Appunti di Citologia, anno I semestre

Appunti di citologia

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Appunti e presentazioni dal corso di prof. Michela Ori
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Luca Fusar Bassini
2017/2018

Ricerca: premio Nobel in fisiologia e medicina del 2017

Il premio Nobel in Fisiologia e Medicina del 2017 va a Jeffrey C. Hall, Michael Rosbash e Michael W. Young per le loro scoperte circa i meccanismi molecolari che controllano i ritmi circadiani. Hall e Rosbash isolarono per primi il gene period e scoprirono che la proteina da esso codificata, PER, si accumula durante la notte e viene degradata nel corso del giorno, cosicché il livello cellulare di tale proteina oscilla in un ciclo di 24 ore. Gli studi sono stati condotti sull’organismo modello per eccellenza, Drosophila melanogaster.

Quando il gene period è attivo, viene prodotto il suo mRNA, che, trasportato nel citoplasma, dirige la sintesi della proteina PER. Essa si accumula nel nucleo ed inibisce la propria sintesi, mediante un circuito a feedback negativo. Il punto è, come entra PER nel nucleo? Young scoprì il gene timeless, codificante una seconda proteina necessaria per il corretto funzionamento dei ritmi circadiani, TIM. Egli mostrò sperimentalmente che TIM lega PER e le due proteine entrano nel nucleo.

La trascrizione di period e timeless inizia attorno a mezzogiorno, grazie a specifici fattori di trascrizione; le proteine PER e TIM si accumulano durante la sera e vengono traslocate durante la notte nel nucleo, dove sopprimono i geni per i loro fattori di trascrizione, e con essi la loro stessa sintesi; la degradazione di TIM la mattina presto promuove la fosforilazione e la degradazione di PER. Di conseguenza, la trascrizione dei fattori di trascrizione viene riattivata e PER torna ad essere sintetizzata.

Young, in collaborazione con altri ricercatori, mise in evidenza che le componenti molecolari di un orologio biologico sono anche altre. La proteina Importin che ha un ruolo in molti pathway di importazione nel nucleo, può importare TIM, che funge perciò da adattatore per il trasporto di PER nel nucleo. Anche Nup53, proteina con ruolo nei pori nucleari, è cruciale, così come DBT, codificata dal gene doubletime, la quale ritarda l’accumulo della proteina PER. Modelli molecolari mostrano che TIM presenta domini caratteristici delle cariosferine, proteine implicate nell’importazione di altre proteine nel nucleo, e ciò conferma il suo ruolo di trasportatore per PER.

Il ruolo dei geni sopra citati è stato scoperto grazie all’osservazione di individui con mutazioni nei geni codificanti per le componenti essenziali, i quali mostrano comportamenti non ritmici. Per esempio, individui mancanti della corretta Importin presentano un accumulo di PER e TIM nel citoplasma a qualunque ora, segno che le due proteine non vengono affatto importate nel nucleo e quindi sottoposte ai meccanismi regolatori a feedback.

Tutti gli organismi multicellulari utilizzano meccanismi simili a quello descritto. L’orologio biologico è determinante nella regolazione di molti geni, consentendo adattamenti fisiologici specifici in base alla fase del giorno. Ad esempio, nell’uomo lo stato di allerta migliore si ha attorno alle 9, quello di migliore coordinazione verso le 14. Nei vertebrati, l’orologio circadiano risiede nel nucleo soprachiasmatico, all’interno dell’ipotalamo. Le cellule del nucleo soprachiasmatico sincronizzano il corpo e modulano caratteristiche fisiologiche come la temperatura corporea.

Lezione I: La membrana plasmatica

• Discontinua: le proteine integrali interrompono il doppio strato lipidico.
• Fluida: la membrana si comporta come un fluido, i lipidi possono diffondere lateralmente; la fluidità dipende dalla composizione in lipidi. A Tab il colesterolo diminuisce la fluidità. Anche le proteine integrali possono muoversi all’interno del doppio strato fosfolipidico.
• Asimmetrica: alcuni lipidi e molti polipeptidi sono distribuiti asimmetricamente tra le due facce della membrana ed, in particolare, gli zuccheri presenti sulle proteine sono sempre rivolti verso l’esterno. Ad esempio, nei GR gli sfingolipidi sono più abbondanti sulla faccia esterna, mentre il lipid raftsfosfatidilinositolo su quella interna. Le sono regioni della membrana in cui vi è abbondante colesterolo. Ciò ostacola il movimento laterale delle proteine. Le zattere lipidiche aiutano la cellula a riunire le proteine di membrana in siti particolari.

