Appunti di genetica - docente Chiara Scapoli

ESPERIMENTI DI BAETSON E PUNNET (1905)

Lathirius odoratus

P. fiore purpureo | polline allungato X fiore rosso | polline rotondo

F1: fiore purpureo | polline allungato

F2: fiore purpureo | polline allungato, fiore rosso | polline rotondo, fiore purpureo |

polline rotondo, fiore rosso | polline allungato

NB! rapporti:

Eccezione alla legge dell’assortimento indipendente.

Rispetto a quanto atteso in caso di segregazione indipendente Bateson e Punnet nella

generazione F2 ottennero quindi troppi (296+85/427=89,2%) individui che per

entrambi i caratteri manifestavano lo stesso fenotipo di uno o dell’altro genitore del

diibrido. (fenotipi parentali) e troppo pochi (19+27/427=10,8%) individui che

manifestavano fenotipo di un genitore del diibrido per il primo carattere e quello

dell’altro genitore per il secondo o viceversa (fenotipi ricombinanti).

In entrambi gli esperimenti

Problema risolto da Morgan

Tipi di mutazione nella Drosofila:

Morgan aveva un sacco di mutanti. Facendo l’incrocio reciproco riusciva ad individuare

i geni associati al cromosoma X.

Occhi rossi: tutte femmine (prendono X dal padre)

Occhi bianchi: tutti maschi (prendono X dalla madre)

TRASMISSIONE CONIUGATA DI CARATTERI X-LINKED (MORGAN 1911)

P: occhi bianchi|ali ridotte X

selvatico

F1: selvatico (tutti maschi)|

occhi bianchi|ali ridotte (tutte

femmine)

F2: occhi bianchi|ali

ridotte(F/M), selvatico (F/M),

occhi bianchi|ali wild type

(F/M), occhi wild type|ali

ridotte (F/M)

Sembra un re incrocio:



fenotipo dominante X fenotipo recessivo (1/4:1/4:1/4)

NB! Rapporti:

Attese re incrocio: ¼ x 2441 = 610,25

Testi di verifica: chi-quadro!

2

X =169,78 -> 3 gradi di libertà (4-1) -> punto critico = 7,82 -> a sx della soglia c’è la

regione di accettazione. A dx c’è l’area di rifiuto perché il chi-quadro è significativo.

In questo caso il chi-quadro cade a dx, è significativo e rifiuto l’ipotesi nulla! Rifiuto

che i caratteri abbiano assortito indipendentemente.

Gli alleli non segregano in modo indipendente.

Oggi sappiamo che i geni che controllano il colore del fiore e la forma del polline

 sono posizionati sullo stesso cromosoma (GENI ASSOCIATI o GRUPPI DI

ASSOCIAZIONE). Eccezione alla II legge di Mendel: ASSORTIMENTO NON

INDIPENDENTE

Se sono su geni diversi: 4 classi di ugual frequenza (1/4) e in un re incrocio il

 carattere recessivo viene utilizzato perché mette in evidenza come sono stati

costruiti i gameti durante la meiosi. ASSORTIMENTO INDIPENDENTE

Linkage group = in numero di geni in una specie è sicuramente superiore al numero di

cromosomi.

Le combinazioni sono le stesse, cambiano le proporzioni.

Il fenomeno citologico alla base della ricombinazione è il crossing-over

4/05/18

-Nell’incrocio a 3 punti guardo solo la frequenza numerica delle 8 classi fenotipiche

perché è sempre un re incrocio. Devo capire quali sono i parentali.

-Con un incrocio a 2 punti vale l’opposto perché la finalità è quella di stabilire con il chi

quadro se i due caratteri sono indipendenti o no.

incorcio fra ibridi attesa -> 9331

re incrocio attesa -> ¼:1/4:1/4

SITUAZIONI CHE ALTERNAO LA DISTRIBUZIONE DEI CHIASMI

- Un precedente evento porta all’interferenza

- Regioni etero cromatiche

- Costituzione genetica, es Drosophila

->nel maschio non avviene ricombinazione perché non ha la struttura

enzimatica, mentre nella femmina avviene

- Aberrazioni cromosomiche

- Età

- Temperatura ecc…

CORREZIONE INTERFERENZA

Costruzione della mappa genetica.

