione industriale. Una via di mezzo è l’uso di
cell di insetto, come la Spodoptera frugiperda infettata con
baculovirus come vettore di espressione.
- Spodoptera frugiperda: insetto erbivoro, mangia foglie su cui il
baculovirus forma strutture complesse di poliedrina. Questi ammassi
proteici vengono lasciati da insetti già infetti, e quando un nuovo
insetto ingurgita gli ammassi, viene a sua volta infettato dal
baculovirus.
- Baculovirus come vettore di espressione.
Alto livello di espressione genica (fino al 50% delle proteine totali
cellulari), e le prot espresse sono nella maggior parte dei casi solubili
e funzionali
Permette modificazioni post-traduzionali (fosforilazione, corretto
folding, ponti disolfuro, glicosilazioni…)
Facili da fare scale-up, dato che le cell di insetto sono semplici da
mantenere come sospensione cellulare (in confronto con quelle di
mammifero)
Sistema eucariotico più economico tra tutti
Schema infezione da baculovirus
1. Viene ingerito dall’insetto sottoforma di ammassi di poliedrina
2. Dispersione della matrice proteica attorno al virus, che è libero nello
stomaco dell’ospite
3. Fusione con membrana cellulare ed endocitosi del virus
4. Le matrici proteiche rimaste sono degradate dalle proteasi lisosomi
che, questo permette ai singoli virus di essere del tutto liberi
5. Entrata nel nucleo, uncoating e replicazione
[infezione primaria, per replicazione]
6. La replicazione permette a nuovi virus di uscire dal nucleo, ed
uscendo dalla membrana plasmatica assumerano l’envelope
7. Si crea il budded virus (“germogliato”)
[infezione secondaria, tardiva]
8. Nell’espressione del virus rientra anche quella della poliedrina, che
viene rilasciata nell’intestino dell’insetto
9. La presenza di poche peptidasi nell’intestino fa sì che questa proteina
rimanga attiva
10.Espulsione della poliedrina e nuova infezione
Visto il ciclo di infezione, per l’espressione della nostra proteina dovremo
aspettare l’infezione II, tardiva. Il nostro obiettivo è quello di sostituire la
seq della poliedrina con il gene eterlogo di nostro interesse, sfruttando il
promotore della poliedrina. Come creo virus ricombinanti?
- TEMPO FA: sono presenti due geni in baculovirus, di cui uno è
fondamentale. Taglio enzimatico tra i due (Bsv36I) e faccio ligazione
con la mia CDS eterologa. “ricucio” il tutto e il vettore è pronto. Con
tale metodo, i virus ottenuti sono sicuramente ricombinanti.
- ADESSO:
1. Creo plasmide donatore
2. Creo il bacmide ricombinante in E.Coli DH10BAC
3. Trasfettare cellule sf9 con il bacmide ricombinante
4. Recuperare virus ricombinanti dopo 3-7 gg
5. Titolare i virus (pfu/ul) (unità formanti placche/vol di cell totali)
6. Infettare con i virus ricombinanti le cell di insetto Sf9 utilizzando un
preciso MOI (moltiplicty of infection)
7. Valutare i livelli di espressione della proteina di interesse e la sua
funzionalità
Nota: MOI, quanti virus devono infettare una cellula? Se i virus sono 10 e le
cell 5, la MOI è di 2. Questo valore dipende dalla situazione. Per il nostro
esperimento, da 2 a 10 virus per cellula è consono (non troppi, altrimenti la
cell muore). Questo valore viene dedotto sperimentalmente, anche perché
dipende dalla proteina che stiamo esprimendo.
OVERVIEW DEL PROCESSO
1. Abbiamo il nostro plasmide ricombinante donatore, con seq
direzionali ai lati (Tn7R – per la transposizione)
2. Transposizione della mia CDS su bacmide (in cellule competenti DH
10BAC). Questo evento avviene in presenza di un plasmide
helper,che catalizza la tansposizione
3. Il BACmide è usato per trasformazione di E.coli
4. Seleziono duramente con 3 antibiotici + selezione per beta-
galattosidasi, in modo da rendere un prodotto corretto
5. Selezioniamo gli E.coli positivi ed estraggo il BACmide ricombinante
per passarlo in cellule di insetto (Sf9)
6. Infezione di cellule di insetto con virus ricombinanti
7. Espressione della proteina d’interesse + replicazione del virus
Nota: i virus devono essere titolati, per valutare quanta proteina otterremo.
Per ottenere proteine nell’ordine dei mg, devo usare virus nella singola
9
cellula dell’ordine di 10 . Se dovessimo avere una concentrazione più bassa
6
di virus (10 ), posso ‘amplificare’ il virus.
Prendo i 106 virus e infetto 10 milioni di cellule. La MOI è di 0,1. Su 10
cellule, 1 è infetta. Questa produce ulteriori virus attivi, che infettano le
restanti 9. Dopo un certo periodo di incubazione avrò una buona infezione
e quindi una concentrazione ottimale di virus.
[mi conviene partire da valori di virus più bassi se voglio amplificarli]
PLASMIDE DONATORE PLASMIDE HELPER
-Origine di replicazione -TetR (tetraciclina) (se la cellula è
-AmpR (per replicazione in batterio) resistente alla tetraciclina, allora
-pUC origine di replicazione (per presenta questo vettore)
replicazione in batterio)
-Tn7R/L: right /left
-GenR: gentamicina (la gentamicina è
compresa nell’unità che verrà trasposta
per ricombinazione omolga)
-Prom poliedrina
-MCS
-SV40 poliadenilazione il più diffuso
baculovirus:
Autographa cali fornica
multicapsed
nucleopolyhedrovirus
(AcMNPV).
