Appunti Biologia molecolare

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BIOLOGIA MOLECOLARE

DOGMA CENTRALE DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE:

dell’informazione

Il flusso nelle cellule (dogma centrale) afferma che la molecola che contiene

l’informazione per la strutturazione di un organismo completo è rappresentata dalla molecola di DNA.

Questa informazione viene trasferita ad un’altra molecola, l’RNA. Se si parla di RNA messaggero,

l’informazione contenuta esclusivamente nell’RNAm (unica molecola di RNA codificante) viene letta e

quindi tradotta per produrre proteine. Dunque, il flusso dell’informazione all’interno delle cellule è DNA

oggi conosciuti presenti all’interno del genoma, solo il 3-4%

-> RNAm -> PROTEINE. Di tutti geni ad

sono geni che codificano per proteine, mentre il resto dei geni produce RNA privi dell’informazione

per la produzione di proteine, ma con funzione di regolazione, quindi si tratta di RNA che regolano

vari processi. Le nostre cellule riescono a spostare l’informazione dal DNA all’RNAm e da quest’ultimo

alle proteine e non è possibile per noi procedere nella via opposta, ovvero non è possibile per nessun

organismo passare dalle proteine all’RNAm e passare dall’RNAm al DNA: noi

per noi non è possibile

non possiamo effettuare una trascrizione inversa. 2

La trascrizione inversa consiste nel passaggio da una molecola di RNA ad una molecola di DNA e noi

non siamo in grado di effettuare tale processo. Ci sono però dei virus, detti retrovirus, che possiedono

un genoma a RNA e riescono ad effettuare la trascrizione inversa, cioè a trasformare il loro genoma

a RNA in una molecola di DNA, compiendo un passaggio inverso rispetto alla trascrizione effettuata

nelle nostre cellule. I retrovirus possiedono un enzima, la trascrittasi inversa, che serve a trasformare

il loro genoma a RNA in una molecola di DNA. I retrovirus sono gli unici virus che riescono a compiere

la trascrizione inversa poiché possiedono il gene che codifica per la trascrittasi inversa. Tale

meccanismo risulta fondamentale per i retrovirus, perché quando questi infettano un organismo

ospite, solitamente con genoma a DNA, per infettarlo bene devono inserirsi nel genoma dell’ospite e

per farlo devono trasformare il loro genoma a RNA in una molecola di DNA e questo passaggio è

possibile grazie alla trascrittasi inversa, tramite la quale si compie il processo di trascrizione inversa.

La trascrittasi inversa retro trascrive la molecola di RNA del genoma del retrovirus in un filamento di

poi duplicato per formare un doppio filamento di DNA. L’informazione contenuta nel

DNA, che verrà

genoma d RNA del retrovirus è stata retro trascritta in una molecola di DNA, la quale si può ora inserire

nel genoma dell’ospite. 3

ACIDI NUCLEICI: DNA E RNA

Gli acidi nucleici sono rappresentati dal DNA e dall’RNA. Mattoncini costituenti degli acidi nucleici sono

i nucleotidi. Un nucleotide è costituito da tre componenti fondamentali: un gruppo fosfato, uno

zucchero pentoso e una base azotata. Il gruppo fosfato può essere presente fino a tre volte in un

nucleotide. Lo zucchero cambia a seconda dell’acido nucleico di cui si parla: nell’RNA lo zucchero è

il ribosio, nel DNA lo zucchero è il desossiribosio. La differenza tra ribosio e desossiribosio è situata a

livello nel carbonio in posizione due dello zucchero: nel ribosio troviamo un gruppo ossidrile (-OH)

legato al carbonio due dello zucchero, mentre nel desossiribosio troviamo un atomo di idrogeno legato

al carbonio due dello zucchero. Il desossiribosio rispetto al ribosio manca di un atomo di ossigeno e

da ciò prende il nome di desossiribosio. Le basi azotate possono essere suddivise in purine e

pirimidine. Le purine sono rappresentate dall’ adenina e guanina, mentre le pirimidine sono la citosina,

l’uracile e la timina. Adenina, guanina e citosina si trovano sia nel DNA che nell’RNA. La timina si trova

dall’uracile nell’RNA. La base azotata si lega tramite legame

nel DNA e viene sostituita glucosidico

al carbonio in posizione uno dello zucchero (sia che si tratti di un ribosio che di un desossiribosio). Il

gruppo fosfato si lega tramite legame fosfodiesterico al carbonio in posizione cinque dello zucchero

(sia ribosio che desossiribosio). Una volta legate le tre componenti, si viene a formare un nucleotide.

