Appunti di Botanica Generale 2

Ereditarietà e espressione dei geni

I cromosomi eucariotici sono composti da acido desossiribonucleico e da proteine in quantità circa uguali. Dopo un’iniziale indecisione, fu attribuito al DNA il ruolo di conservare le informazioni genetiche.

La struttura del DNA

James Watson e Francis Crick, uno scienziato americano ed un fisico, si incontrarono all’Università di Cambridge e iniziarono insieme lo studio del DNA, per comprenderne soprattutto la struttura. All’inizio dei loro studi, molte informazioni erano già note: la molecola di DNA è grande, lunga, sottile, composta da 4 diversi nucleotidi che si differenziano per una base azotata: adenina, timina, citosina e guanina. Ogni nucleotide ha poi uno zucchero pentoso (deossiribosio) e un gruppo fosfato. Adenina e guanina sono basi purine, citosina e timina sono pirimidine.

Linus Pauling aveva dimostrato che le proteine, per mezzo di legami idrogeno, formavano una struttura ad elica, ipotizzando che quella del DNA fosse simile. Dagli studi con raggi X di Rosalind Franklin e Maurice Wilkins venne dimostrata la struttura a doppia elica della molecola di DNA. Altro dato importante, ottenuto da Erwin Chargaff, indica il rapporto adenina/timina e citosina/guanina, pari a 1:1.

Con questi dati, Watson e Crick giunsero a sostenere che il DNA non era un unico filamento ma una doppia elica intrecciata. Come una scala a pioli intrecciata. I bordi della scala sono composti da zucchero (deossiribosio) e gruppo fosfato, che si alternano. I pioli della scala sono invece le coppie di basi azotate, adenina con timina; citosina con guanina. Le basi sono legate da legami a idrogeno, relativamente deboli. Costruendo vari modelli, Watson e Crick giunsero alla conclusione che l’adenina poteva legarsi solamente con la timina (con 2 legami a idrogeno); la citosina poteva legarsi solo con la guanina (3 legami a idrogeno).

Un gruppo fosfato si lega a due molecole di deossiribosio, ad una legandosi al carbonio 5, all’altra, legandosi al carbonio 3 (dei due anelli di deossiribosio). Possiamo quindi individuare su entrambi i filamenti l’estremità 5’ e l’estremità 3’. I due filamenti hanno direzioni opposte, uno in direzione 5’-3’ e l’altro in direzione 3’-5’, infatti si dicono antiparalleli. La scoperta più importante per Watson e Crick fu la complementarità delle basi. Conoscendo quindi la sequenza di basi di un filamento, è possibile ricavare la sequenza corrispondente sull’altro filamento, che viene definito “complementare” al primo. Questa complementarità anticipa le scoperte fatte sulla replicazione del DNA.

Replicazione del DNA

Proprietà fondamentale del DNA è quella di potersi replicare in copie identiche. Con la replicazione del DNA, il doppio filamento si apre come una cerniera, per mezzo della rottura dei legami a idrogeno che tengono insieme le basi complementari. Quando i due filamenti si separano, diventano stampi per sintetizzare altri filamenti complementari. Se sullo stampo è presente, ad esempio, la sequenza ACCTG, il nuovo filamento, in corrispondenza di quella sequenza, avrà la sequenza complementare TGGAC.

La replicazione del DNA avviene una sola volta durante il ciclo cellulare, nella fase S. La duplicazione dei cromosomi consiste nella replicazione di tutto il materiale genetico della cellula, e precede la mitosi o la meiosi nelle cellule che danno origine a meiospore o gameti. Nella replicazione ogni filamento di DNA viene utilizzato come stampo per formare un nuovo filamento, seguendo la complementarità delle basi. Concetto molto semplice ma che richiede un certo numero di enzimi e avviene in un processo che nel suo insieme è abbastanza complesso.

La replicazione del DNA comincia a livello di specifiche sequenze chiamate origini della replicazione. I primi enzimi coinvolti sono le elicasi, capaci di rompere i legami a idrogeno della doppia elica in corrispondenza dell’origine della replicazione. Gli enzimi deputati alla sintesi del nuovo filamento sono le DNA polimerasi. La replicazione del DNA richiede un innesco, chiamato RNA primer, che viene poi rimosso e rimpiazzato con nucleotidi di DNA. Nei procarioti l’origine di replicazione è una. Negli eucarioti sono invece numerose in ogni cromosoma.