STRATEGIA PER LA
PRODUZIONE DI VIRUS
RICOMBINANTI IN UN
OSPITE BATTERICO
TRANSGENICO
1. Si crea per
ricombinazione
omologa un
ceppo batterico
contenente un
plasmide
ricombinante (BACmide, con la resistenza alla kanamicina) e un
fago helper che codifica per la ricombinasi (resistenza alla
tetraciclina
)
2. Si
costituisce
un plasmide
donatore
3. Si trasforma
con il
plasmide
donatore le
cellule
DH10Bac
(lacz+,
KanR, TetrR)
Nota: lacZ
presenta
all’interno il sito
per la
ricombinazione.
Quando questa
avviene, la beta
galattosidasi non è
più espressa!
Quindi cerchiamo
cell lacz-. Al suo
posto viene
inserita la
gentamicina.
4. Si
selezionano
le colonie
con Bacmide ricombinante (Lacz-, GmR, KanR, TetrR) su piastre con i
tre antibiotici + IPTG + XGAL
Nota: NON l’ampicillina! Perché tutti i vettori usati ce l’hanno. Se
procedessimo con questa selezione ci ritroveremmo solo il bacmide WT. Mi
accorgo di questa situazione con una PCR.
5. Recupero il bacmide ricombinante (dimensioni 100 kb circa), con un
grado di purezza compatibile con la trasfezione (non ci devono essere
endotossine). Questa purificazione del BACmidico ricombinante
avviene mediante resine a scambio ionico (NON resine silicee, perché
queste non sono adatte alle dimensioni del bacmide. Al massimo
20Kbp)
6. Progetto una PCR in modo da discriminare in modo univoco se
l’inserzione della CDS è avvenuta o no. Il prodotto dell’amplificazione
con inserto da 2400 basi sarà in totale da 3200 basi circa, mentre il
WT ha circa 300 basi.
7. Una volta confermata la trasposizione, si utilizza il bacmide
ricombinante per trasfettare le cell di insetto Sf9 e si procede con la
raccolta di virus ricombinanti. Fondamentale è la titolazione, in
multiwell su monolayer (con matrice, mezzo di coltura, e agarosio).
Ottengo: una well in cui il virus è assente, quindi le cellule sono vive.
Per le altre well, inserisco una alta concentrazione di virus, poi
estraggo la sospensione e la diluisco per ogni well, fino ad arrivare a
10^-7.
Dopo alcuni giorni vado a osservare le placche formate. La well in cui
ci sarà una sola placca determinerà il titolo, in questo caso 10^-7
pfu/ml. In tal modo posso rispettare la MOi per l’amplificazione e
l’espressione.
Nota: come faccio a sapere se la proteina funziona? Dioi 24/48h di infezione
per l’espressione, estraggo le cell, purifico la prot di interesse e la
trasferisco su filtro di nitrocellulosa. Con un Immunoblotting (dotblot),
utilizzando anticorpo, potrò valutare rapidamente i livelli di espressione.
Exp in I lieviti sono eucarioti abbastanza articolati, quindi permettono di esprimere
lieviti prot anche complesse.
S.cerevisiae Svantaggi
Vantaggi • Resa piuttosto bassa: 5% delle proteine totali
• GRAS (Generally Regarded As Safe); non • Controllo dell’ espressione genica meno
patogeno per l’uomo e approvato dall’FDA facile (non ci sono sistemi
• Manca di endotossine repressione/induttori ma solo induttori)
• Genetica nota: sono disponibili plasmidi, • Perdita del plasmide
linee cellulari ingegnerizzate e può essere • Manipolazione dei plasmidi per lieviti
trasformato complessa
• Sono disponibili promotori forti • Sono disponibili pochi plasmidi di clonaggio
• Fermentazioni con lieviti relativamente • Glicosilazione in lieviti non è identica alla
ecomoniche; processi di produzione su larga glicosilazione in mammiferi
scala sono noti e ben studiati • Proteine ricombinanti eterologhe spesso
• Solo 0.5% delle proteine native sono escrete: trattenute nello spazio
facilitazione nell’isolamento della proteina periplasmatico: downstream process
ricombinante secreta complessi
• Possiede compartimentazione cellulare
che permette modificazioni post-
traduzionali
P.pastoris
Vantaggi Svantaggi
• Tutti i vantaggi di S. cerevisiae: •Manipolazione dei
– GRAS (Generally Regarded As Safe) plasmidi complessa
– approvato dall’FDA •Glicosilazione in lieviti
– manca di endotossine non è identica alla
– disponibili plasmidi, linee cellulari ingegnerizzate e glicosilazione in
può essere trasformato mammiferi
– disponibili promotori forti •Tutto il sistema di
– fermentazioni economiche espressione, compreso il
• Integrazione genomica e stabilità dei trasformati ceppo è brevettato:
pagamento dei diritti
• buon controllo dell’espressione genica alla compagnia
• processi di produzione su larga scala sono noti e ben proprietaria!
studiati (400 proteine prodotte)
• resa molto alta (30-50% proteina ricombinante)
• solo 0.5% delle proteine native sono escrete:
facilitazione nell’isolamento della proteina ricombinante
secreta
• poche proteasi nel mezzo
• possiede compartimentazione cellulare che permette
modificazioni post‐traduzionali
Per produrre proteine in lievito sono stati identificati marcatori metabolici
auxotrofici: nei batteri si tratta di restenze ad antibiotico, mentre per gli eucarioti
(lieviti) si tratta dell’assenza di sintesi di un enzima per un pathway biosintetico di un
aa.
Metodo: clonazione per complementazione in E.coli.
Esempio: identificazione del marcatore X = LEU
1. Genoteca di lievito in vettore di espressione procariotico
2. avremo a disposizione degli E.coli difettivi, -X (ex: enzima difettivo per la sintesi
della leucina, -LEU). I frammenti derivanti dalla genoteca sono stati clonati in cell di
batteri.
