Appunti di Citologia vegetale, anno I, semestre I

Appunti di citologia vegetale

Introduzione

Anno I

Semestre I

Corso di botanica

Fonti:

• Appunti e presentazioni dal corso di prof. Monica Ruffini Castiglione
• PubMed
• Nature
• Altri siti

Luca Fusar Bassini 2017/2018

Lezione 0

Le prime forme autotrofe operavano una fotosintesi/chemiosintesi anaerobia, simile a quella operata dai moderni solfobatteri; più tardi si originarono i primi procarioti aerobi e la fotosintesi aerobia (simili agli attuali cianobatteri, 3,5 miliardi di anni fa, con l’accumulazione di ossigeno nell’atmosfera, che passa con ciò a ossidante). Per quanto riguarda l’origine dei composti della vita, è dimostrato sperimentalmente che il calore e la vaporizzazione dell’acqua su opportuni substrati inducono la spontanea aggregazione di monomeri in polimeri.

Lezione I

Le cellule vegetali presentano alcune peculiarità, tra cui spicca la parete pectocellulosica. Il vacuolo è molto ampio soprattutto nelle cellule vegetali differenziate.

Il passaggio dalla cellula procariotica a quella eucariotica include una serie di step:

• RE e (forse) nucleo (sistema endomembranoso) si formarono per invaginazione del plasmalemma.
• Inglobamento di un procariote aerobio eterotrofo (protobatteri aerobi → mitocondrio) e di uno autotrofo (plastidi, tra cui cianobatteri → cloroplasti, non negli animali, successivo): endosimbiosi, dovuta a fagocitosi di un procariote che non viene digerito e stabilisce una simbiosi stabile dall’interno.

Ne deriva un protoeucariote, cioè un eucariote ancestrale, fotosintetico. Gli eventi di endosimbiosi vengono collocati circa 1 miliardo di anni fa. Ciò rese possibile la vita in presenza di ossigeno e lo sfruttamento dello stesso, a fine energetico, con la via aerobia. Le cellule in grado di acquisire cianobatteri senza digerirli poterono approdare all’autotrofia. I dati a favore dell’ipotesi includono le dimensioni di cloroplasti e mitocondri, la presenza al loro interno di DNA circolare e la replicazione per scissione binaria, anche se gli organelli non sono più autosufficienti.

Anche i flagelli si pensa derivino da endosimbiosi e successiva specializzazione.

Ipotesi endosimbiontica del nucleo: una protocellula con superficie rigida ed alta mobilità, basata su raptor guest (ospite rapace) penetra in una cellula più statica, con protezione non troppo rigida e sistema citoscheletrico basato su actina. La cellula raptor guest sarebbe divenuta poi il nucleo della nascente cellula eucariotica. L’evento precederebbe l’endosimbiosi da cui derivano plastidi e mitocondri.

Il passo successivo e cruciale per l’evoluzione della vita fu l’affermarsi della pluricellularità. Caposaldo delle scienze biologiche è la costituzione cellulare dei viventi. La cellula è l’unità fondamentale, un modulo autonomo ed indipendente dagli altri.

Schwann e Schleiden:

• Ogni essere vivente è costituito da cellule.
• La cellula è la più piccola unità di vita indipendente.
• I vegetali vengono compiutamente definiti non pluricellulari, bensì sovracellulari: le cellule non sono separate, ma formano strutture continue grazie ai plasmodesmi, che mettono in comunicazione citoplasma e sistema di endomembrane.

Il desmotubulo è un RE ornato da proteine che passa attraverso il plasmodesma. Quindi, il sistema di endomembrane nelle cellule vegetali è continuo fra cellule diverse, che formano perciò una sorta di sincizio. L’unità fondamentale può essere considerato il cell body, che include il nucleo, il suo involucro ed i microtubuli associati. Esso rappresenta le vestigia della protocellula ancestrale raptor guest, basata sulla tubulina, che si è specializzata per trascrizione, conservazione e compartimentazione (attraverso l’organizzazione dei microtubuli) del DNA. Il peripheral apparatus fa invece riferimento ai reticoli endoplasmatici, in assemblaggi sovracellulari, circondato da membrana; è basato sull’actina, deriva dalla cellula host, per protezione del cell body, controllo della forma, scambio actina-dipendente, comunicazione attraverso il plasmalemma.

