Appunti di Citologia, anno I semestre

Il segnale KDEL specifica per il RE, e compare in proteine che ad esempio ritornano per la via retrograda

dal Golgi per esplicare la loro funzione nel RE.

I modelli del trasporto vescicolare e della maturazione delle cisterne sono difficili da verificare

empiricamente, al microscopio elettronico si vede una gran confusione di vescicole che ballano nella cellula

e le proteine marcate si vede che passano nel cis e sbucano fuori dal trans, ma non sappiamo di più.

Nel Golgi, gli enzimi per la glicosilazione sono compartimentalizzati. Cis: Mannosidasi I, mediale: GlucNac

transferasi, Mannosidasi II, trans: Galattosiltransferasi, Sialiltransferasi. Nel complesso, vengono aggiunte

catene più complesse di zuccheri. La glicosilazione nel Golgi ha luogo su aminoacidi specifici, come Asp,

Ser, Thr, Hyp. Inizia nel RE con zuccheri semplici e prosegue nel Golgi con ramificazioni ed aggiunta di

zuccheri complessi.

Dal trans-Golgi, gli enzimi idrolitici lisosomiali si dirigono al lisosoma, dove divengono attivi. Un

precursore di enzima lisosomiale passa nel RE e poi nel cis Golgi, ove è fosforilato con mannosio-6-

fosfato (M6P), riconoscimento univoco per i recettori del Golgi che gemmano vescicole dirette al lisosoma.

Qui, a pH 5, il fosfato si stacca e l'enzima lisosomiale viene attivato per proteolisi.

Lezione IX

I lisosomi sono organelli piccoli, vescicolari, ovoidali, solo animali. Posseggono almeno sessanta enzimi

idrolitici diversi (idrolasi: proteasi, glicosilasi, nucleasi, fosfolipasi, fosfatasi, lipasi, solfatasi, …). L'ambiente

acido a cui sono attivi gli enzimi (pH=5) è mantenuto grazie a pompe H ed è frutto della tendenza evolutiva

volta alla riduzione del rischio connesso allo sversamento di enzimi nel citosol. I lisosomi scindono

molecole per fornire nuovi costituenti per la cellula, smaltire patogeni, cellule morte, senescenti, ed

organelli obsoleti. Proteine di membrana possono importare sostanze particolari per trasporto attivo, via

alternativa a quella endosomica. Al di sotto del bilayer lipidico è presente una superficie luminale

glicosilata, di glicoprpteine, volta a proteggere la membrana dall'azione digestiva delle fosfolipasi (forma di

glicocalice). I lisosomi si formano per fusione di una vescicola golgiana con un endosoma tardivo.

Il lisosomatropismo fa riferimento all’accumulo di basi deboli con proprietà lipofiliche all’interno del

lisosoma. La membrana è permeabile a specie neutre di basi deboli, ma le specie protonate non passano e si

accumulano internamente.

I lisosomi portano in membrana proteine del macchinario di smistamento, come Rabs e SNAREs. Hanno

funzioni diversificate: eterofagia (dopo fagocitosi o endocitosi), autofagia, autolisi, digestione extracellulare.

Mutazioni a carico dei geni per gli enzimi lisosomiali causano gravi patologie, dette di accumulo

lisosomiale: alcuni substrati non sono degradati e s'accumulano nel lisosoma. Conseguono problemi

connessi a neurodegenerazione, cancro e malattie cardiovascolari. L’accumulo primario di un substrato

specifico può ostacolare il normale trafficking lisosomiale, determinando accumuli diversi. Si scatenano

disastri, come perdita dell’omeostasi del calcio, anormalità nei pathway di segnalazione, permeabilizzazione

della membrana, disaccoppiamento dell’autofagia, con difetti di legame lisosoma-autofagosoma, causando

accumulo terziario del materiale autofagosomico.