3. Dopo la trasformazione questi stessi batteri sono stati cresciuti e hanno espresso il
gene derivante dal genoma di lievito, dando vita a E.coli +X, ricombinante per il
marcatore X su un terreno senza leucina
4. il gene LEU viene così isolato come marcatore metabolico utile in lieviti LEU-
Vettori a spoletta per il lievito, vettori integrativi e di replicazione
Presentano, come seq generali:
LEU2 (determina l’espr di una proteina per il pathway della leucina)
o Origine di replicazione pUC118
o AmpR
o
Poi, con altri elementi, prenderanno ulteriori nomi
Ori 2μ: origine di replicazione plasmidica YEP, yeast episomic plasmid. [Nel
o DNA di lievito ci sono plasmidi naturali che si replicano autonomamente. Da qui si
origina la seq Ori2 μ]
Ori ARS: autonomous replication sequence YRP, yeast replicating plasmid
o
Ori ARC e CEN YCP, yeast centromere plasmid
o
YCP + TEL YAC, yeast artificial chromosomes
o In S.cerevisiae solo le proteine
secrete possono essere glicosilate
Durante il processo di esportazione si verificano: 1. La formazione di ponti disolfuro
2. Il taglio proteolitico
3. Le modificazioni post‐traduzionali
4. la proteina si libera nel mezzo
extracellulare
Es. Produzione della proteina irudina
(anticoagulante)
(gene proveniente dalla
sanguisuga Hirudo medicinalis)
I vettori YAC sono utili per
clonare frammenti di DNA
>100kb
Il vettore in analisi (pYAC) porta
due marcatori positivi, TRP1 e
URA3, oltre a seq CEN, TEL e
ARS
Il vettore viene clivato vicino le
seq telomeriche (BamHI), per
linea rizzare il vettore. Un altro
taglio viene determinato a
livello dell’MCS (per esempio
con SmaI), e in questa posizione
verrà ligato la CDS eterologa.
Il costrutto finale reca DNA clonato e si può mantenere stabile in una cell di
lievito ospite Ura- e Trp- , determinandone la possibilità di vita.
Genoteche così costruite hanno contribuito al sequenziamento del genoma umano.
La bassa complessità del genoma di lievito aumenta le probabilità
di ricombinazione omologa
Pur essendo un eucariote, il
suo genoma è poco
complesso. Ne deriva che la
manipolazione è molto più
semplice di altri eucarioti.
Genoma più piccolo=maggiore controllo del transgene
Controllo del transgene = frequenza della ricombinazione omologa (posso
ingegnerizzare con più semplicità il genoma del lievito, perché so dove si integra la mia
seq)
La ricombinazione omologa permette esperimenti di gene targeting
Taglio con A: Taglio con B:
Avremo il vettore linea rizzato in Avremo il vettore linea rizzato in
o o
alto a destra. URA3 è una seq alto a sinistra. VPG è una seq
integra, mentre la VPG è integra, mentre la URA3 è
interrotta interrotta
La ricombinazione avviene La ricombinazione avviene
o o
proprio per la seq VPG del lievito proprio per la seq URA3 del
diploide, e si inserisce il vettore lievito diploide, e si inserisce il
nell’allele. Sappiamo certamente vettore nell’allele. Abbiamo
dove si trova, poiché il genoma ricostituito il fenotipo WT per
del lievito è ben conosciuto URA3
Faccio sì che il lievito diploide Faccio sì che il lievito diploide
o o
vada in sporulazione, in modo vada in sporulazione, in modo
da rendere spore con solo un da rendere spore con solo un
allele. allele.
La selezione avviene per La selezione avviene per
o o
crescita su terreno senza crescita su terreno senza
uracile. Le cellule capaci ci uracile. Le cellule capaci ci
crescervi sono sicuramente crescervi sono sicuramente
quelle che hanno integrato il quelle che hanno integrato il
vettore! vettore!
Avere un target di integrazione è fondamentale perché ci permette di
scegliere porzioni eucromatiniche,
ad alta espressione.
La ricombinazione omologa
permette esperimenti di
rimpiazzamento per trans
collocazione
Ex: rimpiazzare un gene da
lievito (per esempio, i geni che
impediscono alla proteina voluta di
funzionare o essere stabile)
Usiamo un targeting vector del
gene che vogliamo rimpazzare.
Con i terminali omologhi, la ricombinazione porterà un allele a perdere la
seq WT (in questo caso rimpiazzata da URA3).
In questo modo, dopo la sporulazione, su una piastra senza uracile
cresceranno lieviti senza il gene di partenza, ma con URA3 funzionante.
Esempio di uso: glicosilazione non voluta. Posso rimpiazzare il gene che
l’amministra e fare knock-out di quello originale!
EX: espressione della superossido dismutasi (SOD) umana in S.cerevisiae
Cu/Zn Superossido Dismutasi (citosolica): - infiammazione; -riperfusione
dell’organo; - potenziale agente terapeutico (osteoartrite, artrite,
reumatoide)
Nota: metabolismo dell’ox parzialmente ridotto
O2+e-O2- (ione superossido) // O2- + O2- + 2H+ --[SOD] H2O2 + O2 –
[catalasi o per ossidasi] detossificazione
Problema: Durante l’espianto di organi si creano molteplici specie reattive
dell’ox. Se si continua così l’organo potrebbe non essere più re-impiantato.
Si può tecnicamente esprimere la SOD e ridurre il problema.
Metodica:
Usiamo un costrutto di questo
o tipo:
LEU2 (marcatore positivo)
cDNA di Cu/Zn-SOD
promotre GAPD
(gliceraldeide 3P DH di
lievito) e terminatore
GAPD (tali seq esprimono
ad alto livello, perché è
una proteina della glicolisi)
ampR
OriE
L’ospite è un ceppo di lievito LEU2-
o Trasformiamo il cell con tale vettore, in modo da esprimere
o costitutivamente la Cu/Zn SOD acetilata in ALA all’N terminale (quello
umano è acetilato sulla prima alanina, ecco perché – l’E.coli non è
capace di rendere questa modificazione, per cui ci affidiamo
all’espressione eucariotica)
Ex: Promotore pAOX di P.pastoris (Questa volta si tratta di un modello
regolabile.)