Possiamo trovare fino a tre gruppi fosfato legati al carbonio in posizione cinque dello zucchero, quindi

si parla di nucleotide monofosfato se è presente un gruppo fosfato, nucleotide bifosfato se sono

presenti due gruppi fosfato, nucleotide trifosfato se sono presenti tre gruppi fosfato. Si parla di

nucleotide quando le tre componenti principali sono legate insieme. In assenza del gruppo fosfato si

parla di nucleoside. 4

I nucleotidi, sia che si parli di DNA o RNA, si legano tra di loro tramite il legame fosfodiesterico, che si

forma tra il gruppo ossidrile in posizione tre di un nucleotide e il gruppo fosfato legato al carbonio in

posizione cinque del nucleotide che deve allungare la catena. Quindi, Il gruppo fosfato, legato al

carbonio cinque (5’) del nucleotide che deve allungare la catena, reagisce con il gruppo ossidrile in

posizione tre (3’) di un altro nucleotide, eliminando una molecola di acqua e portando così alla

avvenire in un’unica

formazione del legame fosfodiestereico. Questo legame è direzionale, ovvero può

rappresentata dalla direzione 5’P-3’OH. Ciò

direzione, che è vuol dire che, nella formazione di una

catena polinucleotidica, il primo nucleotide ha il gruppo fosfato libero, mentre l’ultimo nucleotide ha il

gruppo ossidrile in posizione tre dello zucchero libero. Non a caso il gruppo ossidrile legato alla

posizione tre dell’ultimo nucleotide è libero, poiché questo gruppo ossidrile deve essere pronto per

poter formare un altro legame fosfodiesterico con un altro nucleotide. 5

DNA: una molecola costituita dall’unione di nucleotidi, legati tra loro tramite legami fosfodiesterici.

Il DNA è

La molecola di DNA è costituita da due filamenti polinucleotidici complementari e antiparalleli.

Antiparalleli vuol dire che questi due filamenti si legano in maniera tale che l’estremità 5’P di un

filamento sia legata all’estremità 3’OH dell’altro filamento, stessa cosa per quanto riguarda l’altra

estremità: estremità 5’P di un filamento 3’OH dell’altro filamento. Questi due

è legata all’estremità

filamenti di DNA sono tenuti insieme da legami a idrogeno che si formano tra le basi azotate dei

nucleotidi. Si formano due legami a idrogeno tra l’adenina e la timina, mentre tra la guanina e la

citosina si formano tre legami a idrogeno. Questi due filamenti oltre che antiparalleli sono

complementari, poiché le quattro basi azotate non si legano a caso ma seguono la legge di

complementarietà tra le basi, secondo il modello per la struttura della molecola di DNA scoperto da

Watson e Crick. Secondo questa legge di complementarietà tra le basi azotate, esistono dei legami

fissi che sono i due legami a idrogeno che legano adenina e timina e i tre legami a idrogeno che legano

guanina e citosina. Questi due filamenti di DNA complementari e antiparalleli si spiralizzano a formare

una doppia elica destrorsa, cioè che si spiralizza in senso orario. Questa doppia elica destrorsa ha

una struttura particolare: le basi azotate, tenute unite dai legami a idrogeno, sono disposte verso

l’interno della molecola, mentre lo scheletro esterno della molecola di DNA è formato dalla ripetizione

di fosfato-zucchero-fosfato-zucchero-fosfato-zucchero. Il fatto che lo scheletro esterno del DNA sia

costituito da questa ripetizione di zucchero-fosfato dà la carica alla molecola di DNA. I gruppi fosfato

carichi negativamente si trovano disposti verso l’esterno ed è proprio la carica negativa di questi gruppi

fosfato esterni a conferire carica negativa alla molecola di DNA. A differenza delle proteine, la

molecola di DNA ha sempre una carica netta negativa, conferitale dalla presenza dei gruppi fosfato

dello scheletro esterno. 6

La doppia elica destrorsa del DNA contiene 10 basi ogni “passo dell’elica”: ogni volta che la molecola

di DNA si spiralizza, questa spirale che si forma contiene 10 basi. Un passo dell’elica è pari a 3,4 nm.

Fondamentale nella molecola di DNA è la distinzione tra un solco maggiore e un solco minore nella

struttura elicoidale destrorsa.

Affinché i due filamenti siano antiparalleli è necessario che i desossiribosi (gli zuccheri) siano disposti

in maniera opposta uno rispetto all’altro. Il fatto che i desossiribosi sui due filamenti siano disposti in

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maniera differente uno rispetto all’altro fa sì che si formino sulla struttura della molecola di DNA dei

solchi maggiori e solchi minori. Non a caso possiamo distinguere due tipologie di solchi sul DNA, dato

che solchi maggiori e minori hanno delle ripercussioni a livello funzionale. Infatti, quelle proteine che

devono interagire col DNA riescono a farlo soltanto legandosi al solco maggiore e non al solco minore.