Le cellule vegetali rappresentano un’alta espressione della complessità degli eucarioti. Il modello è funzionale per la vita immobile: le cellule e gli organismi vegetali non si muovono, sebbene qualche popolazione di cellule sia in grado di migrare. Le singole cellule non possono muoversi. Si sono sviluppate, con ciò, strutture altamente dinamiche, tra cui la parete (accrescimento acido). L’intero organismo ha una complessità inferiore rispetto ai metazoi e non presenta veri e propri sistemi, anche se il vegetale ha organi, seppur di pochi tipi. I vegetali hanno maggior capacità di adattamenti fisiologici, presentano una rilevante fantasia chimica necessaria per la vita di relazione, modalità di difesa sul posto, crescita mediante attività dei meristemi durante tutto il ciclo vitale. Ad esempio, al fine di crescere verso la luce, le piante possono formare per tutta la vita nuove radici, nuovi rami e nuove foglie: l’accrescimento è aperto, indeterminato. Nello sviluppo ontogenetico animale, la migrazione di cellule è cruciale, mentre nelle piante questo non avviene: dallo zigote si formano per mitosi dei settori differenziativi, coinvolti nella differenziazione degli organi. Mediamente, le cellule vegetali raggiungono maggiori dimensioni di quelle animali. Le cellule meristematiche sono più piccole (lato di un cubo ipotetico: 25 micrometri). Quelle epidermiche hanno lato di 70-100, le parenchimatiche 150; le cellule dei vasi xilematici raggiungono un diametro di 300. Le fibre sclerenchimatiche (da cui ricaviamo cotone, lino, canapa) arrivano a presentare una lunghezza di centimetri, e a differenziazione ultimata sono morte: l’apoptosi ha un ruolo di primo piano nello sviluppo, animale quanto vegetale.

Lezione II

L’apparato di Golgi (GA, Golgi Apparatus) è parte integrante del sistema di endomembrane, presenta variabilità dinamica ed ha un ruolo chiave nella via di secrezione e nella maturazione di proteine e lipidi (es. glicosilazione). Nelle piante, in particolare, il Golgi sintetizza i glicolipidi di membrana per plasmalemma e vacuolo (membrana: tonoplasto) e dirige sintesi ed assemblaggio dei polisaccaridi non cellulosici della matrice parietale. L’apparato di Golgi nelle piante è costituito da una serie di complessi funzionali, i dittiosomi, formati da pile o cisterne (5-10 sovrapposte), appiattite al centro e più dilatate ai margini, distribuite in tutto il citoplasma. Il Golgi è associato a molte vescicole e presenta una polarità (cis-trans). Le porzioni membranose cis guardano verso il RE. Seguono le cisterne mediali, poi le trans. Il dittiosoma è infatti collegato strettamente con il RE. Il TGN (Trans Golgi Network) include le cisterne più lontane dal RE e le numerose vescicole associate, derivanti da vari sistemi endomembranosi. Esso interagisce con l’actina, la quale contribuisce a stabilizzazione e movimento dello streaming citoplasmatico. Questo è ben diverso rispetto alle cellule animali, in cui il Golgi è in relazione con la tubulina. Molte proteine portano marcatori specifici ed esclusivi delle cisterne cis, mediali e trans, poiché la glicosilazione avviene a step: la suddivisione è dettata dal fatto che i passaggi avvengono in cisterne ben definite ed in un ordine preciso. Le cellule vegetali muovono grandi quantità di citoplasma, inclusi gli organelli, e devono amplificare lo streaming citoplasmatico, nelle zone dove esso ha luogo, considerando che nelle cellule differenziate il vacuolo di riserva occupa buona parte del volume cellulare. Questo spiega la distribuzione del GA in dittiosomi. La distribuzione dei dittiosomi su tutto il citoplasma riduce le distanze percorse dalle vescicole ed abbrevia i tempi. La via anterograda va dal RE al Golgi, quella retrograda al contrario. Il Golgi accoglie vescicole endocitotiche e provenienti dagli organuli. Durante la mitosi, negli animali il Golgi si frammenta in vescicole e la secrezione s’arresta. I nuovi GA si originano dai gruppi di vescicole smistati nelle due cellule figlie. Nelle cellule vegetali, invece, il Golgi rimane attivo ed è implicato nella formazione del setto di separazione (Golgi belt) e nella produzione dei composti non cellulosici della parete. Nelle cellule vegetali, il traffico di proteine e lipidi e la sintesi di polisaccaridi parietali continuano, soprattutto durante la formazione della nuova parete. La duplicazione del Golgi ha luogo in G2, per fissione delle cisterne.

