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Come induce la crescita per distensione? Essa è accompagnata da un grande aumento

del volume vacuolare e un modesto o nullo aumento del citoplasma, aumenta quindi

l’area superficiale del plasmalemma e quella della parete cellulare. A tal fine è

importante anche la presenza del saccarosio, che è un osmolita che viene assorbito ed

eleva il turgore cellulare.

Dato che l’auxina è un morfogeno, avrà effetti diversi in base alla sua concentrazione.

Infatti la crescita aumenta fino a [IAA] di circa 10^-5 M, ma a concentrazioni maggiori

la crescita si riduce fin sotto il livello di controllo. Forse la causa è la sintesi di etilene.

Inoltre si è osservata una proporzionalità diretta tra efflusso di protoni e crescita.

Teoria della crescita acida:

Quindi in conclusione si è formulata la cosiddetta 17

L’auxina attiva le ATPasi già presenti o induce la sintesi di nuove ATPasi?

L’auxina agirebbe con entrambe le modalità di azione, poiché esistono prove

sperimentali a favore sia di un’azione che dell’altra. E’ quindi possibile che IAA agisca

sia attivando le ATPasi pre-esistenti che inducendo la sintesi di nuove molecole di

ATPasi che sarebbero inserite nel plasmalemma.

Cholodny-Went

Il modello ipotizza che la percezione di uno stimolo luminoso

direzionale provochi il trasporto laterale di auxina, causando la crescita differenziata.

L’aumento dei livelli di auxina induce la maggiore distensione delle cellule del lato in

ombra e quindi l’incurvamento verso la luce. La trascrizione del promotore sintetico 18

DR5 indotta da auxina è alta sul lato in ombra di ipocotili di Arabidopsis stimolati dalla

luce. Il trattamento con NPA blocca la curvatura fototropica. Il trasporto unilaterale di

auxina coinvolgerebbe il blocco del sistema di trasporto polare di IAA

(inibizione/destabilizzazione di ABCB19 e PIN1), mentre sarebbe favorito il trasporto

laterale mediato da PIN3, che a sua volta sarebbe rilocalizzata.

Esperimenti su mutanti di Arabidopsis non rispondenti all’illuminazione unilaterale,

hanno evidenziato una

mutazione del gene phot1 codificante per una proteina detta fototropina. La

fototropina è una

serina/treonina chinasi di membrana con PM 116 kDa. La proteina presenta attività

chinasica nella

porzione COOH-terminale, mentre in quella NH2 -terminale possiede i siti di legame al

flavin mononucleotide (FMN). A seguito dell’illuminazione con luce blu assorbita dal

FMN la fototropina si autofosforila.

L’autofosforilazione porta al distacco della fototropina dal plasmalemma e alla sua

interazione con i

trasportatori di auxina. È stato dimostrato in coleottili che a seguito della illuminazione

unilaterale si forma

un gradiente di autofosforilazione della fototropina che sarebbe responsabile del

movimento laterale di

auxina.

Effetto opposto avviene a livello della radice. L’aumento della concentrazione di

auxina nel lato inferiore della radice crea una concentrazione sovraottimale ed inibisce

la distensione causando la curvatura verso il basso della radice. La gravità nella radice

è percepita grazie alla cuffia. Se si mantiene la radice in posizione verticale e si

rimuove la cuffia, la radice non cambia direzione. Se si rimuove parte della cuffia, la

radice si incurva. Se si pone la radice orizzontalmente con la cuffia, questa si incurva

verso il basso, se la cuffia è rimossa, continua a crescere in orizzontale. Inoltre la cuffia

produce un inibitore della crescita, perché quando rimossa la radice si accresce di più.

Come può percepire la gravità?

La cuffia contiene statoliti che seguono la gravità e si posizionano verso il centro della

Terra. Se la direzione della radice è verticale, gli statoliti “cadono” proprio sul reticolo

endoplasmatico, esercitando su di esso una pressione uniforme. Se la radice è posta

orizzontalmente, la caduta degli statoliti non incontra il RE oppure esercita su di esso

una pressione disuguale. 19

Tornando all’auxina, questa percepisce la gravità grazie a PIN3. Questo carrier infatti

cambia polarità in risposta al cambiamento del vettore gravitazionale.

Ricapitolando il modello attuale del gravitropismo della radice:

Effetti dell’auxina sullo sviluppo

L’auxina influenza tutti gli stadi del ciclo vitale della pianta. Attraverso il trasporto

polare, determina lo sviluppo del fusto e della radice. La polarità di trasporto

dell’ormone si realizza a partire dallo sviluppo dell’embrione e continua per tutto lo

sviluppo della pianta.

In questo contesto, l’auxina può agire come:

1. morfogeno durante l’embriogenesi 20

2. formazione di pattern nello sviluppo

3. fattore scatenante eventi di sviluppo

Morfogeno nell’embriogenesi: in Arabidopsis il gradiente di auxina è necessario per la

formazione dlla radice, quindi è importante la distribuzione delle proteine PIN. Queste

ultime definiscono anche i pattern embrionali.

Se si interferisce con la biosintesi di auxina (mutanti yucca) o col meccanismo di

signaling (mutanti arf) o ancora con il meccanismo di trasporto (mutanti pin) si ottiene

un fenotipo privo di radici.

