Appunti Biologia molecolare

PCR.Esempio: Real-Time PCR con una sonda aspecifica Sybr Green

Durane la prima fase di denaturazione i due filamenti di DNA sono separati e i primer non sono ancora attaccati ai filamenti complementare di DNA, la sonda non si lega al DNA e quindi non è prodotta fluorescenza. 62 Durante la fase di annealing, fase in cui i primer si legano ai propri tratti complementari di DNA, inizia a formarsi un piccolo frammento di DNA a doppio filamento. In questa fase le molecole fluorescenti si intercalano tra i piccoli doppi filamenti formati tra il primer e la molecola di DNA. La parte di elongazione è la fase in cui interviene la Taq polimerasi e in cui si genera la maggiore quantità di fluorescenza perché, a partire dal primer, la Taq polimerasi inizia a sintetizzare il nuovo filamento di DNA; aumenterà quindi la regione di DNA a doppio filamento e più molecole fluorescenti si intercaleranno nella molecola. Questo porterà ad un aumento di fluorescenza.

checorrisponderà ad un aumento di prodotto. 63Esempio: Real-Time PCR con una sonda specifica

Queste sonde sono dei piccoli frammenti di DNA complementari al prodotto di PCR nella porzione interna. Non prendono il posto dei due primer che vengono utilizzati per amplificare la molecola di DNA perché questi sono complementari ad una regione interna del DNA. Le sonde specifiche sono particolari perché presentano due molecole differenti, una legata all'estremità 5' della sonda e una legata all'estremità 3'.

5' 3' '5' REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza

3' QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che nasconde la fluorescenza del reporter

Quando la sonda viene eccitata da un raggio specifico R può emettere fluorescenza solo se è lontana da Q. Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto.

di R, cioè non è misurabile la fluorescenza di R. La sonda specifica si lega nella porzione interna di un filamento di DNA e la Taq a partire dal primer, utilizzando come filamento stampo quello di DNA a cui è legata la sonda specifica, comincia ad allungare e a formare il filamento complementare fino a quando incontra la sonda specifica. Quando esonucleasica 5'-P – 3'-OH la incontra, la Taq attiva una attività e comincia a rompere i legami fosfodiesterici che tengono unita la sonda specifica; in questo modo il reporter si allontana dal quencer che non nasconde più la fluorescenza emessa dal reporter che è direttamente proporzionale alla produzione di amplificato. 64

Questo grafico è particolarmente importante ottenuto da una reazione di Real-Time PCR (molto importante, va saputo disegnare)

Linea soglia scelta dall'operatore) in maniera dan(R intersecare le curve fluorescence di tutti i campioni nella

Normalised è il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione è sopra il valore di soglia dell'amplificato.

Nel grafico di realtà in PCR, sull'asse delle ascisse è riportato il numero di cicli di PCR, mentre sull'asse delle ordinate viene riportata l'intensità di fluorescenza. Si può identificare una regione basale indicata da una retta che interseca l'asse delle y in un determinato punto di fluorescenza. Tutta la regione del grafico al di sotto di questo punto viene chiamata regione basale, dove si trova tutta la fluorescenza aspecifica, non dovuta alla presenza di un amplificato.

L'intensità

Al di sopra indica l'intensità di fluorescenza che si trova di fluorescenza dovuta alla formazione di un prodotto di amplificazione. Dalla regione basale parte una curva di amplificazione e arriva al plateau. L'operatore che sta facendo la reazione di Real-Time PCR, una volta finita la reazione, in maniera arbitraria sceglie una linea di soglia che quindi può variare da Real-Time a Real-Time, e che deve per intersecare la curva di amplificato durante la fase esponenziale. La treshold (linea di fluo dovuta ad una certa intensità di fluo) interseca la curva nella fase esponenziale in un determinato punto. Se si riporta il punto in cui la linea di soglia interseca la sull'asse delle ascisse si ottiene il valore del ciclo di amplificato all'intensità di fluorescenza uguale alla treshold. Il PCR che ha permesso di raggiungere all'amplificato ciclo di PCR che permesso di