• Pichia è un lievito metilotrofo in grado di utilizzare il metanolo
• la prima tappa del processo è l’ ossidazione a formaldeide e perossido di idrogeno ad
opera dell’ alcol ossidasi, il cui controllo è a livello trascrizionale
L’ enzima è codificato dai geni AOX1 e 2, omologhi tra loro al 92% per sequenza
o nucleotidica
La regione del promotore ha una repressor region che guida la repressione del gene
o e una activation region che guida l’aumento dell’espressione del gene
L’enzima non è rilevabile quando la cellula cresce su glicerolo, ma raggiunge il
o 30% del totale delle proteine cellulari in cellula cresciuta su MetOH
• Gli enzimi chiave coinvolti sono nei perossisomi: quando le cellule
crescono su glicerolo ci sono pochi
perossisomi, che invece raggiungono l’80%
del totale del volume della cellula cresciuta
su MetOH.
Il promotore pAOX1 o 2 è quindi forte e
finemente regolabile. Indotto da metanolo,
represso da glicerolo e glucosio
Usiamo un vettore integrativo di
espressione dell’antigene di superficie del
virus dell’epatite B umana (HBsAg) in Pichia
pastoris. Essendo un vettore integrativo,
non ha origine di replicazione.
-AOX; -HIS4 (marker positivo)
Questo vettore si esprimerà solo in cellule contenenti metanolo, in cui
l’Alcol ossidasi sarà il 30% delle prot totali
Strategia del gene targeting sul gene AOX1. Uso il vettore contenente la
nostra CDS , sfruttando le due seq AOX per determinare una ricombinazione
omologa.
Inoltre, con il promotore AOX1, sicuramente l’espressione sarà notevole e
soprattutto regolabile dalla presenza/assenza di metanolo.
tali tecniche sono notevolmente usate a livello di diagnostica, sintesi
vaccini, agenti terapeutici
Nota: fondamentale per l’espressione corretta della nostra proteina è il
CODONE USAGE, ossia la freq di uso di codoni, che tra diverse specie è
differente. Alcune specie “preferiscono” usarne alcuni invece di altri, poiché
dipende dalla disponibilità dei tRNA in cellula. Questo vuol dire che se
esprimo una prot eterolga, devo conoscere a proprio il codone usage della
cellula per non incappare in problemi.
Vettore Come si costruisce un vettore di espressione ricombinante?
ricombi Amplificazione mediante PCR della CDS si interesse
o
n Analisi del prodotto di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio
o
ante Eluizione del prodotto di PCR da gel
o Digestione con un opportuno enzima di restrizione del prodotto di PCR e
o del vettore scelto
Ligazione PCR vettore
o Trasformazione di cellule competenti per la propagazione
o Estrazione del DNA plasmidico ricombinante
o 1. PCR
La PCR allestita deve necessariamente presentare la seq Kozak nel
primer forward, almeno per le cell di mammifero. Per i batteri basta
l’AUG.
Codone Usage, potrebbe essere diverso per organismi usati. (per ex,
la GFP ha un codone usage che per uomo e medusa è simile)
Sempre attenzione alla costruzione dei primer
2. Elettroforesi su agarosio
Visualizzazione prodotto di amplificazione (se c’è)
Misura del peso molecolare (in presenza di marker)
3. Eluizione prodotto di PCR
Al termine della corsa taglio la banda d’interesse con eluizione di
affinità
Con il DNA si usano membrane silicee (con biglie); mettendo le biglie
in contatto con l’agar e sollevando la temperatura, avremo un
insieme di gel solubilizzato e particelle. La resina silicea, avrà ioni Na
esposti verso il centro della colonna. Na ha carica positiva, ed
interagisce con i gruppi P del DNA. Eliminiamo tutto ciò che non è di
nostro interesse, ed eluiamo il DNA usando acqua.
4. Dosaggio spettofotometrico del DNA
Non possiamo applicare la legge di Lambert-Beer a causa
dell’assenza di epsilon (coefficiente di estinzione, dato che è
strettamente legato alla concentrazione molare).
Metteremo quindi in relazione la capacità di assorbimento del DNA su
volume totale. Questo valore è diverso per DNA (coeff di
assorbimento:30) e RNA (coeff di assorbimento: 50. Assorbe di più
perché le molecole che lo formano sono più larghe).
Quindi l’assorbimento non è in funzione dell’integrità del DNA.
5. Digestione con un opportuno enzima di restrizione del prodotto di
PCR e del vettore scelto
Attenzione alla compatibilità di terminali tagliati e alla direzionalità
dell’inserto
6. Ligazione PCR vettore
Uso DNA ligasi
La ligazione può avvenire in modo particolare, per esempio con i
vettori T/A. in questo caso non serve il precedente step di digestione
enzimatica. I prodotti di PCR hanno una A aggiuntiva al 3’,
indipendentemente dallo stampo. Questa A sporgente è usata come
gradino per legare la T del vettore!
7. Colony PCR
PCR con F che si appaia su promotore. (attenzione alla direzionalità di
F e R)
Il template è rappresentato da batteri lisati in acqua
Estrazione con lisi alcalina del plasmide ricombinante (lisi cellulare,
aggiunta di liquido alcalino e centrifugazione; sia DNA cromosomico
che plasmidico sono nel sovranante; cromatografia di affinità con
resina di silice; sequenziamento)
(questa metodica si può fare perché dopo la denaturazione, il pDNA si
rinatura più velocemente del gDNA, e quest’ultimo sedimenta mentre
l’altro rimane in soluzione)
8. Sequenziamento
È la prova diretta e sicura per confermare che ciò che abbiamo
prodotto è quello che volevamo
9. Allineamento
Con tool bioinformatici, allineamo la seq ottenuta con quella teorica.