Se osservassimo al microscopio il DNA in fase di replicazione, vedremmo le bolle di replicazione (che sembrano assumere la forma di un occhio), dovute alla separazione dei due filamenti. Fra i due filamenti separati inizierà a sintetizzarsi il nuovo filamento, e la struttura del DNA sembra assumere una forma ad Y che chiamiamo forcella di replicazione. Le due forcelle di replicazione si dirigono in entrambe le direzioni e la replicazione viene infatti detta “bidirezionale”.

La DNA polimerasi è in realtà capace di sintetizzare filamenti integri, chiamati filamenti guida, solo quando la replicazione avviene sul filamento 5’-3’. L’altro filamento, che ha orientamento 3’-5’, considerando la natura antiparallela e bidirezionale del DNA, viene sintetizzato in frammenti, chiamati “di Okazaki”, proprio perché la DNA polimerasi è capace di sintetizzare solo in direzione 5’-3’. I frammenti di Okazaki sono le componenti del nuovo filamento, che viene chiamato “lento”. Questi frammenti vengono poi uniti dall’enzima DNA ligasi.

Dal DNA alla proteina

Cercando una risposta al modo in cui la sequenza di DNA codifica per proteine, si è giunti alla scoperta dell’RNA, acido ribonucleico, una molecola affine al DNA ma con delle differenze. L’RNA è un filamento unico, lo zucchero è il ribosio, e la timina viene rimpiazzata dall’uracile, che si appaia solamente con l’adenina. L’RNA è contenuto in grandi quantità nelle cellule che stanno sintetizzando proteine, in particolar modo nel nucleo e nel citoplasma, dove avviene la sintesi proteica. Sono 3 i tipi di RNA che svolgono il ruolo di intermedi nella sintesi proteica:

• RNA messaggero o mRNA: il DNA diventa lo stampo per la sintesi di questo filamento di mRNA in una delle due fasi della sintesi proteica, la trascrizione. L’enzima che sintetizza questo filamento è l’RNA polimerasi. L’mRNA trasporta l’informazione genetica (grazie alla complementarità) ai ribosomi per sintetizzare le proteine.
• RNA ribosomale (rRNA): è componente strutturale, insieme ad altre proteine, dei ribosomi.
• RNA transfer (tRNA): il ruolo di queste molecole a forma di trifoglio è quello di sintetizzare le proteine nei ribosomi, perché ogni tRNA possiede uno specifico aminoacido che corrisponderà ad una specifica tripletta di nucleotidi (anticodone) nel tRNA, complementare ad un'altra tripletta di nucleotidi (codone) nell’mRNA. Le molecole di tRNA legano nella corretta sequenza gli aminoacidi nel ribosoma, formando quindi la proteina, ovviamente sulla base della disposizione delle triplette nell’mRNA, e quindi in base all’informazione genetica.

I tre processi del trasferimento di informazioni genetiche sono: la replicazione (di un nuovo filamento di DNA), la trascrizione dell’informazione genetica in un filamento di mRNA e infine la traduzione dell’informazione genetica in proteine per mezzo del tRNA, a partire dalla sequenza contenuta nell’mRNA.

Il codice genetico

La traduzione del DNA in proteine avviene grazie al codice genetico. Le proteine contengono 20 aminoacidi diversi, ma il DNA e l’RNA contengono solo 4 nucleotidi diversi. Questi nucleotidi sono il codice genetico degli aminoacidi, ma in che modo?

Se ogni nucleotide codificasse per un aminoacido, sarebbero sintetizzabili sono 4 aminoacidi. Se due nucleotidi codificassero un aminoacido, potremmo avere massimo 16 combinazioni, non sufficienti a sintetizzare tutti e 20 gli aminoacidi. Quindi, tre nucleotidi in sequenza sintetizzano un aminoacido, per un totale di 64 possibili combinazioni, chiamate codoni. Un numero molto superiore rispetto agli aminoacidi degli esseri viventi. Marshall Nirenberg e Heinrich Matthaei, utilizzando il contenuto di cellule di Escherichia coli, aminoacidi marchiati con radioattivo ed RNA sintetici, scoprirono la prima parola del codice, UUU, che codifica per la fenilalanina.

Questo divenne un metodo per scoprire tutte le triplette e i loro corrispettivi aminoacidi. Di tutte e 64 le triplette (codoni), solo 61 codificano per aminoacidi, le altre 3 sono segnali di stop. Con 61 triplette che codificano per 20 aminoacidi, è evidente che più triplette codificano per lo stesso aminoacido. Questo è il motivo per cui il codice genetico viene detto degenerato o ridondante. (Spesso i codoni che codificano per lo stesso aminoacido si differiscono per il terzo nucleotide). Il codice genetico, oltre ad essere degenerato, è anche universale. Universale perché è quasi identico in tutti gli esseri viventi. I geni batterici possono infatti funzionare nelle cellule vegetali e viceversa; i batteri possono sintetizzare proteine vegetali a partire da quei geni sfruttando i propri meccanismi di sintesi.