Tipologie di mappe:

- mappa genetica: basate sulla % di ricombinazione

- mappa citogenetica

- mappa fisica: basate su metodi come elettroforesi su gel o sequenziamento del

DNA

Tutte le mappe sono colineari. La distanza genetica è diversa dalla distanza fisica, ma

l’ordine dei geni non cambia se non ci sono errori.

SINTESI

- La concatenazione dei geni, cioè la presenza di più geni sullo stesso

cromosoma, fa si che la loro trasmissione non sia indipendente.

- L’associazione degli alleli sullo stesso cromosoma è modificata dal fenomeno

genetico della ricombinazione, a cui corrisponde il fenomeno citologico del

crossing-over.

- La probabilità di ricombinazione è proporzionale alla distanza fra loci sul

cromosoma; si può stimare la seconda sulla base della prima: mappe genetiche

- Un metodo classico per mappare i geni negli eucarioti è l’incrocio a tre punti

Il modello di Holliday descrive il meccanismo molecolare della ricombinazione.

Il crossing overe avviene durante la profase della meiosi (perché c’è l’appaiamento

degli omologhi), molto raramente può avvenire anche durante la mitosi.

Il fenomeno citologico alla base della ricombinaizipne è il crossing over

TIPI DI RICOMBINAZIONE

- OMOLOGA: riguarda scambi di materiale genetico tra sequenze molto simili

cioò che possiedono ampie regioni omologhe (durante la meiosi)

- SITO-SPECIFICA: gli scambi si verificano tra sequenze con limitata similarità,

quindi coinvolgono siti specifici

- TRASPOSIZIONE: riguarda solitamente un breve segmento di DNA che data la

sua struttura possiede una notevole capacità di spostarsi da un sito del

cromosoma ad un altro (trasposoni).

RICOMBINAZIONE OMOLOGA:

A cosa serve? È coinvolta non solo nel crossing over durante la meiosi ma anche:

- nel recuperare sequenze perse per danni al DNA (DSBR=double-strand break

repair);

- per far ripartire forche replicative danneggiate

- può regolare l’espressione di alcuni geni

- trasferimento genico orizzontale (procarioti): es virus che va ad infettare un

batterio.

A seconda dell’organismo (procarioti/eucarioti) e della funzione, la ricombinazione

omologa può procedere con diversi modelli.

RICOMBINAZIONE OMOLOGA MEIOTICA

- La ricombinazione permette di separare i vari geni nel genoma e creare nuove

combinazioni

- Le ricombinazioni avvengono tra sequenze che corrispondono perfettamente

cosi da non perdere nessuna base del cromosoma ricombinante

- La frequenza di ricombinazione non è costante lungo tutto il cromosoma ma

varia con effetti globali e locali

- Avviene 2 volte più frequentemente nella femmina che nel maschio

- Dipende dalla struttura del cromosoma ed il crossing-over non avviene in

vicinanza di regioni condensate della cromatina

PASSAGGI DELLA RICOMBINAZIONE OMOLOGA MEIOTICA

1. ALLINEAMENTO: di due molecole di DNA omologhe

2. Introduzione di ROTTURE del DNA

3. Formazione di una corta regione di appaiamento: INVASIONE del filamento e

formazione della HOLLIDAY JUNCTION

4. Movimento della Holliday junction: BRANCH MIGRATION

5. Taglio della giunzione: RISOLUZIONE

La ricombinazione omologa può intervenire quando sono presenti:

- Due mlecole di dsDNA omologhe in sequenza

- Almeno una delle due molecole presenti un interruzione du dingolo filamento o

su entrambi i filamenti

Modelli di ricombinazione:

- DSB.initiated model: taglio a singolo filamento

- Nick-initiated models:

MODELLO DI HOLLIDAY – ROTTURA AD ELICA SINGOLA

1. I DNA si appaiano. Si ha un taglio ai siti corrispondenti, le terminazioni libere

invadono il filamento opposto. Le due emieliche che si appaiano hanno la stessa

polarità

2. Formazione della giunzione di Holiday

3. Migrazione del chiasma catalizzata da enzimi. Formazione eterodouplex:

appaiamento temporaneo di eliche non complementari.