Tra le proteine di membrana: pompe, canali, recettori, aggancio al collagene della ECM, enzimi, giunzioni cellulari. Ad esempio, i recettori possono legare i mitogeni, o fattori di crescita, che stimolano la divisione mitotica. L’interfaccia di comunicazione con l’ambiente esterno sono le proteine di membrana.

La membrana plasmatica è selettivamente permeabile. Per diffusione semplice possono attraversarla gas, piccole molecole idrofobiche e piccole molecole non cariche (es. etanolo, urea). Non passano, invece, aminoacidi carichi, H⁺, Na⁺, HCO₃^-, K⁺, Ca²⁺, Cl^-, Mg²⁺. Essi devono passare attraverso i canali proteici o i trasportatori. Aminoacidi polari, nucleotidi, glucosio non passano liberamente. L’osmosi fa riferimento al movimento delle molecole di acqua. Essa può entrare nella cellula sia per diffusione semplice che per diffusione facilitata attraverso le acquaporine. L’acqua è il solvente delle reazioni metaboliche, regola il volume cellulare e la temperatura corporea, è responsabile del trasporto di nutrienti e della secrezione delle scorie metaboliche. Esistono diverse tipologie di acquaporine (AQP) nel corpo umano.

Negli occhi, nelle fibre cristalline regolano la concentrazione di acqua, così negli eritrociti, nel rene la concentrazione dell’urea, e se ne trovano anche nell’intestino e nei testicoli.

Nella diffusione facilitata, le molecole vengono trasportate secondo un gradiente di concentrazione da proteine di trasporto o da canali ad apertura regolabile, senza consumo di energia (l’entropia comunque aumenta in questo verso).

Nel cotrasporto (sim-, anti-), una molecola passa secondo gradiente e l’altra contro gradiente. Esempio di simporto è il riassorbimento di glucosio a livello renale (assorbiti Na⁺ secondo gradiente; grazie all’energia di gradiente vengono assorbite anche molecole di glucosio). Lo stesso avviene a livello del lume intestinale.

I canali e le acquaporine possono essere regolati dal voltaggio, da ligandi (dall’esterno/dall’interno), meccanicamente. L’interno della cellula è più negativo e la ddp è in genere -70 mV. K⁺ è più concentrato all’interno, mentre Na⁺ e Cl^- lo sono all’esterno. Questi gradienti di concentrazione forniscono l’energia potenziale per formare un potenziale di membrana. Nel caso più semplice, se la membrana è permeabile al potassio, questi ioni diffondono lungo il gradiente di concentrazione, lasciando cariche negative non bilanciate all’interno. Le cariche positive non compensate all’esterno e quelle negative all’interno si allineano fisicamente lungo la superficie della membrana e si attraggono attraverso il doppio strato lipidico: il potenziale è localizzato solo nell’immediata vicinanza della membrana. La differenza di cariche è data inoltre all’ineguale distribuzione di fosfolipidi di membrana che portano una carica negativa. All’interno della cellula, questa carica negativa viene schermata di meno dalle cariche positive rispetto all’esterno.

A livello della terminazione sinaptica, il NT stimola l’ingresso di Ca²⁺ attraverso i canali ligando-dipendenti da esso stimolati; solo dopo, il segnale è convertito in un potenziale d’azione gestito da Na⁺. Il trasporto attivo è termodinamicamente sfavorito, il sistema funziona grazie alla rottura di ATP. L’Na/K ATPasi serve a mantenere disequilibrio tra interno ed esterno. Mutazioni della pompa CFTR del cloro causano la fibrosi cistica. Nei pazienti malati, le vie dell’aria sono bloccate dall’accumulo di muco. La pompa presenta un poro per Cl^-, regolabile. Ha due domini di legame per nucleotidi, dove aggancia ATP, ed un dominio regolatorio all’interno, oltre a siti di legame per fosfato. Sul lato esterno presenta catene oligosaccaridiche.

Le pompe protoniche svolgono un ruolo fondamentale. Ad esempio, il pH è più basso all’interno dei lisosomi, cioè la [H⁺] è più elevata, grazie a tali pompe. Le idrolasi acide dei lisosomi funzionano a pH 5, quando quello della cellula è 7, tendenza evolutiva volta ad evitare i danni d’un eventuale rilascio di enzimi lisosomiali al di fuori dell’organello.

Lezione II: Endocitosi

L’endocitosi può avvenire per fagocitosi, pinocitosi od essere mediata da recettore. Quest’ultimo caso permette un riconoscimento selettivo ed è l’unico in cui si forma una fossetta rivestita (coating) attorno alla vescicola. La vescicola si forma per fusione di due pseudopodi. Le interazioni con il citoscheletro sono cruciali.