Se combaciano, abbiamo fatto bene, altrimenti la PCR a monte è
sbagliata.
Rilevar Identificare il trascritto
o
e RT PCR quantitativa (qPCR)
la prot Northen blot
di Ibridazione in situ
interess Identificare la prot
o
e Western blot
ELISA
immunofluorescenza
Identificare e isolare le cellule che esprimono in una popolazione mista
o Citometria di flusso e FACS
Saggi funzionali
o
RT PCR QUANTITATIVA
1. Tissue sample con metodi di sampling
2. RNA per mezzo di isolamento di acido nucleico (ex con colonne
cromatografiche. Generalmente poi l’integrità dell’RNA viene testata)
(l’isolamento avviene per esempio per estrazione fenolica acida)
3. cDNA con uso di retrotrascrittasi (avviene a precisa temperatura, con
determinati primer, può essere una one step o two step)
4. PCR real time amplification (classica; studio dei primer, abbondanza
di mRNA)
Nota: fondamentale per questo metodo è l’inibizione dell’RNAsi.
Problematiche note:
a. Come si disegnano i primer per tale PCR?
Uso primer che portano con sé molecole fluorescenti proporzionali al
trascritto presente
SYBER green I: il più usato ma aspecifico. L’incorporazione è random e
o fluoresce se in doppia elica. Quindi mano a mano che si procede con
l’amplificazione, la fluorescenza aumenterà.
sonde fluorescenti: per esempio, una sonda FRET. Quando questa viene
o distrutta dall’elongamento del DNA, assume fluorescenza differente. La
vicinanza originaria con il quencher faceva sì che la fluorescenza fosse
rossa. Quando la molecola fluorescente si allontana da questo, fluoresce
di un altro colore. È un sistema più raffinato del SYBR, dato che la sonda
si lega in modo specifico.
b. Come faccio analisi dei dati?
Dato l’aumento progressivo di fluorescenza, si può creare una curva di
amplificazione di fluorescenza.
Sull’asse delle X c’è il ciclo di PCR del caso, mentre sull’asse delle Y c’è il
o valore Rn, la fluorescenza del reporter normalizzata rispetto alla
fluorescenza passiva del florocromo.
Dobbiamo calcolare una deviazione standard dei dati di background, così
o da poter fissare un threshold; questo mi permetterà di osservare
l’effettivo inizio della PCR (con il Ct: threshold cycle)
Più sarà alta la quantità di template presente, pià la PCR partirà
o velocemente
c. Quantificazione: assoluta o relativa?
Assoluta: stabilisco il n° di copie del trascritto target, per esempio in due
o cellule.
Relativa: ho un target (un transgene) che seguo durante il metodo. È il
o nostro riferimento, un gene esogeno che si esprime sempre nello stesso
modo (per esempio la beta actina).
Useremo tale espressione come “standard” di confronto con il mio
campione.
Equazione generale per la quantizzazione relativa
R: livelli di espressione del target
E target: il mio target
ΔCP target control: le cellule
NON trasfettate OPPURE la cellula
trasfettata che non esprime la
nostra proteina (controllo
negativo). In questo caso il CT è
molto spostato a destra.
ΔCP target sample: la cellula
trasfettata
E ref: controllo, il gene di
riferimento
Stiamo quindi
confrontando i livelli di espressione del target con quelli del
riferimento.
Quando R è 2 (E target/E ref), 2 è l’efficienza di amplificazione. Tra ciclo n e
n+1, il n° di ampliconi raddoppia! L’efficienza dell’amplificazione è del
100%!
NORTHEN BLOTTING
Non possiamo usarlo per fare screening di un trascritto, però possiamo
o ottenere un dato in più, ossia la dimensione del mio trascritto + i
prodotti di splicing alternativo (anche se è un dato più utile alla biologia
molecolare). È quindi un metodo semi-quantitativo.
è una tecnica che permette di visualizzare ed identificare l'RNA purificato da un
o campione, in particolare per studiare l'espressione genica.
Tecnicamente, è simile al Southern Blotting, con la differenza sostanziale che
o l'RNA tende a formare strutture secondarie stabili in soluzione; per fare in modo
che la mobilità elettroforetica sia solo dipendente dalla lunghezza del frammento,
l'RNA deve essere preventivamente denaturato (solitamente esponendolo ad alte
temperature). Inoltre, la corsa elettroforetica deve essere eseguita in presenza di
agenti denaturanti, solitamente formaldeide e formammide.
Successivamente, l’RNA verrà trasferito su un filtro, genralmente di
o nitrocellulosa, e quindi incubato con probes di RNA fluorescenti, o
radioattivi. Dopo l’incubazione osserveremo la presenza di fluorescenza
o radioattività nelle bande dove il mio RNA di interesse è presente.
ELISA
Tecnica immunochimica, usa anticorpi per identificare la presenza di una
o proteina. È solitamente performata a livello di piastre di micro titolazione
È una tecnica semplice e ad alta risoluzione, sicuramente più semplice
o del western blot
Può essere indiretta o a sandwich (la prima per la rivelazione
o dell’anticorpo, la seconda per la rivelazione dell’antigene, ossia la nostra
proteina d’interesse).
Sandwich (anticorpo primario + proteina + anticorpo secondario
recante una HRP e rivelazione con luminolo)
Indiretta (proteina + anticorpo primario + anticorpo secondario
recante una HRP e rivelazione con luminolo)
Ovviamente, tra tecniche dirette ed indirette, le dirette avranno segnale
luminoso molto inferiore a quello indiretto
Per ex, posso usare questa tecnica direttamente su cellule se la nostra
o prot espressa è di membrana
Nota: FLUORESCENZA
Fluorescenza =/= fosforescenza (la differenza dipende dai secondi con
o cui si esprime la luce)
Cofluorescenza: possibilità di marcare due proteine diverse con due
o anticorpi primari e secondari diversi nella stessa metodica. I due fluoro
cromi usati devono NECESSARIAMENTE avere spettri di assorbimento e
di espressione diversi, che non si accavallano.