Gli enzimi dei lisosomi sono prodotti dai ribosomi sul RE, passano al Golgi, ricevono M6P e vanno al

lisosoma. La classe più rappresentata da enzimi idrolitici sono le catepsine, proteasi presenti in tutti gli

organismi. Hanno un ruolo vitale nei mammiferi nel riassorbimento osseo. Molte sono proteasi a cisteina,

serina od aspartile. La catepsina A, ad esempio, ha ruoli svariati: regola la stabilità delle proteine

(degradazione/aggregazione), è implicata nel metabolismo dei glicosfingolipidi, nella proteolisi,

nell’autofagia chaperone-mediata, nel trasporto intracellulare, nella regolazione positiva di altri enzimi,

nell’esocitosi regolata di granuli secretori contenenti mediatori preformati come proteasi, lipasi e

infiammatori.

I lisosomi sono organelli altamente adattabili. Il macchinario LYNUS (Lysosomial Nutrient Sensing) include

numerosi complessi proteici che interagiscono sulla superficie del lisosoma ed ha ruolo di percepire il

contenuto nutritivo dell’organello e comunicarlo al nucleo. All’interno del LYNUS si trova la vATPasi

(vacuolare), ampio canale multimerico, che dall’idrolisi dell’ATP ricava l’energia per l’importo attivo di H+

nel lisosoma. Molti canali e trasportatori si trovano in membrana. LAMP2A media l’autofagia chaperone-

mediata, legando substrati proteici citosolici alla membrana lisosomiale per favorirne l’importazione.

NPC11 media l’esporto di glucosio dal lisosoma. LAAT-1 (Lysosomal AminoAcid Transporter) sposta lisina

ed arginina dentro e fuori, giocando un ruolo cruciale nell’omeostasi degli aminoacidi. Enzimi sulla

membrana lisosomiale includono HEPARAN-alpha, che partecipa alla degradazione per step dell’eparan

solfato, la cui mutazione causa la mucopolisaccaridosi IIIC.

I lisosomi possono secernere materiale fondendosi al plasmalemma (esocitosi lisosomiale, ad esempio

negli osteoclasti e nei melanociti per la secrezione di sostanze extracellulari). Essa è evidente dalla

traslocazione di proteine marker della membrana lisosomiale nel plasmalemma. È stato verificato che molti

geni per proteine lisosomiali sono coespressi in molti tessuti e condizioni diverse. Noti geni lisosomiali

presentano nel promotore un sito specifico di dieci basi, legato dal fattore di trascrizione TFEB. Il network

genico è noto come CLEAR (Coordinated Lysosomial Expression And Regulation).

I perossisomi sono organuli molto piccoli, hanno un core cristallino carico di enzimi e svolgono la beta

ossidazione degli acidi grassi. Posseggono catalasi, enzimi che catalizzano 2 H2O2-> 2 H2O + O2. Il

perossido di idrogeno è infatti prodotto costantemente dalle reazioni catalitiche del lisosoma e viene

smaltito direttamente in loco. I perossisomi derivano direttamente dal RE e poi acquistano le funzioni di

ossidazione e perossidazione. Raccolgono i perossidi tossici, fra cui H2O2, formati eg RH2 + O2 -> R +

H2O2. I perossidi vanno smaltiti poiché potrebbero contribuire alla formazione di radicali liberi. Le catalasi

possono usare come donatori di elettroni molte sostanze nocive, come etanolo e metanolo, svolgendo così

una funzione di detossificazione. I perossisomi regolano sintesi e degradazione dei composti azotati, come

gli aminoacidi e la degradazione di sostanze insolite, come D-aminoacidi.

I radicali liberi si formano in conseguenza a inquinamento, fumo, UV, radiazioni, infiammazione,

metabolismo. Possono causare danni a DNA, membrane e macchine proteiche. La formazione di tali specie

altamente reattive può essere prevenuta. Antociani, polifenoli, vitamina C, carotenoidi, alcuni minerali ed

altro bloccano la reazione a catena innescata dai radicali liberi, cedendo un elettrone senza diventare essi

stessi radicali liberi.