La sintesi proteica

L’informazione genetica contenuta nel DNA viene trascritta nell’mRNA e tradotta in sequenze di aminoacidi che compongono un polipeptide nella sua sequenza lineare. (Struttura primaria). I principi della sintesi proteica sono simili in cellule procariotiche ed eucariotiche, tuttavia ci sono delle differenze che evidenziamo prendendo come esempio l’E. coli.

Sintesi RNA messaggero

Ogni molecola di mRNA viene trascritta a partire da uno dei due filamenti della doppia elica di DNA. La trascrizione viene catalizzata dall’RNA polimerasi. Le sequenze di DNA dove si lega l’RNA polimerasi vengono chiamate “promotori”, e determinano il punto di inizio della sintesi e quale sarà il filamento di DNA utilizzato come stampo. Quando l’RNA si attacca al promotore, la doppia elica si apre e inizia la trascrizione. Quando l’RNA polimerasi sintetizza una sequenza detta “terminatore”, la sintesi dell’mRNA cessa.

RNA transfer e aminoacidi

Le molecole di tRNA sono piccole (80 ribonucleotidi), ha la forma di trifoglio e possiede due siti di attacco: l’anticodone, cioè la tripletta che si lega al codone complementare sul filamento di mRNA, e l’altro sito è all’estremità 3’, il sito di attacco del corrispettivo aminoacido. Il tRNA legato al suo aminoacido viene chiamato: aminoacil-tRNA. L’enzima che forma il legame fra la molecola di RNA transfer e l’aminoacido è noto come aminoacil-tRNA sintetasi, e ne esistono 20 differenti, una o più per ogni aminoacido.

RNA e proteine per formare i ribosomi

L’RNA ribosomale è componente dei ribosomi che costituiscono le due subunità, maggiore e minore, del ribosoma. La subunità minore contiene il sito di legame all’mRNA. La subunità maggiore possiede 3 siti ai quali può legarsi il tRNA: un sito A (aminoacilico), dove si lega l’RNA transfer di arrivo che porta l’aminoacido; un sito P (peptidilico), dove risiede l’RNA transfer che porta la nuova catena polipeptidica e infine il sito E (exit o uscita), dove l’RNA transfer si allontana dal ribosoma dopo il rilascio dell’aminoacido.

L'RNA messaggero viene tradotto in proteina

La sintesi della proteina viene detta “traduzione”, perché avviene la conversione di un’informazione da un linguaggio (sequenza nucleotidica) ad un altro (sequenza di aminoacidi). La sintesi proteica consuma molta energia, superiore a quella di altri processi biosintetici. Gli stadi principali della traduzione sono: l’inizio, l’allungamento e la terminazione.

• Fase di inizio: la subunità minore attacca un filamento di RNA messaggero all’estremità 5’, esponendo la prima tripletta, il codone di inizio. Poi, l’anticodone del primo RNA transfer si appaia al codone di inizio dell’mRNA in modo antiparallelo: solitamente il codone di inizio è 5’-AUG-3’ e il corrispondente anticodone è 3’-UAC-5’. Nei procarioti, il tRNA iniziatore che si lega al codone di inizio AUG, trasporta una forma modificata della metionina, chiamata formil metionina, primo aminoacido della catena polipeptidica. Negli eucarioti, il primo tRNA trasporta una metionina semplice. La subunità maggiore si attacca a quella minore per spostare l’fMet-tRNA al sito P, rendendo quindi il sito A nuovamente disponibile per l’attacco di un altro aminoacil-tRNA. L’energia necessaria a questo passaggio è data dall’idrolisi di una molecola di GTP (guanosina trifosfato).
• Fase di allungamento: il secondo codone dell’mRNA viene posizionato frontalmente al sito A nuovamente libero della subunità maggiore del ribosoma. Un tRNA con anticodone complementare al secondo codone dell’mRNA si posiziona nel sito A con il suo aminoacido. Quando sono occupati entrambi i siti (A e P), l’enzima peptidil transferasi, componente della subunità maggiore del ribosoma, catalizza la formazione del legame peptidico fra i due aminoacidi, attaccando il primo aminoacido (fMet) al secondo. Il primo tRNA viene rilasciato attraverso il sito E, rientrando nel pool di tRNA citoplasmatici. Il ribosoma si sposta poi sul terzo codone dell’mRNA, spostando di conseguenza il secondo tRNA al sito P. Il sito A, nuovamente libero, permette al terzo tRNA di appaiare il suo anticodone al terzo codone dell’mRNA, aggiungendo così un nuovo aminoacido che si legherà agli altri due grazie al legame peptidico catalizzato dalla peptidil transferasi. Il processo continua in maniera ciclica, e la parte iniziale di RNA messaggero, libera dal ribosoma, può formare un nuovo complesso di inizio con un altro ribosoma. Un gruppo di ribosomi che traducono lo stesso filamento di mRNA sono detti poliribosomi o polisomi.
• Fase di terminazione: il processo ciclico sopra descritto continua fino alla terminazione. Cioè fino quando si incontrano sull’RNA messaggero i codoni di stop (UAG, UAA, UGA). Non esistono tRNA che riconoscono questi codoni, quindi ad essi non corrisponde un anticodone e uno specifico aminoacido. I fattori di rilascio, proteine citoplasmatiche, si legano ai codoni stop presenti nel sito A del ribosoma per determinare la completa liberazione del polipeptide nella sua struttura primaria. Viene rilasciato l’ultimo tRNA e le subunità del ribosoma si separano.