Morfogeno a livello dell’apice radicale: le cellule distanti dall’apice radicale (zona di

distensione) sono soggette ad un basso livello di auxina, e quindi si distendono e

differenziano. Le cellule vicine all’apice sono soggette ad un livello intermedio di

auxina e quindi si dividono spesso. Infine le cellule del centro quiescente sono

soggette a livelli di auxina molto alti e restano appunto quiescenti.

Morfogeno nella differenziazione dello xilema: 21

Gradiente radiale di concentrazione di auxina

nella zona cambiale di Pinus sylvestris. La figura mostra la quantità di fitormone in una

sezione di tessuto da 1 cm2 e 30 um di spessore. Studi ulteriori hanno mostrato che

non è la concentrazione assoluta di IAA nel cambio, ma la sua distribuzione radiale ad

essere coinvolta nella differenziazione del floema e dello xilema. Nella posizione in cui

differenzia lo xilema, il gradiente radiale di auxina è più piatto che nella direzione del

floema. L’auxina forma un gradiente di concentrazione diretto dal cambio cribro

vascolare verso floema (esternamente) e xilema (internamente) in corso di sviluppo.

Agente scatenante: La localizzazione di una concentrazione massima (o minima) di

auxina in un tessuto vegetale è sufficiente a causare l’inizio di eventi di sviluppo. Per

esempio scatena nell’apice lo sviluppo del fiore. L’auxina trasportata nell’apice

caulinare regola l’avvio della formazione di foglie ed anche la fillotassi, ossia il pattern

di emergenza delle foglie dall’asse del fusto.

Nelle giuste dosi può anche indurre la formazione di radici laterali e avventizie.

Una concentrazione minima di auxina è necessaria in Arabidopsis per la dispersione

dei semi. Il frutto (siliqua) deve aprirsi e la separazione delle due valve è preceduta da

un minimo locale di auxina, seguito da lignificazione. Il gene IND (indeiscenza)

determina la formazione del punto di rottura ed è coinvolto nella formazione di un

minimo di auxina. Si osserva infatti che nel punto di rottura PIN3 è assente, mentre nel

mutante ind-2 PIN3 si localizza indistintamente in tutti gli strati cellulari.

Ciò significa che PIN3 è regolato nello strato di separazione, e IND previene la

localizzazione polare di PIN3 in questa regione.

La regolazione IND-dipendente di PID e WAG2 chinasi costituisce un meccanismo per

localizzare PIN durante la formazione dei margini. IND infatti è un fattore di

trascrizione: inibisce PID ma induce WAG2 che promuove la separazione delle cellule.

Il controllo dinamico della distribuzione dell’auxina causa uno switch della simmetria

da bilaterale a radiale durante la formazione del pistillo. I fattori di trascrizione

necessari sono IND e SPT: 22

Nello stadio 5, si hanno picchi di auxina nella parte laterale apicale del pistillo,

sostenendo una crescita apicale-basale. Negli stadi 8 e 9 SPT e IND reprimono PID,

promuovendo la localizzazione apolare di PIN e quindi l’accumulo di auxina nella parte

centrale alta e formando un anello agli stadi 10-11.

Manipolazione genetica del trasporto di auxina può causare perdita di radializzazione o

“aiutare” mutanti con difetti di radializzazione.

Dominanza apicale, due modelli a confronto: 23

Infine, l’auxina promuove lo sviluppo dei frutti. La formazione della fragola, che è un

falso frutto, è regolata dalla liberazione di auxina dagli acheni (i semini). Se gli acheni

sono rimossi il frutto non si sviluppa. In orticoltura le auxine sintetiche, se spruzzate

sui fiori non ancora impollinati, servono per produrre frutti senza semi (partenocarpia)

soprattutto in piante appartenenti alle famiglie delle Solanaceae (pomodoro e

peperone) e Cucurbitaceae (cetriolo e zucchino) e nel genere Citrus.

MERISTEMA DELL’APICE RADICALE (RAM)

Una importante differenza tra sviluppo animale e vegetale è che mentre negli animali

si limita allo stadio embrionale, nelle piante permane per tutta la vita in determinate

meristemi.

zone ricche di cellule staminali, dette Nei meristemi le cellule si

moltiplicano, finchè non giunge il momento di differenziarsi (grazie alle espansine).

Le cellule staminali hanno un’organizzazione simile tra animali e piante:

- Germarium di Drosophila: le cellule staminali della linea germinale (GSC) sono

in contatto con le CP. Le discendenti delle GSC formeranno le cisti (CT) che si

dividono a formare una matta di cellule interconnesse. La cellula CT più matura,

cioè la più lontana dalle CP, è circondata da cellule follicolari FC, che sono

prodotte da cellule staminali somatiche. 24

- Cellule staminali ematopoietiche (HSC): le HSC entrano in contatto con le cellule

osteoblastiche (SNO), a loro volta attaccate alle trabecole ossee (TB). I primi

discendenti delle HSC sono cellule multipotenti (MPP), che poi daranno origine a

diversi tipi di cellule del sangue.

- Meristema dell’apice del germoglio: le cellule del centro organizzativo (OC)

esprimono il gene WUS e mantengono le sovrastanti cellule staminali (SC), che

sono circondate da una crescente popolazione di cellule della zona periferica

(PZ), da cui emergono i primordi delle foglie (LP).