Spettro di assorbimento/eccitazione: relazione tra assorbimento e
o lunghezza d’onda.
Spettro di emissione: relazione tra emissione e lunghezza d’onda.
o I fluoro cromi stessi sono stati ideati in modo da avere picchi di
o assorbimento ed
emissione molto
stretti, così da
1.Flusso ad
essere più
alta pressione
specifici e più
con al centro il
distanti tra loro.
campione,
Tra
o
schiaccia le
assorbimento ed
cell in una sola
Flusso al alta Campion
4.gocce
fila 2.Cella di
pressione e
3.“muzzle
Purifica Tecniche di purificazione di prot ricombinanti: compromesso
z purezza/funzionalità biologica
di Scelta della tecnica più opportuna: l’utilizzo commerciale e
o
protein farmacologico di prot ricombinanti necessita specifici gradi di purezza e
e funzionalità. La maggiore tecnica di purificazione dovrebbe conferire
100% di purezza e 100% di attività biologica.
Il compromesso purezza/funzionalità biologica è strettamente
o dipendente dal
grado di
complessità
strutturale della
proteina di
interesse
Struttura/funzione
prot scelta della
tecnica più
opportuna
Tecniche più
o utilizzate per la
purificazione di
prot ricombinanti
(a sinistra)
Conoscere le
o proprietà
biochimiche per
stabilire la giusta strategia di purificazione:
Peso molecolare, forma, contenuto di aa (per la carica), punto
isoelettrico, distribuzione di carica, solubilità (influenzata da forza ionica
e pH), densità (lipoproteine <proteine <fosfoproteine), idrofobicità
(distribuzione dei residui idrofobici), capacità di legare metalli o altre
molecole, capacità di associazione e dissociazione, specificità di seq o di
struttura, presenza i modifiche post traduzionali, etc
Posso stabilire tali proprietà durante lo sviluppo del costrutto di espressione.
I. SALING OUT CON SOLFATO D’AMMONIO
Una concentrazione troppo elevata di sale rende l’intacco del guscio di
solvatazione della proteina, e quindi la possibilità di agglomerarsi ad alte
proteine e precipitare. Questo metodo, il salting out, è solitamente
performato con solfato d’ammonio perché è estremamente solubile in
acqua.
Il metodo fornisce prot a basso grado di purezza, tendenzialmente
denaturare dall’elevata forza ionica utilizzata.
II. BLUE NATIVE PAGE / SDS PAGE
Tecnica del 1991, è più che altro una metodica analitica descritta come
o una elettroforesi atta alla solubilizzazione di complessi proteici dalla
membrana di origine.
è definita ‘native’ perché non denatura le proteine, ‘blue’ perché usiamo
o il comassie blue G250, che rende una parziale carica negativa assoluta
al campione (lega aa basici e idrofobici).
Usiamo detergenti non forti, ma blandi, come la digitonina, il
o dodecilmaltoside.
Determineremo le strutture delle sub unità di un complesso, ma anche
o interazione prot-prot e funzionalità di queste
Generalmente questa tecnica è la “prima dimensione” di una metodica
o che vede come seconda dimensione l’SDS PAGE, in modo da avere
ancora più alta risoluzione in una condizione di denaturazione proteica.
Questi metodi, come la maggior parte delle elettroforesi, sono dette
o “zonali” perché utilizzano supporti solidi, nel nostro caso agarosio o
poliacrilammide. Per tirar via le proteine dal gel di solito si procede con
diffusione semplice o elettroeluizione, ma in questo modo la funziona
biologica viene compromessa
III. CROMATOFRAFIE
La tecnica più utilizzata. Una miscela di componenti (C) dispersi in una
o fase mobile (M), fatta muovere in una fase stazionaria (S) si distribuirà
lungo la faste stazionaria secondo un coefficiente di distribuzione (K).
K è il rapporto delle concentrazioni del componente C tra la fase S ed M
(K = Cs/Cm), è specifico per ogni componente della miscela, e questo ci
aiuta a differenziare i composti.
Ogni componente della miscela sarà in equilibrio fra le due fasi: Cm↔Cs
La cromatografia di affinità è la più usata. Useremo una resina che
o espone, con un braccio spaziatore, un ligando per cui la nostra
macromolecola è sensibile. In questo modo la divideremo dal resto dei
composti.
Con questo metodo posso purificare proteine con un tag di affinità! Per
o esempio, con il tag di HIS c’è la IMAC (Immobilized Metal Affinity
Chromatography), per esempio con ligando di Nickel.
La resina in biglie (speharose) usata espone il braccio spaziatore con
acido iminodiacetico (funge da collante) per un atomo di Ni, che ha
carica positiva. Ad un pH fisiologico, l’HIS ha un azoto nell’anello
imidazolico che è carico negativamente ed entra in interazione con il Ni.
Nota: le HIS del tag DEVONO essere libere e non nascoste in tasche
ripiegate della prot.
L’eluente sarà l’imidazolo, che ha la stessa struttura, e quindi può
sbalzare via le HIS e permettere l’eluizione (eluizione specifica).
Ovviamente, per evitare che l’imidazolo permanga in soluzione,
o ripassiamo l’eluito in una cromatografia ad esclusione molecolare.
Essendo una molecola più piccola della proteina, rimarrà intrappolata
per più tempo nelle maglie della resina della colonna, permettendo a noi
di eluire immediatamente le prot di interesse.
Oppure con dialisi. Teniamo la colonna cromatografica n un sacchetto da
dialisi. Il parametro di discriminazione sarà la porosità del sacchetto; le
macromolecole rimangono all’interno e quelle più piccole escono.