RISOLUZIONE DELLA GIUNZIONE DELLA HOLLIDAY JUNCTION

La risoluzione della giunzione di Holliday da luogo a ricombinazioni convenzionali o

recombinant patches in base allo strand che è tagliato.

1. MODELLO DI HOLLIDAY

in questo primo caso intervengono la proteina RecA (media l’invasione) e altre

due proteine denominate:

- RecQ con funzione elicasica

- RecJ con funzione nucleasica

Oltre a queste specifiche proteine intervengono anche una DNA polimerasi ed

altri fattori ad attività sconosciuta.

RecA veicola dentro l’emielica il singolo filamento.

2. MODELLO DSB (DOUBLE STRAND BREAK)

Si prevede una neosintesi di DNA che vanno a ricoprire quello che era stato

degradato durante il processo di ricombinazione

Aspetti molecolari:

In questo secondo caso interviene il compesso delle proteine RecBCD.

Il complesso RecBCD ha attività

-elicasica

-esonucleasica per DNA a singolo e doppio filamento

-endonucleasica per singolo filamento

In E.Coli il sistema di riparazione dei double stramd breaks (DBS) è il sistema

RecBCD che è un complesso multifunzoonale

Il complesso si lega a DSB, ha attivita elica sica e nucleasica e tagli aentrambi i

filamenti:

- elica sica per aprire la doppia elica di DNA

-nucleasica su DNA ss e ds

ATPasica (idrolizza ATP)

Siti chii (verdi)

Il sistema batterico RecBCD è stimolato dalle sequenze chi (cross-over Hotspot

Instigator, CHI)

LE SEQUENZE CHI

E.coli contiene un numero molto elevato di sequenze chi (X).

Sequenza specifica di basi (%’ GCTGGTGG 3’)

Nel cromosoma di E.coli è presente una sequenza Chi circa ogni 5kb.

RUOLO DELLA PRTEINA RecA

Grazie a questo processa mento mediato dal complesso RecBCD si può creare

una regione di DNA a singolo filamento.

RecA sarà in grado di riconoscere e legarsi a questo filamento di ssDNA.

Si potrà avere il processo di ricombinazione per invasione di una regione

omologa di dsDNA da parte del complesso RecA-ssDNA

MECCANISMO DELLA RICOMBINAZIONE

Gli aspetti importanti di entrambi i modelli sono:

- Il ruolo della proteina RecA

- La migrazione del chiasma

- La formazione degli eterodouplex

- La risoluzione delle strutture Holliday

RUOLO DELLA PROTEINA RecA

RecA è una proteina fondamentale nel processo di ricombinazoone omologa. Ceppi

recA difettivi hanno un efficienza di ricombinazione ridotta di circa 1000 volte.

RecA ha omologhi in tute le specie batteriche (negli eucarioti Rad51 e Dmc1)

RecA necessida di DNA SS per iniziare il processo di appaiamento.

E’ fondamentale nella ricerca della complementarità tra eliche.

RecA è una ATPase DNA dipendente in grado di idrolizzare ATP in presenza di DNA.

RecA si lega al DNA SS in presenza di ATP (si lega ogni 3 bp)

Un complesso RecA-ssDNA può legaris e svolgere (rompendo legami idrogeno) un’altra

molecola di DNA ds promuovendo l’appaiamento dei nucleotidi nel ssDNA con le basi

nel filamento complementare di dsDNA:

RecA: forma attiva è legata al filamento nucleo proteico (100 subunità di RecA e 300

nucleotidi)

(aumento della lunghezza del DNA legato a RecA)

RICERCA D