- Meristema dell’apice radicale: le cellule staminali (SC) sono mantenute dal

centro quiescente (QC). I primi discendenti proliferano e danno origine alla

cuffia e alle altre cellule della radice.

Tutti i tessuti della radice originano da cellule staminali specifiche.

Sono i geni PIN a controllare le dimensioni dei meristemi e il pattern in radici di

Arabidopsis, ed è un’ auxina (NAA) a indurre l’espressione dei geni PIN (escluso PIN5).

Il trasporto dell’auxina è sufficiente per generare un massimo e una crescita della

radice guidata dal gradiente.

Lezione 23

EMBRIOGENESI (di Arabidopsis thaliana)

Caratterizzata da:

- Divisione cellulare orientata

- Espansione cellulare

- Comunicazione cellula-cellula

- Specificazione cellulare 25

Il che porta alla morfogenesi, cioè alla determinazione di forma e struttura.

Sviluppo della pianta: insieme di cambiamenti che avvengono per tutto l’arco della

vita della pianta. Durante lo sviluppo tessuti e organi crescono in dimensioni,

cambiano forma e specializzano le loro funzioni, quindi lo sviluppo va a pari passo con

la crescita.

Zigote: cellula diploide che deriva dalla fusione di pronuclei aploidi maschili e

femminili durante la fertilizzazione. Prolifererà in seguito nell’embrione pluricellulare.

Tutte le piante attraversano tre fasi dello sviluppo:

1. Embriogenesi (in questa fase si stabiliscono la simmetria e la polarità)

2. Sviluppo vegetativo

3. Sviluppo riproduttivo.

Sviluppo vegetale e animale a confronto:

- Tutte le cellule vegetali mantengono un certo grado di totipotenza anche dopo il

differenziamento. I tessuti possono infatti de-differenziarsi (callus) e poi

specializzarsi di nuovo in un altro tipo di tessuto (embriogenesi somatica).

- Le cellule animali hanno capacità di movimento, mentre quelle vegetali no, per

via della parete. Ciò richiede una sviluppata capacità di adattamento

all’ambiente.

- Durante l’embriogenesi della pianta, tessuti e organi adulti non vengono

generati direttamente. Nelle angiosperme si forma un corpo elementare, con

l’asse embrionale e i due cotiledoni. In particolare si formano due pattern:

quello apicale-basale (verticale) e quello radiale.

La fase della crescita vegetativa comincia durante l’embriogenesi e continua per

l’arco di tutta la vita, infatti le piante hanno delle regioni del corpo, i meristemi, in

cui si trovano le cellule indifferenziate, che si dividono per il resto della vita.

Ciclo vitale di Arabidopsis:

1. Nella sacca embrionale avviene la fertilizzazione. Il polline contiene due gameti,

che fertilizzano sia l’ovulo che la cellula centrale. Il primo formerà l’embrione e

la seconda l’endosperma.

2. Embriogenesi. Si sviluppa prima l’asse apicale-basale:

E poi quello radiale: 26

Dopo la fase a cuore c’è la torpedo e infine quella cotiledonare.

Nella fase di zigote fino all’ottante si sviluppa l’asse verticale, in quanto

esistono solo cellule apicali e basali. Nella fase proembrionale, cioè il

dermatogeno, si sviluppa anche l’asse radiale poiché abbiamo epidermide e

cellule interne. Nella fase globulare abbiamo l’ipofisi, che forma il CRC (central

root cap, cellule precursori) e la cellula a lente che forma il QC. Nella fase a

cuore abbiamo già endoderma e cellule corticali.

3. Plantula

4. Pianta vegetativa

5. Pianta in fiore

È lo stabilirsi dell’asse verticale che causa la corretta disposizione dei meristemi, dei

cotiledoni e dell’ipocotile.

L’auxina agisce nelle prime fasi embrionali controllando il differenziamento cellulare. Il

promotore sintetico DR5 agisce come AuxRE, cioè risponde all’auxina, e quando legato

ad un gene segnale come GFP mostra il campo d’azione dell’auxina stessa.

In questo modo possiamo vedere anche l’azione di PIN7, 1 e 4, anch’essi espressi nelle

fasi iniziali.

GNOM codifica per un fattore di scambio GDP/GTP per piccole G-proteine della classe

ADP ribosilation factor. Il trasporto polare dell’auxina è pesantemente compromesso

nei mutanti gnom. La sua espressione vascolare in fase globulare è importante per la

formazione dei meristemi radicali, invece l’espressione epidermica è importante per

mantenere il trasporto di auxina nell’epidermide per formare i cotiledoni. 27

Il gene ARF MP e AUX/IAA BDL sono co-espressi nelle prime fasi embrionali. BDL

inibisce MP: le mutazioni bdl e mp presentano fenotipo simile, ma la prima acquista

una funzione mentre la seconda ne perde una.

MP induce l’ipofisi a formare la cellula a lente e in seguito il centro quiescente (QC).

Inoltre MP controlla la formazione della radice regolando un fattore di trascrizione

mobile, TMO7. La comunicazione cellula-cellula è fondamentale in questa fase. I

bersagli di TMO7 si muovono verso l’ipofisi, e qui TMO7 promuove la corretta

definizione del piano di divisione dell’ipofisi.