Il corpo residuo è costituito dal materiale di scarto prodotto dai lisosomi, che dev’essere smaltito o accumulato in condizioni sicure. L’efferocitosi consiste nella fagocitosi di cellule dello stesso organismo che non servono più. Ad esempio, vengono eliminate le cellule apoptotiche e quelle necrotiche. Le cellule da eliminare sono riconosciute grazie a segnali esposti in membrana, di tipo proteico: le cellule che non devono essere fagocitate segnalano DEM (Don’t Eat Me), che sono riconosciuti dai macrofagi; il cambiamento di proteine è un segnale d’allarme per i macrofagi, che fagocitano le cellule che non presentano DEM. Non solo i macrofagi e le cellule dendritiche, ma anche i fibroblasti e le cellule epiteliali possono eseguire tale processo, che garantisce che la cellula morente sia smantellata in sicurezza, e la sua membrana non perda ossidanti, caspasi, proteasi e quant’altro. L’efferocitosi innesca pathway di trasduzione, che stimolano una risposta anti-infiammatoria e pro-crescita. La cellula che ne ingerisce un’altra produce fattori di crescita, eg per l’endotelio vascolare. Un’efferocitosi non ben funzionante è implicata in varie malattie, molte delle quali autoimmuni o legate a risposte infiammatorie croniche.

Il ferro circola nel sangue legato alla transferrina; essa viene legata dai recettori di membrana, consentendo l’ingresso di ferro nella cellula. Legame transferrina-recettore, endocitosi mediata da recettore, grazie a interazioni che coinvolgono la clatrina ed il citoscheletro. Si forma un’invaginazione nella membrana e gemma una vescicola, che porta sulla faccia interna la transferrina legata al recettore. La vescicola neoformata si fonde ad un lisosoma. A pH acido, il ferro è rilasciato dalla transferrina; la vescicola con la transferrina ed il recettore torna alla membrana, si fonde con essa e la transferrina viene rilasciata.

La clatrina si assembla in forme a triskelion, dal nome di un motivo decorativo miceneo, costituiti ciascuno da tre catene pesanti e altrettante leggere. Essa può polimerizzare: richiamata sotto la membrana, vari triskelion si organizzano in anelli a cinque o sei lati. Costruendo diverse combinazioni di pentagoni e esagoni, si possono formare vescicole di diverse taglie. Le clathrin-coated vescicles spostano cargo selettivamente tra membrana plasmatica, trans-Golgi ed endosomi. Il reclutamento e l’assemblaggio dei triskelion è affidato a molecole adattatrici, tra cui l’adattina. Un recettore capta il suo ligando: questo evento richiama l’adattina sotto la membrana, che media il legame con la clatrina e la formazione della fossetta rivestita. La clatrina aiuta la vescicola a gemmare; nel citoplasma, la clatrina si stacca, la vescicola diventa nuda. Anche altre molecole giocano ruoli chiave, come la dinamina, che crea un anello che sgancia la vescicola dalla membrana. La vescicola nuda forma un endosoma, che può fondere con un lisosoma. La vescicola può riportare il recettore in membrana, quindi il recettore viene usato più volte, oppure può restare al lisosoma; in tal caso il recettore viene degradato ed in membrana ne vengono aggiunti di nuovi. È il caso dell’endocitosi mediata da recettore dell’EGF (endodermal growth factor). Le cellule che vanno in mitosi non formano vescicole rivestite e la clatrina svolge altri compiti: lega, con altre proteine, l’apparato del fuso e stabilizza le fibre del cinetocore, aiutando i movimenti dei cromosomi. La struttura trimerica della clatrina forma crosslink tra microtubuli del cinetocore.

La transcitosi. Dall’epitelio intestinale dei neonati vengono assorbite le IgA e le IgG presenti nel latte materno. Dal lume intestinale (pH acido), gli anticorpi legano recettori specifici e vengono integrati in vescicole. Queste gemmano e si dirigono al versante di membrana al polo opposto. Si fondono alla membrana e rilasciano l’anticorpo, dato che l’ambiente extracellulare ha pH neutro. A pH diverso cambia la ionizzazione dei gruppi funzionali e con ciò i legami intermolecolari e di conseguenza l’affinità. Possono originarsi diverse situazioni di attrazione e di repulsione elettrostatica. Le molecole che presentano tale comportamento sono dette pH-sensitive.

Lezione III: Esocitosi

L’esocitosi permette il rilascio di neurotrasmettitori, ormoni, segnali, materiali di scarto, componenti della ECM. I prodotti della proteinsintesi che si accumulano nel RE vengono impacchettati in vescicole rivestite dalla proteina COP-II, passano al Golgi, dove seguono la via cis-intermedio-trans-TGN e vengono glicosilati. Le vescicole provenienti dal TGN sono invece rivestite da COP-I e dirette al RE.