La formazione del legame peptidico è catalizzata dall’RNA ribosomale. Questo è probabilmente il residuo di antichi organismi, dove l’RNA era l’unica molecola capace di contenere l’informazione genetica e di catalizzare le reazioni biochimiche, funzioni oggi svolte dal DNA e dalle proteine dette enzimi. La funzione principale della formazione dei legami peptidici è ancora oggi svolta da una molecola di RNA.

Smistamento e localizzazione finale dei polipeptidi nella cellula

I polipeptidi codificati dall’informazione genetica contenuta nel DNA, dai geni nucleari delle cellule eucariotiche, vengono tutti sintetizzati nel citoplasma. Devono essere indirizzati verso il loro specifico compartimento attraverso il meccanismo di targeting e sorting dei polipeptidi (indirizzamento e smistamento delle proteine).

Un caso specifico riguarda i ribosomi coinvolti nella sintesi di proteine destinate al Reticolo Endoplasmatico, proteine che possono rimanere nel RE, oppure essere trasferite per mezzo di vescicole al Golgi e per mezzo di altre vescicole ad altre parti della cellula, come il vacuolo oppure il plasmalemma.

La regolazione dell’espressione genica negli eucarioti

Nelle diverse cellule esistenti, i geni contenuti nel DNA vengono espressi continuamente oppure in determinati eventi o condizioni fisiologiche, e solo alcuni geni vengono espressi in un certo tipo di cellula. Tutti i meccanismi che controllano l’espressione dei geni si chiamano “regolazione genica”.

La regolazione genica nei procarioti consiste nell’attivazione/disattivazione dei geni in risposta a cambiamenti ambientali per quanto riguarda la disponibilità di nutrienti. Negli eucarioti invece, gli organismi pluricellulari si originano da un'unica cellula diploide (con patrimonio genetico completo) che nella crescita si divide per mitosi e si differenzia nei molteplici tessuti che caratterizzano l’organismo sviluppato. Ogni tipo cellulare, nella sua differenziazione, sintetizza determinate proteine utili allo svolgimento della specifica funzione e che lo distinguono dagli altri tipi cellulari.

Nelle piante le cellule (come in particolare quelle del meristema oppure le cellule del mesofillo) possiedono lo stesso patrimonio genetico dello zigote da cui si è originata. Una cellula differenziata, come quella del mesofillo, è capace di de-differenziarsi, dividersi e rigenerare un intero organismo, questa cellula che chiamiamo staminale si definisce “totipotente”. Il differenziamento delle cellule è strettamente dipendente dall’attivazione/disattivazione di geni o gruppi di geni contenuti nel patrimonio genetico dell’organismo.

La condensazione della cromatina

Il grado di condensazione della cromatina, evidenziato con colorazione, svolge un ruolo importante nella regolazione genica negli eucarioti. La colorazione evidenzia due tipi di cromatina: eucromatina, sottoposta a condensazione e decondensazione durante il ciclo cellulare, appare debolmente colorata; eterocromatina, fortemente condensata durante tutto il ciclo cellulare, compresa l’interfase, e appare intensamente colorata.

La trascrizione avviene quando l’eucromatina è meno condensata (interfase) ed accessibile dall’RNA polimerasi e dalle altre molecole necessarie per la trascrizione. Nell’eterocromatina altamente condensata è assente, quasi del tutto, la trascrizione. Alcune regioni dell’eterocromatina sono uguali in tutte le cellule e mai espresse. Un esempio è il centromero del cromosoma, regione che svolge un ruolo prettamente strutturale per permettere la migrazione dei cromosomi e il loro ancoraggio ai cinetocori in mitosi e meiosi.