I fattori di trascrizione homeobox wuschel related WOX2, 8 e 9 sono espressi

differentemente nella cellula apicale e in quella basale, dopo la divisione dello zigote.

(i geni homeobox sono geni che controllano lo sviluppo, agendo all’apice della

gerarchia nel processo di regolazione di morfogenesi e differenziamento)

Riassumendo, questo embrione in tarda fase a cuore mostra sia gli assi embrionali che

i tessuti: 28

Determinazione del polo apicale:

è importante per la formazione del meristema apicale (SAM) e dei cotiledoni (due

processi indipendenti ma correlati). Inoltre è importante anche per la formazione

dell’asse abassiale/adassiale.

WUS è un fattore di trascrizione coinvolto nella formazione del SAM. È un gene

homeobox che controlla le staminali, infatti è necessario per mantenerle

indifferenziate.

STM è anch’esso importante per la formazione del SAM.

La formazione dei cotiledoni dipende dall’auxina. Alla fine della fase globulare essa è

trasportata verso il cotiledone nascente da PIN1.

CUC1 e 2 sono geni la cui espressione è inversamente correlata alla via di

segnalazione dell’auxina. Sono geni responsabili del posizionamento dei cotiledoni e

della loro separazione. All’aumento della concentrazione di auxina i cotiledoni si

formano ma non vengono espressi CUC e STM.

Il dominio apicale deve formare il meristema apicale e i cotiledoni. Nella precoce fase

a cuore si vede la direzione dell’auxina (frecce) e la suddivisione dell’embrione in

cotiledoni (verde) e meristema (rosso): 29

Sezione trasversale di un embrione. In rosso il meristema, in

arancione le zone intercotiledonari, in verde scuro il dominio adassiale del cotiledone e

in verde chiaro quello abassiale. Il meristema e le zone intercotiledonari hanno bassi

livelli di auxina e alti di CUC, mentre è l’opposto nei primordi dei cotiledoni.

Questo accade al mutante cuc:

non si formano né il cotiledoni né il meristema perché l’auxina è

uniformemente distribuita.

Questo invece accade ai mutanti pin1 e pid (l’embrione non ha la PID chinasi

responsabile del posizionamento di PIN1 sull’apice della cellula):

la carenza di auxina nei primordi dei cotiledoni permette l’accumulo di

CUC nel dominio apicale, impedendo la crescita del cotiledone. 30

Determinazione del polo basale:

l’asse apicale-basale stabilisce anche la posizione del meristema radicale (RM),

correlato al differenziamento del QC.

Differenziamento dell’ipofisi: nei futuri endoderma e cortex, l’MP attiva TMO7, che

verso le cellule sovrastanti. Inoltre MP promuove il trasporto di auxina PIN1 dipendente

sempre verso le cellule sovrastanti, dove contribuisce insieme a TMO7 alla

specificazione dell’ipofisi.

Differenziamento del QC: richiede i fattori di trascrizione SCR e SHR. Nei mutanti scr e

shr l’asse radiale è compromesso e un caratteristico meristema radicale. WOX5 invece

regola l’attività del QC, ed è un membro della famiglia WUS. QC184 (anche 25 e 46) è

un reporter che ci permette di osservare l’attività del QC.

I geni PLT servono per preservare il QC e le staminali.

J: radice primaria di un wild type

K: radice primaria di un mutante plt1plt2. Quest’ultimo ha anche l’apparato radicale

molto meno sviluppato. Questi mutanti inoltre non accumulano amido sotto le cellule

che esprimono YFP e accumulano SHR-GFP con meno efficienza nei semi.

I geni PLT determinano la posizione delle cellule staminali durante l’embriogenesi.

Inoltre essi agiscono indipendentemente da SCR e SHR nel mantenimento delle

staminali, ma dipendono dall’auxina e da AuxRE.

Questi geni sono anche coinvolti nella specificazione della radice embrionale. Una

sovraespressione di PLT determina il fenotipo da radice distale ectopica.

La chiave dello sviluppo è quindi sempre l’auxina: 31

Allo stadio di ottante, l’espressione non uniforme di WOX2 e WOX8/9 marca il dominio

apicale-basale. WOX8/9 è regolato da WRKY2. Allo stadio di dermatogeno, il co-

repressore TPL inibisce l’espressione di PLT nella porzione basale.

Al contrario, l’espressione di HD-ZIP III (come PHB, REV, PHV, ATHB8) nella porzione

apicale è controllata dai membri della famiglia miR165/166.

PLT1,2,3 e 4 occupano il dominio complementare a quello di HD-ZIP III e sono espressi

nelle cellule basali nella prima fase globulare. Questi due gruppi di geni sono infatti

antagonisti: i primi determinano il polo basale e i secondi l’apicale.

- L’espressione precoce di PLT è causata da MP e ARF7 nel dominio basale;

- Cellule che esprimono PLT,SCR, SHR diventeranno QC;

- QC segnala alle cellule circostanti di rimanere indifferenziate. 32

Lezione 24

CITOCHININE

Il nome è dovuto al fatto che stimolano la divisione cellulare. Haberlandt scoprì che

cellule del parenchima della patata che non si dividevano, iniziavano a farlo in

contatto con la linfa floematica. Quindi il fattore responsabile della scissione era

solubile. Skoog osservò che tessuti interni del tabacco proliferavano solo se arricchiti

di latte di cocco o sperma di aringa (autoclavato). Proprio in quest’ultimo è stata

chinetina.

identificata la prima citochinina, chiamata callo

Nei tessuti vegetali in coltura, la citochinina è necessaria per la formazione del

(una massa di cellule indifferenziate simil-tumorale), insieme all’auxina. Se la

concentrazione di citochinina e auxina è bassa il callo cresce bene e forma radici, se è

alta cresce bene e forma germogli e meristemi. Le CK sono anche coinvolte nel

processo di senescenza fogliare, nodulazione e ritmi circadiani.