Ad esempio, una proteina con una struttura secondaria ad alpha elica particolare riesce ad insinuarsi

e legarsi al solco maggiore del DNA. Ciò avviene perché il solco maggiore del DNA permette la

formazione di un numero maggiore di legami con quelle proteine che si devono legare al DNA rispetto

al numero di legami che si formerebbero a livello del solco minore. A livello del solco maggiore la

formazione di legami è maggiore rispetto a quelli che si formerebbero a livello del solco minore del

DNA, quindi, chiaramente vengono stabilizzati i legami tra le proteine che devono interagire col DNA

e il DNA stesso. 8

Nell’immagine di sopra sono indicate tutte e quattro le possibili configurazioni di basi nel solco

maggiore del DNA, ognuna delle quali espone uno schema diverso per la formazione dei legami a

idrogeno. Nei solchi maggiori si possono formare con le proteine che devono interagire col DNA una

quantità di legami maggiori rispetto alla quantità di legami che si potrebbero formare nei solchi minore.

In questo modo si stabilizza il legame tra le proteine e il DNA. Le proteine che devono interagire con

il DNA riconoscono le varie conformazioni presenti sul solco maggiore del DNA, quindi, riconoscono

determinate conformazioni di possibili legami che si formano a livello del solco maggior di DNA e vi si

legano. Ciò vuol dire che una determinata proteina, che deve interagire col DNA ed è affine al solco

maggiore formato da A e T, si legherà tramite interazioni deboli soltanto al solco maggiore formato da

A e T e non si legherà ai solchi maggiori formati da T e A; G e C; C e G. Le proteine si legano a

specifici solchi maggiori per i quali sono maggiormente affini: ad esempio la proteina A, che deve

formare legami con A e T, sarà affine e si legherà esclusivamente al solco maggiore formato da A e

T.

Le proteine che si legano al DNA riconoscono una delle quattro possibili configurazioni presenti nel

solco maggiore e si associano formando legami a idrogeno.

DIVERSE FORME DEL DNA:

Nelle cellule, attraverso una serie di studi a raggi x, sono state trovate tre differenti forme del DNA: la

forma A; la forma B; la forma Z. Quindi, il DNA non è presente soltanto nella classica forma descritta

da Watson e Crick, ovvero nella forma B, ma sono presenti altre forme. 9

Nell’ immagine centrale abbiamo la forma B, una molecola di DNA a doppio filamento destrorsa che

ha 10 paia di basi per giro ed è la forma maggiormente presente in condizioni fisiologiche. Poi troviamo

la forma A, anch’essa destrorsa ma più corta e panciuta, che ha 11 paia di basi per giro di elica e la

ritroviamo in soluzioni a bassa concentrazione di acqua. Infine, troviamo la forma Z che, rispetto alle

altre due forme, ha una doppia elica di DNA sinistrorsa, possiede una forma allungata con 12 paia di

basi per giro e ha una funzione regolativa. La forma “Z” sta per “zig-zag”, cioè il particolare andamento

di dalla molecola di DNA. Nelle cellule è stato dimostrato che forme di DNA B si possono alternare a

forme di DNA Z. Anche la struttura delle basi nel DNA Z, rispetto al DNA B, è differente. Infatti, se

consideriamo nella forma Z lo zucchero legato alla base azotata tramite legame glucosidico, la base

azotata rispetto allo zucchero può essere in due conformazioni: ANTI e SYN. ANTI vuol dire dalla

parte opposta, mentre SYN vuol dire dalla stessa parte. Quindi, quando la base azotata si trova legata

dalla parte opposta rispetto allo zucchero, allora il nucleoside (base azotata + zucchero) è in

conformazione ANTI. Quando, invece, la base azotata ruota a livello del legame glucosidico e si viene

a trovare dalla stessa parete dello zucchero, allora la conformazione del nucleoside è detta SYN. Le

purine (adenina e guanina) possono essere presenti in entrambe le conformazioni SYN e ANTI,

mentre le pirimidine (citosina e timina) possono essere presenti solo in conformazione ANTI e non

formano la conformazione SYN, poiché, quando avviene la rotazione della base azotata lungo il

legame glucosidico, si ha un ingombro sterico che blocca la formazione della conformazione SYN

nelle pirimidine. Nel DNA A e B tutte le basi sono nella conformazione ANTI, mentre nel DNA Z le

pirimidine dalla conformazione ANTI e le purine nella conformazione SYN. 10

Nel DNA si possono formare particolari legami a idrogeno tra le basi, ovvero delle interazioni non

canoniche (non sono quelle usate da Watson e Crick) dette interazioni di Hoogsteen. Queste

interazioni di Hoogsteen sono alla base di strutture di DNA ancora più particolari. Per formare tali

interazioni non canoniche, la base purinica compie una rotazione di 180 gradi attorno al legame

glicosidico.