Lezione III

Il trasporto vescicolare va da un compartimento donatore verso uno bersaglio o accettore. Il riconoscimento vescicola-target è mediato da interazioni specifiche v-SNARE/t-SNARE. Due modelli sono stati proposti per il trasporto delle vescicole contenenti proteine nel Golgi. Il modello di trasporto vescicolare prevede la via anterograda (cis-mediale-trans) e la retrograda (trans-mediale-cis). Il modello di maturazione delle cisterne prevede per la via anterograda, invece, uno shift fra cisterne: le vescicole del RE costituiscono nel loro insieme il Golgi cis, in maniera continuata, facendo spostare le cis a mediali e le mediali a trans, mentre le trans si spezzettano in vescicole. Le vescicole sono ricoperte da proteine diverse a seconda del comparto bersaglio. Le vescicole dal trans al RE sono rivestite da COP-I. Le vescicole ornamentate di clatrina sono dirette al vacuolo litico. In vicinanza del comparto bersaglio viene perso il coating e le SNARE proteins e altre, tra cui le Rab, guidano riconoscimento e fusione. Una vescicola si stacca dal comparto donatore grazie alla dinamina, che avvolge parzialmente la membrana e stacca la vescicola, scindendo il GTP in GDP e Pi. Si forma una vescicola membranosa con recettori transmembrana legati al cargo specifico. La membrana è rivestita da un mantello proteico, grazie all’azione dell’adaptina sulle porzioni interne dei recettori. Al bersaglio, la vescicola perde il coating (disassemblaggio), e proteine prima nascoste vengono esposte e guidano l’interazione con il target (SNARE, Rab, …).

Lo smistamento delle proteine ai vacuoli. Le proteine contengono segnali importanti, che le caratterizzano. Negli animali, il segnale per il lisosoma è interno alla sequenza ed è un residuo di mannosio-6-fosfato (glicosidico). Nelle piante, invece, il segnale è costituito dal propeptide, sequenza aminoacidica tipica. Se è interna o al C-terminale dirige al vacuolo di riserva proteica, se è all’N-terminale dirige invece verso i vacuoli litici. Il segnale per il vacuolo, anche se all’N-terminale, è preceduto dal segnale per il RE, in genere condiviso da moltissime proteine. Le vescicole destinate al vacuolo litico sono rivestite di clatrina e raggiungono un compartimento provacuolare, prima di giungere al vacuolo litico. Le vescicole dense si staccano dal Golgi e contengono proteine per il vacuolo di riserva; non hanno coating specifico. Possono fondersi con altre vescicole, tipo quelle del RE, che contengono perciò proteine non glicosilate (se passi nel Golgi, non ci scappi dalla glicosilazione), per poi dirigersi al vacuolo di riserva proteica. Vacuoli di fusione si formano per unione di uno litico ed uno di riserva.

L’esocitosi. La via di default delle proteine è RE → TGN → plasmalemma. Non sono noti alcuno specifico propeptide e alcun coating tipici per questa via. L’esocitosi nei vegetali è molto importante:

• Crescita apicale e del tubetto pollinico (esocitosi direzionale: le vescicole golgiane si accumulano all’apice, prima di fondersi con la membrana. Grazie alla fusione aumenta la membrana e viene rilasciato materiale parietale per la crescita polare).
• Formazione di nuova parete durante la citodieresi.
• Accumulo in regioni specializzate di sostanze per la vita di relazione: mucillagini (crescita porzione radicale e penetrazione nel terreno), nettari, polisaccaridi, proteine.
• Ricambio di componenti della membrana plasmatica.

L’endocitosi permette il riciclo all’indietro dei componenti di membrana, il mantenimento delle dimensioni cellulari, l’internalizzazione dei segnali della comunicazione e di componenti di parete, per esempio dei composti prodotti dalla degradazione della parete per via d’un attacco patogeno.

Il citoscheletro è un insieme di proteine fibrose, le quali, interagendo in maniera peculiare, forniscono un’impalcatura tridimensionale che funge da scheletro della cellula: il citosol è ben organizzato. Il citoscheletro fornisce un’organizzazione spaziale agli organelli e contribuisce al loro movimento nel citosol; è fondamentale per gestire il traffico vescicolare, ha un ruolo cruciale nella meiosi e nella mitosi, come nella citochinesi, nella deposizione della parete, nel mantenimento della forma cellulare, nel differenziamento e nella morfogenesi. Le classi principali di proteine fibrose sono tre: microtubuli (diametro 25 nm), microfilamenti (5-9 nm), filamenti intermedi (10 nm).