Chinetina:

Skoog e colleghi scoprirono nel 1950 che i derivati dell’adenina stimolavano la

divisione cellulare. Sospettarono che quest’effetto fosse riconducibile agli acidi

nucleici, e ciò sembrò avere conferma dagli esperimenti con gli spermi di aringa

autoclavati. Quindi isolarono il composto 6-furfuril amminopurina e lo chiamarono

chinetina, un composto però non naturale perché derivante dalla decomposizione del

DNA. Il deossiribosio dell’adenosina era convertito in furano, che si distacca dalla

posizione 9 e si attacca alla 6 dell’adenina.

Chinetina e IAA sono antagonisti e il rapporto delle loro concentrazioni è importante

per l’organogenesi: 33

Struttura molecolare delle citochinine:

Letham nel 1973 isolà la prima citochinina naturale da estratti di endospermi immaturi

e la chiamò zeatina. La sua catena laterale ha un doppio legame, quindi può essere

cis o trans (presente in entrambe le configurazioni nelle piante, ma la trans è

biologicamente più attiva).

Le altre due CK naturali sono la diidrozeatina e la isopenteniladenina. Differiscono

tutte per il gruppo sostituente in posizione N6. Esistono anche in forma coniugata con

zuccheri, in cui vengono trasportate o conservate, ma sono biologicamente attive in

forma libera.

Biosintesi e catabolismo:

la scoperta dei geni per la sintesi delle CK è dovuta all’induzione del tumore del

colletto da Agrobacterium tumefaciens. Esso penetra in una lesione sull’epidermide

della pianta, poi il suo plasmide Ti penetra la cellula vegetale e si inserisce nel suo

genoma. Queste cellule proliferano formando la massa tumorale. Questa può essere

curata dai batteri incubando il tessuto a 42 gradi centigradi, e poi può crescere

indefinitamente anche senza ormoni. Infatti il T-DNA contiene i geni per la sintesi di

auxina e CK. Il gene IPT codifica per l’enzima isopentenil transferasi (per la sntesi di

CK). Inoltre vi sono altri due geni che codificano per la biosintesi di auxine. Questi tre

geni sono definiti fito-oncogeni e oltre a portare alla produzione di auxina e ck,

producono anche opine (per la nutrizione dei batteri). 34

In Arabidopsis AtIPT2 e 9 codificano per l’enzima Trna-IPT che usa il trna come

substrato. In totale codifica 7 geni IPT.

Biosintesi della trans-zeatina.

I substrati preferenziali si IPT sono ATP, ADP, DMAPP (dimetilallil difosfato), che deriva

dalla biosintesi del MEP (metileritriolo fosfato, coinvolto nella biosintesi dei terpenoidi).

I precursori delle CK biologicamente attive sono IPDP e IPTP, che possono essere

idrossilati dal citocromo P450 trans idrossilasi (CYP735A). si ha produzione di TZDP o

TZTP, precursori di tZ. Quindi l’idrossilasi contribuisce all’abbondanza relativa di iP o

tZ. 35

Quelle coniugate, in particolare CK riboside 5’ monofosfato, sono convertite in forma

lonely guy

attiva per via enzimatica. L’enzima è stato scoperto nel mutante (log) del

ck riboside

riso con meristema apicale difettoso. Il gene LOG codifica per l’enzima

5’monofosfato-fosforibosio idrolasi che separa direttamente la due molecole.

La distribuzione spazio-temporale delle citochinine attive è regolata da enzimi

metabolici. Una sovraespressione ectopica di LOG causa fenotipi pleiotropici, come la

riduzione della dominanza apicale e il ritardo della senescenza fogliare.

Catabolismo:

Le CK sono degradate irreversibilmente per ossidazione o coniugate con zuccheri

ck

(reversibilmente). L’ossidasi CKX è capace di ossidare solo le ck libere. La

glucosiltransferasi ck beta glucosidasi

lega il glucosio in posizione 7 alle ck , mentre la

idrolizza il glucoside.

I geni CKX mostrano un pattern di espressione differenziale durante lo sviluppo della

pianta.

Trasporto:

- Floema: contiene soprattutto ck iP riboside e cZ riboside

- Xilema: contiene soprattutto tZ riboside, sintetizzato ad elevate concentrazioni

nella radice dall’enzima CYP735A. 36

Le CKs prodotte nella radice sono trasportate al fusto attraverso lo xilema.

Esse possono agire come segnali mobili:

i mutanti ipt1;3;5;7 presentano fusti molto stretti con scarse ramificazioni secondarie e

incapacità di sviluppo del cambio cribro vascolare. Il fenotipo si “corregge” innestando

il mutante con il fusto o la radice di piante wt. Quindi:

1. Le CKs sono trasportate a lunga distanza a partire sia dal fusto che dalla radice

agendo da segnali mobili.