Queste interazioni di Hoogsteen servono a formare delle strutture di DNA ancora più particolari: Tripla

elica (detto anche DNA H) e Quartetti di G. La tripla elica del DNA rappresenta una molecola di DNA

a triplo filamento e la incontreremo a livello dei telomeri, in cui il DNA si struttura in tre filamenti. Questo

terzo filamento prende contatto con le basi azotate del doppio filamento di DNA, formando dei legami

a idrogeno non canonici, ovvero le interazioni di Hoogsteen. Quindi, il DNA H/ tripla elica rappresenta

un’ulteriore forma di DNA in cui nella doppia elica si va ad intercalare un terzo filamento e questa

struttura a tripla elica la incontreremo nei telomeri, che sono le estremità dei cromosomi. Nei quartetti

di G la molecola di DNA si stabilizza a formare un quadruplex, cioè quattro filamenti di DNA uniti tra

di loro. Sono definiti quartetti di G perché si tratta di regioni di DNA ricche di guanine, o, per meglio

dire, ricche di guanosine (desossiribosio+guanina). Questo quartetto di DNA viene fissato e mantenuto

attraverso alla formazione di interazioni di Hoogsteen, che si formano tra i quartetti di guanosina.

Tripla elica 11

*Non vi è la necessita di sapere disegnare le formule, basta sapere i concetti detti dalla prof.

Quando si aprono i due filamenti del DNA e si rompono i legami idrogeno, si forma la bolla e a

monte e a valle di questa il DNA diventa più o meno spiralizzato.

Si parla di superavvolgimento positivo o negativo.

Se non ci fossero degli enzimi che tagliano i superavvolgimenti, si bloccherebbe l'apertura dei

filamenti e si bloccherebbe anche la duplicazione e la trascrizione.

Le topoisomerasi sono gli enzimi che rimuovono i superavvolgimenti che si formano nel DNA.

Possono essere di tipo I (tolgono superavvolgimenti semplici) o di tipo II (tolgono superavvolgimenti

più complessi). 12

DENATURAZIONE E RINATURAZIONE DEL DNA

Se si estrae DNA da delle cellule e si fa bollire, l'alta temperatura rompe i legami H e quindi il DNA si

denatura e i due filamenti si separano.

Il DNA passa da una conformazione di DNA nativa a una denaturata.

Se mettiamo la stessa provetta con il DNA a temperatura ambiente, dopo un po' il DNA si rinatura

cioè i filamenti si riuniscono in modo uguale a come era in precedenza.

Una proteina, al contrario del DNA, quando viene completamente denaturata non ritorna mai uguale

a quella di partenza.

Questa caratteristica di denaturarsi e rinaturarsi è tipica del DNA ed è alla base di una tecnica che è

la PCR (reazione di polimerizzazione a catena del DNA).

La PCR si basa anche sulla capacità del DNA di denaturarsi e rinaturarsi.

Come vediamo se il DNA è a singolo o a doppio filamento?

Con lo spettro di assorbimento del DNA. 13

Le proteine in soluzione acquosa senza coloranti e niente, assorbe a una lunghezza d'onda di 280

nm.

Gli acidi nucleici invece assorbono a 260 nm.

Per vedere se in una soluzione ho estratto il DNA, si legge se a 260 nm nello spettrofotometro c'è il

picco di assorbimento. Se c'è allora il DNA è presente.

A 260 nm assorbe sia il DNA denaturato che quello nativo, ma il DNA denaturato assorbe di più e si

ha un effetto ipercromico.

L' effetto ipercromico è dovuto al fatto che quando i due filamenti si separano vengono esposti

all'assorbimento da parte del fascio di luce a 260 nm delle basi azotate che prima erano nascoste

all'interno del doppio filamento.

RNA (acido ribonucleico)

Formato da uno zucchero (ribosio) ha un OH legato al C2, gruppo fosfato e basi azotate (invece

della timina c'è l'uracile).

Tra i nucleotidi c'è legame fosfodiesterico tra gruppo OH in posizione 3 dello zucchero e il gruppo

fosfato legato al carbonio 5 del nucleotide successivo che deve allungare la catena.

Direzione di allungamento è 5' P-3' OH.

L' RNA è a singolo filamento e in alcune zone si formano strutture secondarie dove il filamento di

RNA si dispone a doppio filamento sfruttando la complementarietà delle basi.

Possiamo trovare strutture a forcina oppure delle gemme o anse.

COMPLESSAMENTO DEL DNA

Il DNA deve essere complessato perché negli eucarioti è molto lungo (circa 2 m) e deve essere