I filamenti intermedi sono strutture poco dinamiche, più stabili e durature degli altri filamenti citoscheletrici, caratterizzate da elevata resistenza meccanica contro lo stiramento. Hanno un ruolo strutturale di resistenza alla trazione e stabilità meccanica. Nelle cellule animali, sono costituiti da una classe eterogenea di proteine (cheratine, vimentina, desmina, lamina), ma spesso caratterizzate da un epitopo comune riconosciuto da un monoclonale ANTI-IFA. Esistono analoghi nei vegetali? Mediante esperimenti immunochimici (simile a western blotting), prodotti anticorpi in grado di riconoscere alcuni epitopi dei filamenti intermedi, come cheratine e lamina, si è visto che nelle cellule vegetali questi anticorpi legano qualcosa. Nota: in genere si attaccano più anticorpi secondari ad un anticorpo primario, cosicché il segnale (es. fluorescenza) è fortemente amplificato, tanto che a volte per migliorare l’amplificazione si usano anche tre serie di anticorpi una dopo l’altra. Usando nelle cellule vegetali anticorpi ANTI-IFA o anti-desmina, un segnale positivo si rileva in zone associate ai microtubuli o in zone fibrillari paracristalline nel citoplasma. Con anticorpi anti-lamina, si evidenzia materiale positivo a ridosso dell’involucro nucleare.

I microfilamenti sono costituiti da actina. Sono corti e flessibili e sono strutture polari, formate da monomeri di G-actina, che polimerizzano a dare un filamento di F-actina. La G-actina pesa 45kDa, esiste sotto forma di diversi isotipi, differenzialmente espressi durante lo sviluppo. Al polo – vengono persi monomeri, al + aggiunti: la struttura actinica è altamente dinamica. Il fenomeno del mulinello, noto come trademmilling dei microfilamenti, osservato grazie a G-actina radio-marcata, consiste nel fatto che i monomeri aggiunti ad un’estremità fluiscono lungo il polimero e vengono rilasciati all’altra estremità. Il processo consuma energia ed avviene in maniera massiccia in una cellula standard. La F-actina può nucleare spontaneamente a partire dai monomeri di G-actina, ma spesso la nucleazione è innescata da molecole della classe delle formine, catalizzatrici di processi altrimenti estremamente rari. Le formine sono una grande famiglia di proteine dimeriche. Ogni subunità presenta un sito di legame per il monomero di actina, che viene catturato ed aiutato a nucleare. Man mano che i filamenti nucleati crescono, il dimero di formina rimane associato all’estremità + in rapida crescita, continuando a legare nuove subunità che allunghino il filamento. Altre actin-binding proteins intervengono nella formazione di ramificazioni, nell’impacchettamento, nella frammentazione. I microfilamenti sono sempre in equilibrio. Actina-ATP lega la F-actina e Actina-ADP vi è legata.

Le miosine sono actin-binding proteins motorie. Dirigono il movimento dal – al + per il trasporto intracellulare ATP-dipendente (meccanismi actino-miosinici, anche negli animali). Le miosine vegetali della classe XI somigliano a quelle della classe V di mammiferi e lieviti. In Arabidopsis, se ne conoscono almeno 13 membri. Ogni miosina sposta cargo specifici, come vescicole ed organelli. A livello del plasmalemma, altre miosine di classe XIII interagiscono con l’actina per regolare la dimensione dei plasmodesmi.

La F-actina coordina il movimento citoplasmatico, dirige i materiali di crescita nelle zone esocitotiche. Nelle piante, il traffico vescicolare è prettamente actino-dipendente. I cloroplasti si possono spostare e vengono disposti ed orientati al fine di catturare al meglio l’energia luminosa. Nelle cellule epidermiche, attorno agli stomi, le vescicole sono in stretta relazione con i filamenti actinici. Le cellule del tubetto pollinico usano filamenti di actina per dirigere la secrezione verso la direzione di crescita. Le cellule dei peli radicali presentano un comportamento simile. I peli radicali maturi hanno filamenti di actina e actina corticale, quelli in crescita ne hanno grandi quantità in punta.

Lezione IV

I microtubuli si sono evoluti dalle FtsZ proteins (Filamentous temperature-sensitive) procariotiche. Sono α-β-strutture cave ad impalcatura bastoncellare, formati da α e β tubulina, che formano un dimero di tubulina; i dimeri si associano in protofilamenti. Tredici protofilamenti formano un microtubulo; i dimeri β-α-tubulina, sono sfalsati di 0,9 nm in un’elica sinistrorsa. L’estremità – termina con l’estremità + con tubulina; rispetto a quelli animali, i microtubuli vegetali portano epitopi diversi, hanno diversa sensibilità ai farmaci, maggiore instabilità dinamica, diverse modalità di nucleazione. Sono i principali determinanti della forma della cellula vegetale, orientano l’accrescimento per distensione, sono implicati nel differenziamento, consentono la segregazione di cromosomi e cromatidi durante meiosi e mitosi (il fuso mitotico è formato essenzialmente da microtubuli).