2. Le CKs sono essenziali nel differenziamento del cambio.

Queste molecole hanno anche effetti paracrini. L’induzione localizzata nel nodo del

gene IPT prmuove la crescita di gemme laterali (soppressione della dominanza

apicale) solo a livello del nodo trattato.

Come viene trasportata la citochinina attraverso la membrana plasmatica?

- Le permeasi AtPUP1, 2 e 14 possono trasportare ck libere, come iP e tZ, in

simporto con protoni.

- I trasportatori ENT trasportano ck ribosidi come iPR e tZR. La famiglia ENT è

stata osservata anche in animali, funghi e batteri e facilita la diffusione dei

nucleosidi secondo gradiente.

1. CKs iP sono convertite in tZ nelle cellule della radice

2,3. Le CKs sono esportate nello xilema da ABCG14 verso il germoglio

4. La permeasi PUP14 trasporta citochinine attive dall’apoplasto

5. Di conseguenza la riserva di citochinine nell’apoplasto viene consumata e la

percezione di ck è soppressa. Viene quindi inibita la segnalazione cellulare di

citochinine.

Modello del trasporto delle CKs attraverso la membrana plasmatica: 37

l’assorbimento di nitrato da parte delle radici induce l’espressione di IPT3, gene della

biosintesi delle ck, che induce la traslocazione delle ck tZR attraverso lo xilema.

La ck trans idrolasi è coinvolta nella sintesi di tZR. Quest’ultima è traslocata verso

l’alto lungo lo xilema grazie al flusso causato dalla traspirazione.

Le iP nel floema invece viaggiano verso il basso o verso i tessuti.

Organizzazione del TCSS (sistema di trasduzione del segnale a due componenti) e

sistemi di fosforelay nei batteri:

Il TCSS comprende un recettore chinasi SK e un regolatore di risposta RR. Il dominio

input del SK riconosce uno specifico segnale esterno. Questo segnale attiva la chinasi

e si ha autofosforilazione del dominio output, ad un residuo istidinico. Questo

interagisce con il dominio ricevente di RR, causanto il trasferimento di un fosfato ad un

residuo di aspartato del dominio ricevente. Ciò attiva il dominio output di RR, il che

cambia la sua conformazione mediando diverse attività biologiche.

I sistemi di fosforelay batterici comprendono un SK e un RR. Hanno anche regolatori

intermedi che mancano di un dominio output e una proteina che trasferisce fosfati

usando un residuo istidinico.

Il sistema del recettore CK delle piante è simile ad un recettore batterico a due

componenti con sensore a istidina chinasi. Nelle piante però il sensore è ibrido perché

l’istidina chinasi H è fusa col dominio ricevente D (aspartato). Inoltre è presente

l’istidina fosfotransferasi HPt che trasferisce il fosfato al dominio ricevente D del RR. 38

Il sistema fosforelay di segnale a due componenti è diverso da una cascata proteina-

chinasi, in cui una successione di enzimi opera il trasferimento di un gruppo fosforico

dall’ATP sull’-OH di un aminoacido (serina o treonina o tirosina). Nel sistema fosforelay,

il trasferimento di un gruppo fosforico è operato dall’istidina fosfotransferasi in

sostituzione della chinasi. L’enzima HPt, trasferendo un gruppo fosforico al dominio

ricevente D del regolatore di risposta lo rende attivo.

L’autofosforilazione è un legame ad alta energia.

Il legame fosforico della fosfoistidina ha abbastanza energia da consentire

il trasferimento del gruppo fosforico senza il bisogno di energia aggiuntiva. 39

Il gruppo fosforico è trasferito dall’aspartato del dominio ricevitore fuso ad una istidina

dell’enzima HPt ed infine su di un aspartato del dominio ricevente del regolatore di

risposta. L’energia, trattenuta nel legame del fosfoaspartato, può consentire i

successivi trasferimenti del gruppo fosforico.

I componenti di questa via di percezione sono:

I recettori delle citochinine influenzano i processi regolati dalle citochinine in diversi

modi: 40

I semi mutanti presentavano una germinazione più rapida, una riduzione della

richiesta di luce e una diminuzione della sensibilità alla luce molto rossa, mostrando le

funzioni delle citochinine nel controllo della germinazione dei semi. I semi triplo-

mutanti erano grandi più del doppio dei semi selvatici. L'analisi genetica indicava un

controllo endospermico e / o materno ck-indipendente delle dimensioni dell'embrione.

La sensibilità alla luce rossa invariata dell'amplificazione dell'ipocotile mutante

suggerisce che la segnalazione della luce rossa da parte dei regolatori di risposta di

tipo A potrebbe non dipendere dalla citochinina. La perdita combinata di AHK2 e AHK3

ha portato ai cambiamenti più importanti durante lo sviluppo vegetativo. Le foglie di

mutanti ahk2 ahk3 formavano meno cellule, avevano ridotto il contenuto di clorofilla e

mancavano dell'inibizione dipendente dalla citochinina della perdita di clorofilla indotta

dal buio, indicando un ruolo prominente di AHK2 e, in particolare, AHK3 nel controllo

dello sviluppo delle foglie. I doppi mutanti ahk2 ahk3 hanno sviluppato un sistema

radicale fortemente potenziato attraverso una crescita più rapida della radice

primaria.