Lezione X

I mitocondri producono l’energia necessaria per tutte le funzioni cellulari. In una cellula sono presenti in

numero variabile ed hanno forme diverse, così come localizzazione variabile. Ogni cellula ha 1000/2000

mitocondri e cellule come miociti e neuroni con un grande fabbisogno energetico possono averne anche

3000. I mitocondri si riproducono per scissione binaria. In alcuni tipi, le creste possono avere aspetto

tubulare o essere disposte parallelamente all’asse maggiore (neuroni e miociti). Le creste possono essere

semplici, ramificate o disposte a formare reti. Le creste forniscono una superficie ampia per la sintesi di

ATP. La membrana esterna ha composizione simile a quella del RE, quella interna a quella dei batteri:

contiene la cardiolipina, un particolare fosfolipide a quattro code di acidi grassi, tipicamente batterico. La

membrana interna porta una serie di specifici trasportatori per regolare ingresso ed uscita delle molecole ed

i complessi proteici per la fosforilazione ossidativa. Il NADH cede elettroni alla NADH deidrogenasi,

seguono ubichinone, coenzima Q, citocromo b-c1 (11 proteine che ricevono elettroni dal coenzima Q ridotto

e li cedono al citocromo C), citocromo C (fa da navetta e sposta un elettrone per volta). La citocromo

ossidasi trasferisce, infine, gli elettroni all’ossigeno. Sulla membrana esterna, il mitocondrio porta una

proteina scambiatrice ATP/ADP. I geni dell’mtDNA codificano per 7 polipeptidi per la NADH

deidrogenasi, 1 polipeptide per citocromo C reduttasi, 3 per citocromo C ossidasi, 2 per ATP sintasi, 2

rRNA ribosomiali, 22 per tRNA mitocondriali. mtDNA non ha introni né nucleasomi, ma è associato a

proteine ed ancorato a ripiegamenti membranosi. Il codice genetico è leggermente diverso da quello

nucleare ed i cromosomi si replicano in maniera indipendente. mtDNA codifica anche per proteine per il

repair, la DNA polimerasi gamma, un’elicasi di riparazione TWINKLE che può unire filamenti di DNA

singoli. Malattie mitocondriali possono colpire quasi tutti i sistemi, con danni più gravi per quelli con

elevato fabbisogno energetico (i.e. muscoli e neuroni). Le mutazioni possono interessare il DNA nucleare o

quello mitocondriale. I mitocondri sono trasmessi per via matrilineare. Nuovi approcci sono stati sviluppati

per ostacolare la trasmissione delle patologie mitocondriali per madri consapevoli d’essere portatrici di

mutazioni nei geni dell’mtDNA (eg, mitocondri abnormi): ad esempio, da un uovo di una femmina donor s

scarta il DNA genomico e si tengono i mitocondri, aggiungendo poi il genoma nucleare di un uovo della

madre e fecondandolo in vitro con uno spermatozoo paterno. La tecnica è approvata per la clinica in GB.

L’origine endosimbionte del mitocondrio preuppone l’ingolfamento di un alfa proteobattere in un eucariote

ancestrale. Successivamente, forma e funzione dell’endosimbionte sono cambiate radicalmente. La gran

parte del DNA è stata trasferita al genoma nucleare; rimane un piccolo genoma circolare di 16kb in un

numero eccessivo di copie. Il genoma mitocondriale umano contiene le regioni per 13 proteine, costituenti

essenziali per la catena respiratoria della membrana interna, regolati in loco (v. CORR Theory). Il potenziale

elettrochimico di H+ creato dalla catena è sfruttato anche per funzioni diverse, come isolare lo ione Ca2+,

implicato nella trasduzione del segnale, nella membrana interna, e per importare sostanze grazie a

macchine di trasporto poste in membrana. Un minor potenziale elettrochimico è un utile read-out per lo

stato funzionale del mitocondrio, che crea segnali per attivare pathway che riparano od eliminano i

mitocondri difettosi. I mitocondri hanno composizione proteica plastica, con oltre 1000 proteine diverse,

composizione variabile tra specie e tessuti, mix di old-bacterial e new-eukaryotic