Abbiamo applicato il principio di diffusione.
[dopo eluizione: SDS PAGE, colorazione con comassie, elettroblotting per
trasferimento su filtro, immunoblotting con anticorpo specifico]
Oltre a quella c’è anche una IMAC con atomo di cobalto. (stesso
o funzionameno)
Oppure possiamo gettarci sulla proteina di fusione. La più usata è la GST
o (glutatione S trasnferasi), poiché ha attività biologica nota. Allo stesso
modo, dobbiamo progettare tale situazione fin dal vettore di
espressione, ed inserire la CDS della GST accanto alla frame della mia
seq eterologa.
La cromatografia avrà quindi come ligando il glutatione stesso
(tripeptide), che tratterrà la prot di fusione in colonna. L’eluizione
avviene con glutatione ridotto, ancora più affine per l’enzima, che lo
trascinerà verso l’eluizione.
Successivamente dovremo pensare ad eliminare tale eluente (dialisi) e a
tagliare chimicamente (1mM Calcio + 1mM EDTA) o enzimaticamente la
prot di fusione per ottenere la nostra.
ANTIBODY-BASED AFFINITY CHROMATOGRAPHY
Tecnica ad alta specificità, dato che utilizza un anticorpo che riconosce
o naturalmente il proprio elemento di legame
Sistemo l’ab legato alla fase stazionaria della colonna; ma dopo
o l’adsorbimento, come divido l’ab dalla macromolecola? (sono molecole
avide, non si dividono) Uso quindi un buffer a pH molto acido (3 o 2) per
diminuire l’affinità tra le due molecole. Ma così rischio di denaturare la
proteina; per evitare, tampono con un pH basico all’uscita dalla colonna.
Abbiamo rischiato, ma la proteina all’uscita avrà alto grado di purezza
o (quasi 100%!) purtroppo la funzionalità è in dubbio.
Compromesso purezza/funzionalità: in alcuni casi la presenza di tag
compromette in modo irreversibile il folding e la funione della prot di
interesse. Anche se è possibile eliminarlo, il suo effetto negativo si esplicita
durante la sintesi e le modificazioni post-traduzionali della prot. In questi
casi non è possibile utilizzare la cromatografia di affinità. Si utilizzano
teniche meno performanti di purezza, ma compatibili con la funzione
biologica, come:
CROMATOGRAFIA AD ESCLUSIONE MOLECOLARE
Uso una matrice inerte (biogel P, biogel A),composta di sfere di resina
o attivate dall’acqua. Facendo colare la mia
soluzione contente proteine, le molecole più
piccole occuperanno il volume interno delle
sfere di resina, che riterranno le molecole
piccole molto a lungo.
Le molecole grandi, impossibilitate ad entrare
nelle sfere, sgusciano tra queste a più alta
velocità, dato che occupano solo il vol esterno
alle sfere. Tempo di eluizione minimo.
È sia denaturante che nativa, dipende dalla
o funzione.
Questo metodo dipende dalla lunghezza della colonna e dalla natura
o dell’impaccamento ( n° piatti teorici, la superficie di relazione tra fase
stazionaria e fase mobile)
Ex: uso la tenica per separare proteine con strutture sovra molecolari. In
cellula ci sono pochi concorrenti di composti così voluminosi. Ma bisogna
mantenerne l’integrità strutturale o non funzionerà. Possiamo applicare la
cromat ad esclusione molecolare in forma nativa, e avremo un buon 60% di
grado di purificazione.
A SCAMBIO IONICO
Scambiatori ionici sono usati nella resina, e l’interazione avverà per carica
opposta. Scambiatori anonici: DEAE (dietilaminoetil) cellulosa // scambiatori
cationici: fosfocellulosa
Trasferi Metodi di trasformazione genica per prokarya:
m CLORURO DI CALCIO: trattandole con cloruro di calcio, la membrana
o
ento cellulare è più permeabile al DNA. Questa tecnica si utilizza per quelle
genico cellule che non sono naturalmente competenti come E.coli.
ELETTROPORAZIONE
o SHOCK TERMICO: l’E.coli competente è posta da una temperatura da 0° (20min)
o ++
a 42° (50 sec) a -4°C, in presenza di CaCl2. I cationi Ca hanno lo scopo di
neutralizzare le cariche negative dei fosfolipidi della membrana cellulare, creando
le prime fratture della membrane stessa, mentre la continua e rapida variazione di
temperatura ne aumenta le permeabilità.
Nota: è errato pensare che 1 molecola di DNA entri in un solo batterio. Più molecole
permeano al suo interno, non c’è controllo su questo.
Nota: di solito gli E.coli sono trasformati in modo ‘sconosciuto’, perché le aziende non
lo rivelano. Sono usati principalmente per il clonaggio.
Cellule per clonaggio: efficienza di Cellule per sub clonaggio: efficienza di
trasformazione alta. Abbiamo intenzione trasformazione bassa. Abbiamo
di esprimere la CDS. Di solito sono intenzione di amplificare il vettore. Di
cellule provenienti da aziende. solito sono cellule di lab trattate con
cloruro di calcio.
Selezione di cellule trasformate: con antibiotico (quello di cui si porta la resistenza nel
costrutto utilizzato)
Metodi di trasformazione genica per eukarya:
INFEZIONE VIRALE: il DNA di un virus viene maneggiato e modificato per poter
o esprimere una CDS desiderata, quindi ri-impacchettato in un virus. Sfortunatamente
deve essere maneggiato con grande prudenza
Svantaggi: i tempi di definizione sono lunghi. Ci vogliono abilità.
Vantaggi: alta efficienza di trasferimento di DNA in cellula.
TRASFEZIONE: il plasmide è trasferito in cellule in coltura, in alcuni casi anche in
o vivo.