Funzioni parzialmente ridondanti dei recettori delle citochinine hanno ruoli di primo

piano per la combinazione del recettore AHK2 / AHK3 nel controllo quantitativo della

crescita degli organi nelle piante, con funzioni regolatorie opposte in radici e germogli.

Arabidopsis ha tre recettori di CKs: AHK2,3 e 4. Sono formati da chinasi ibride presenti

come componenti transmembrana (plasmatica e RE). Hanno tutti in comune un

dominio CHASE (ciclasi/istidina chinasi -associated sensig extracellular) extracellulare

che lega le Ck. Hanno però affinità diverse per i diversi tipi di CKs. AHK4 è stato

scoperto nel mutante wol (in cui si osserva radice troncata per i disturbi del

differenziamento del cilindro centrale) e nel mutante per la risposta alle CKs cre1 (non

produce fusti in vitro).

AHP funzione da shuttle tra citoplasma e nucleo:

In vivo i recettori AHK hanno attività ridondanti in parte. Se si determina la risposta

alle ck in base all’induzione di colore verde e l’inibizione della crescita della radice.

Entrambe le risposte sono abolite solo nel triplo mutante. I doppi mutanti presentano

danni più gravi dei singoli.

L’istidina fosfotransferasi AHP funziona da shuttle tra citoplasma e nucleo. In questo

modo il fosfato viene trasferito al dominion D di ARR.

Anche AHP presenta una certa ridondanza, infatti ci sono 5 geni che la codificano.

Doppi mutanti non causano alterazioni nella crescita. Nel triplo mutante si osserva

netto accorciamento della radice per cui è deficiente il meccanismo di signaling. 41

Inoltre AHP mantiene una distribuzione nucleare/citosolica indipendentemente dalla

segnalazione di citochinina.

Gli ARR sono codificati dai geni di tipo A (10), di tipo B (11) e di tipo C (2). Quelli del

tipo B sonoregolatori positivi, A e C negativi.

ARR1 è uno dei positivi. Oltre al dominio ricevente, gli ARRs di tipo B contengono

anche un dominio di legame al DNA e un dominio di attivazione. Se sovraespresso,

rende i tessuti più sensibili alle CKs. Si può misurare la quantità di CKs necessaria a

produrre tessuti verdi per valutare la sensibilità alle CKs stesse. I mutanti arr1 invece

sono meno sensibili.

Gli ARRs di tipo B sono parzialmente ridondanti.

Quelli di tipo A sono indotti dalle CKs come geni di risposta primari. Presentano solo i

dominio ricevente con aspartato (D). Sono regolatori negativi perché la loro

espressione interferisce con l’induzione della trascrizione indotta da CKs. Se

sovraespresso nel riso, ARR6 interferisce con la formazione del fusto mediata da CKs.

Quindi hanno un ruolo nella regolazione a feedback negativo della via di segnalazione

delle CKs. Ma come interferiscono con questa via?

Alcuni esperimenti hanno indicato che gli ARR di tipo A regolano negativamente il

signaling delle CKs interagendo, dopo che sono stati fosforilati, con altre proteine.

Gli ARRs di tipo C, sulla base della sequenza, formano un gruppo distinto. Infatti:

- Non sono indotti dalle CKs

- Non possiedono dominio legante il DNA

- Possiedono una forte attività His-fosfatasi.

Tra essi vi è ARR22, la cui sovraespresso e causa una forte aberrazione fenotipica.

Risulta simile al triplo mutante di AHK ed è fortemente resistente a CK. 42

Quindi riassumendo:

Lezione 25

ATTIVITA’ DELLA CITOCHININA DURANTE LO SVILUPPO DELLA PIANTA

Le CKs regolano:

- Divisioni cellulari dei meristemi apicali di fusto e radice. Promuovono il

mantenimento della capacità proliferativa delle cellule del meristema apicale

vegetativo (SAM) e di quello radicale (RAM). Piante transgeniche con elevato

catabolismo delle CKs hanno infatti una ridotta crescita del fusto, ciò avviene

per esempio in caso di sovraespresso e di geni CK-ossidasi. Queste stesse

piante mostrano anche un aumento della crescita radicale. Infatti nel primo

caso la popolazione staminale del fusto è mantenuta dalle CK, nel secondo

quindi nella radice è mantenuta dall’auxina.

Mutazioni nella percezione delle CK invece causano danni sia al fusto che alla

radice, forse per l’aberrante sviluppo dei tessuti conduttori: nel cilindro centrale

della radice il procambio genera il protoxilema e successivamente il

metaxilema, quindi il parenchima vascolare e infine il floema. Il

differenziamento è centripeto.

La sezione della radice del mutante sol (AHK4) mostra che il sistema induttore è

costituito solo da protoxilema e da poche cellule del periciclo. Quindi -> le CKs

prevengono il differenziamento delle cellule in protoxilema. La proteina AHP6

invece contrasta le vie di segnalazione delle CKs permettendo la formazione di

protoxilema, anche limitando l’espressione di ARR15 (tipo A). In risposta, le CKs

regolano negativamente la diffusione spaziale di AHP6. 43

- Specifiche componenti del ciclo cellulare

- Morfogenesi delle cellule in colture in vitro

- Dominanza apicale e crescita di gemme laterali. La stimolazione della crescita di

gemme laterali, con conseguente formazione di rami, è controllata da luce,

nutrienti e ormoni (auxina e CKs). L’auxina trasportata dalla gemma apicale

inibisce la crescita delle gemme ascellari, la citochinina applicata sulle gemme

laterali promuove la loro crescita.