La via secretoria, mediante la quale la cellula rilascia il contenuto vescicolare per esocitosi, può essere regolata (le vescicole fondono in funzione di uno stimolo, eg NT), oppure costitutiva (le vescicole fondono direttamente con la membrana).

Le proteine SNARE sono una famiglia di proteine integrali di membrana e sono dei recettori di SNAP (Soluble NFS Attachment Proteins, NFS fa riferimento ad un’ATPasi sensibile a N-etilmaleimide). Tutte le SNARE contengono nel loro dominio citosolico un segmento di circa 70 aminoacidi disposti in eptadi ripetute, detto motivo SNARE. Si differenziano tra loro nella regione N-terminale, dove mostrano fold e gruppi funzionali tipici. Sono coinvolte nel trasporto vescicolare: le v-SNARE vengono incorporate nelle membrane delle vescicole di trasporto durante la gemmazione, le t-SNARE sono situate nella membrana del compartimento bersaglio. La membrana plasmatica del neurone contiene due t-SNARE, la sintaxina e la SNAP-25, mentre la membrana della vescicola sinaptica contiene una sola v-SNARE, la sinaptobrevina. Quando vescicola e membrana si avvicinano, le SNARE interagiscono tra loro formando filamenti proteici intrecciati, che tirano i due doppi strati lipidici fino alla fusione ed espellono le molecole di acqua ivi interposte. Le vescicole “sanno” dove andare grazie alle interazioni v-SNARE/t-SNARE. Un recettore di carico di una certa vescicola lega una v-SNARE, che aggancia, per riconoscimento specifico, la t-SNARE tipica del compartimento bersaglio: le vescicole si fondono solo con le membrane che presentano adeguate α-SNARE proteins. Esistono più di 20 coppie di SNARE. Le SNARE presentano una catena polipeptidica adelica, che si complessa con altre due catene della proteina periferica SNAP-25. I complessi di fusione derivanti avvicinano le membrane. Le quattro catene spiralizzano, forzando l’avvicinamento delle due membrane: affinché esse si fondano è necessario che non distino più di 1,5 nm. Una vescicola endocitotica può, ad esempio, presentare v-SNARE complementari alle t-SNARE lisosomiali. Ciò media la formazione del complesso d’attracco, che aiuta l’aggancio della vescicola all’endosoma precoce, grazie a legami proteici non covalenti. Le proteine SNARE vengono in seguito districate, con consumo di ATP.

Le Rab sono una famiglia, membro della superfamiglia delle Ras monomeric G proteins. Le Rab β-foglietti presentano, generalmente, un ripiegamento per GTPasi, che consiste in sei fiancheggiati da α-eliche. Cinque Le Rab regolano numerosi step del traffico fra membrane: la formazione di vescicole, il loro movimento sui network actinici e tubulinici, la fusione con la membrana bersaglio, agevolando l’uncoating. Le Rab sono proteine periferiche di membrana, simili a palloncini attaccati ad essa per mezzo di una corda: sono legate covalentemente al gruppo prenile con due cisteine nel C-terminale. Le Rab escort proteins (REPs) guidano le Rab neosintetizzate e prenilate legando il gruppo prenilico, che è insolubile, e portando le Rab nel citoplasma. Il gruppo prenile viene, in seguito, inserito in membrana, ancorando la Rab sulla faccia citoplasmatica della membrana (vescicola, plasmalemma,…). Come altre GTPasi, le Rab switchano tra due conformazioni: attiva, ovvero legata al GTP, ed inattiva, legata al GDP. Quella attiva si forma per fosforilazione di quella inattiva, grazie a fattori di scambio GDP/GTP. L’inattivazione è invece guidata da GTPase-activating proteins. Gli effettori di Rab, proteine che interagiscono con essa, legano soltanto la forma legata al GTP, ovvero attiva. Gli effettori sono molto eterogenei e Rab presenta varie isoforme proteiche, almeno settanta nell’uomo, cosicché le funzioni sono moltissime. Gli effettori proteici possono guidare gemmazione, selezione e coating delle vescicole, avere un ruolo nel trasporto, nell’uncoating e nella fusione. Dopo la fusione con la membrana e la dissociazione dell’effettore, dovuta alla defosforilazione, Rab viene riciclata da GDI (GDP dissociation inhibitor), che lega il gruppo prenile e previene lo scambio di GDP con GTP, che riattiverebbe Rab prima che essa fosse tornata alla membrana d’origine, a cui viene portata da queste GDI. L’overespressione di Rab è legata alla carcinogenesi, ad esempio gastrica. Mutazioni in Rab39b sembra...