Vantaggi: metodo rapido e facile da eseguire.
Svantaggi: alcuni tipi cellulari non si trasfettano efficacemente.
INIEZIONE IN CELLULA: il DNA è iniettato direttamente in cellule
o Vantaggi: metodo diretto
Svantaggi: può essere tecnicamente difficile da eseguire
Metodi di trasfezione
1. DEAE destrano
2. Precipitazione con fosfato di calcio
3. Elettroporazione
4. Liposomi cationici
DEAE destrano: l’utilizzo dei reagenti chimici per la trasfezione è stato introdotto nel
1965 con la scoperta del DEAE destrano, un polimero cationico che si lega strettamente
ai gruppi fosfato de DNA carichi negativamente (dalla sua parte ha una N che a pH
fisiologico è carica positivamente). Queste grosse particelle contenenti DNA aderiscono
alla superficie delle cellule e vengono introdotte al loro interno mediante endocitosi.
Questo metodo, sebbene sia semplice, è poco efficiente per molti tipi cellulari, e quindi
poco affidabile per saggi di routine dall’attività biologica di una preparazione di DNA
purificato.
Primo metodo usato per l’introduzione di DNA in cell eukarya
Destrano: polisaccaride di unità di D-glucosio legate con legami alfa1/4 o
alfa1/6 glicosidici. Quando viene associato a gruppi carichi positivamente
DEAE è in grado di legare DNA e di mediarne l’ingresso attraverso membrane
Vantaggi: semplice
Svantaggi: poco efficiente, solo trasfezioni transienti
COPRECIPITAZIONE CON FOSFATO DI CALCIO
Tale metodica venne introdotta nel 1970 grazie alla scoperta che le cell sono in grado di
captare in maniera efficiente il DNA sottoforma di un precipitato con fosfato di calcio.
Il protocollo base per questo tipo di esperimento prevede che si isoli il Dna che viene
poi miscelato con una soluzione accuratamente tamponata contenente fosfato.
L’addizione di cloruro di calcio forma un fine precipitato di fosfato di calcio e DNA,
che si distribuisce su un monostrato di cell, lasciate poi in incubazione a 37°C per
diverse ore (4/16h), durante le quali molte di esse captano il DNA esogeno. Il
precipitato viene poi rimosso dalle cell alle quali viene aggiunto terreno di coltura
fresco.
Il DNA a contatto con la doluzione di fosfato di calcio forma dei precipitati i
quali, con meccanismo poco noto, entrano in cellula
Gli ioni bivalenti possono promuovere l’ingresso di acidi nucleici attraverso le
membrane
Vantaggi: economico
Svantaggi: delicato (forma e dimensione del precipitato + influenzato da
variazioni anche minime di pH), efficienza bassa, elevata citotossicità, non
funziona con alcuni tipi cellulari
ENTRAMBI I METODI CHIMICI CITATI sono poco dispendiosi e garantiscono una
moderata efficienza di trasfezione in numerosi tipi cellulari. Tuttavia presentano alcuni
svantaggi: sono infatti abbastanza tossici (soprattutto il metodo DEAE destrano); sono
soggetti ad una certa variabilità. Inoltre il DEAE destrano pià essere usao solo per
trasfezioni transienti in cui il campione viene testato 72 ore dopo l’introduzione del
DNA esogeno nelle cellule. È stato quindi necessario mettere a punto differenti
metodiche in grado di assicurare efficienze di trasfezione elevate anche in tipi cell
poco sensibili alla trasfezione con le due metodiche chimiche sopracitate.
MICROINIEZIONE: permette l’introduzione direttamente di acidi nucleici nel nucleo o
nel citoplasma della cellula, attraverso l’ausilio di un elettrodo con una punta molto
fine, montato su uno specifico iniettore. Nonostante l’elevata efficienza, tale metodo
non viene utilizzato spesso a causa dei costi non indifferenti dell’apparato e delle
difficoltà tecniche.
Il DNA è inserito in cellula attraverso un capillare di vetro, con un sistema ad
alta pressione.
Vantaggi: trasferimento selettivo, aumenta efficienza di espressione, modulare
facilmente livello di espressione
Svantaggi: tecnicamente impegnativa, poche cellule alla volta, costoso
ELETTROPORAZIONE: le cell, poste in una soluzione contenente il DNA, sono
sottoposte ad un breve impulso elettrico che produce pori transitori nelle membrane,
attraverso cui il DNA esogeno può entrare. Tale tecnica richiede però un numero molto
elevato di cell di partenza, a causa dell’elevato tasso di morte cellulare che si osserva
nel corso degli esperimenti. Occorre quindi bilanciare l’efficienza di trasfezione con la
percentuale di morte cellulare.
Vantaggi: utile su quei tipi cellulari in cui non si ottengono risultarti con metodi
classici
Il DNA entra direttamente senza passare attraverso il compartimento
endosomiale, dove può aver luogo la degradazione dell’ac nucleico
Si può usare su cell in vivo! (per ex, su cellule tumorali per seguirne lo sviluppo
in vivo. Ovviamente la dpp è rivolta sulla massa tumorale solamente.
Per ex, su topi. Supponiamo di conoscere una prot della cancerogenesi, e di
voler andare ad interferire con i messaggeri della proteina (RNA interfearence).
Nel nostro caso, usiamo siRNA per interferire con l’espressione di prot
cancerogene. Più concentrazione di siRNA, più il melanoma diminuisce di
massa, quindi l’elettroporazione servirà a immetterne molto.)
Esistono veri e propri metodi che rientrano nell’elettochemioterapia, così da poter
inibire la crescita di tumori.
Svantaggi: necessità di ottimizzare le condizioni del campo elettrico (intensità e
durata)
Elevato livello di tossicità
I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher daniela_tortorella di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Ingegneria cellulare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Bari - Uniba o del prof Pisani Francesco.
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