Dominanza apicale: l’auxina prodotta nell’apice inibisce l’espressione dei geni

IPT (sintesi di CK) e aumento l’espressione di CKX (catabolismo CK). La

rimozione del SAM porta a riduzione dei livelli di auxina, incrementando quelli di

IPT e riducendo CKX. Si ha quindi aumento di CK che porta a formazione di

gemme laterali. In seguito queste produrranno IAA per controllare le gemme

sottostanti. Allo stesso tempo alte concentrazioni di CK riducono la crescita di

radici laterali. Il contrario avviene nei mutanti ipt.

- Ritardano la senescenza fogliare. Piante trattate con CK mostravano una

riduzione di clorofilla nel tempo molto ridotta rispetto alle altre, se sottoposte

all’assenza di luce. Il mutante ahk3 mostra un fenotipo con senescenza precoce.

Sovraespressione di ARR2 porta senescenza tardiva, così come quella di IPT,

che rende le piante più resistenti alla siccità. Questo perché le CKs aumentano

l’espressione di enzimi fotosintetici.

- Movimento dei nutrienti: le CKs stimolano il metabolismo dell’area fogliare

creando un nuovo “sink” verso cui vengono traslocati i nutrienti (vedi floema,

sink e source). Anche alti livelli di nitrato stimolano la produzione di CKs, il che

ha come conseguenza anche l’inibizione della crescita radicale. Se il nitrato

scarseggia, così sarà anche per le CK e quindi le radici potranno crescere e

assorbire più nutrienti.

- Produttività: importante anche nell’agricoltura, perché più CKs portano a

cambiamenti nella struttura dell’infiorescenza (nel riso viene prodotta più

granella).

- Formazione dei noduli simbiotici: mutazioni dei recettori delle CKs causano una

mancata formazione di noduli, mentre il mutante snf2 di Lotus japonicus li

forma anche in assenza di rizobi. Infatti il recettore invia segnali anche in

assenza di batteri.

- Ecc ecc

INTERAZIONE TRA AUXINA E CITOCHININE DURANTE L’EMBRIOGENESI 44

L’interazione promuove la divisione periclitare delle cellule per la formazione del

tessuto vascolare. Il gene LHW codifica per un attivatore trascrizionale che promuove

la produzione di cellule della stele (cilindro centrale), ed è importante per stabilire e

mantenere il normale numero di cellule vascolari e il pattern delle radici.

Nelle future cellule staminali l’auxina attiva l’espressione di MP (ARF5), che induce

quella di TMO5. Questo insieme a LHW promuove la segnalazione della citochinina

attivando l’espressione di LOG4 (biosintesi).

Nello stadio embrionale a 16 cellule, l’auxina è trasportata dalle cellule sospensori al

pro-embrione apicale e vi si accumula. Qui WUS è espresso nelle quattro cellule

interne.

I componenti della via di segnalazione delle CKs sono inizialmente rilevati nell’ipofisi,

la cellula fondatrice del meristema radicale nella fase globulare. Verso la fine di questa

fase, l’auxina cambia direzione e procede verso il sospensore, accumulandosi nella

cellula più apicale di quest’ultimo.

Dopo la divisione, la cellula figlia apicale dell’ipofisi mantiene l’attività di fosforelay

delle CKs e formerà il QC, mentre quella basale inibirà la segnalazione di CKs tramite

una via ARR7/15-dipendente.

INTERAZIONE TRA AUXINA E CITOCHININE POST-EMBRIONALE

Il trasporto di auxina mediato dalle PIN genera la formazione di radici laterali. Le CKs

hanno il ruolo opposto, inibendo l’espressione delle PIN. 45

L’auxina è trasportata radialmente quando la radice cresce seguendo la gravità. Se il

vettore gravità cambia, l’auxina si ridistribuisce asimmetricamente, concentrandosi

nella parte bassa.

Le CKs inibiscono l’allungamento delle radici, perciò la distribuzione asimmetrica di

auxina e CKs promuove l’allungamento della porzione alta della radice, il che la porta

a piegarsi verso il basso.

INTERAZIONE TRA AUXINA E CITOCHININE DURANTE LO SVILUPPO DEL MERISTEMA

APICALE

Nell’area di transizione della radice,la divisione si arresta e le cellule cominciano ad

allungarsi e differenziarsi.

Il meristema radicale raggiunge le dimensioni finali dopo 5 giorni dalla germinazione.

La velocità di divisione cellulare eguaglia quella con cui le cellule escono dalla zona di

divisione e entrano in quella di differenziamento.

- Trattamento con CKs riduce le dimensioni dei meristemi radicali;

- Carenza di CKs causano aumento delle dimensioni;

- Trattamento con auxina causa aumento delle dimensioni. 46


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DETTAGLI
Corso di laurea: corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
Università: Pisa - Unipi
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher LadyCla95 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Fisiologia vegetale e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Pisa - Unipi o del prof Di Mambro Riccardo.

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