raggiunge il valore della treshold si indica con Ct. Ct è il ciclo della reazione di amplificato; è un segnale di fluorescenza maggiore della regione basale e che interseca la curva nella fase esponenziale e la linea di soglia. Si può quindi fare un'analisi quantitativa, e possono essere compiuti due tipi di quantificazione: - Assoluta: i campioni sono quantificati in modo assoluto, si arriva a sapere la concentrazione dell'amplificato). A ogni curva di amplificazione viene corrisposto un valore di concentrazione propria e quindi a una molecola di RNA di partenza, attraverso una quantificazione assoluta, viene dato un valore di concentrazione. - Relativa: vi è soltanto la comparazione tra due o più curve di amplificazione; non si associa ad una curva e quindi ad una determinata molecola di RNA un'unità di misura, ma viene semplicemente confrontata con altre. Quando si raggiunge il valore della treshold si indica con Ct. Ct è il ciclo della reazione di amplificato; è un segnale di fluorescenza maggiore della regione basale e che interseca la curva nella fase esponenziale e la linea di soglia. Si può quindi fare un'analisi quantitativa, e possono essere compiuti due tipi di quantificazione: - Assoluta: i campioni sono quantificati in modo assoluto, si arriva a sapere la concentrazione dell'amplificato). A ogni curva di amplificazione viene corrisposto un valore di concentrazione propria e quindi a una molecola di RNA di partenza, attraverso una quantificazione assoluta, viene dato un valore di concentrazione. - Relativa: vi è soltanto la comparazione tra due o più curve di amplificazione; non si associa ad una curva e quindi ad una determinata molecola di RNA un'unità di misura, ma viene semplicemente confrontata con altre.

Quando si allestisce una Real-Time PCR, non ne viene allestita una sola, ma più reazioni contemporaneamente per molecole di RNA differenti. Questo perché la piastrina su cui viene compiuta la reazione di Real-Time PCR è costituita da 96 pozzetti, e quindi si tende ad allestire tante PCR insieme (con molecole di RNA differenti). L'operatore sceglie quindi di tracciare una linea soglia che deve intersecare tutte le linee di amplificazione ottenute. Da un grafico come questo si può immediatamente fare una quantificazione di tipo relativo; si può dire quale di queste curve, e quindi quale tipo di RNA, nella popolazione era presente ad una concentrazione maggiore rispetto ad un altro, senza dare però una misura assoluta. 66 RNA di partenza che sono l'RNA.

Grafico di amplificazione di due di tipo A e B. Ciascuno avrà la propria curva di amplificazione e quella di tipo B precede quella di tipo A. Scelta la threshold, si vanno sull'asse delle ascisse.

E si che l'amplificato a cercare i Ct nota B Interseca la treshold al Ct = 10, mentre l'amplificato A Interseca la treshold al Ct = 15. Questo vuol dire che l'amplificato di tipo B ha compiuto 10 cicli di PCR prima di arrivare ad una intensità di fluorescenza tale da intersecare la treshold, mentre l'amplificato di tipo A ha compiuto 15 cicli. L'RNA di tipo B quindi era più concentrato di quello di tipo A perché gli sono stati necessari meno cicli di PCR per raggiungere la treshold.

Con la quantificazione assoluta si può risalire alla concentrazione iniziale di RNA, ma per fare questo c'è bisogno di una curva standard, una curva di riferimento che posso utilizzare per dare una quantità di RNA al mio campione amplificato.

Questa viene ottenuta riportando sull'assequantificazione assolutadelle ordinate i Ct e sull'asse delle ascisse i microgrammi. Vengono utilizzate concentrazionicrescenti di RNA che vengono riportate sull'asse delle ascisse e con queste concentrazioni vienamplificando l'RNA. Dopo di che si riportano sull'assecompiuta una Real-Time delle ordinate i Ctche ci sono voluti per raggiungere la treshold; si otterrà quindi una linea retta discendete che 67estrapolo sull'asse delle ascisserappresenta la curva di taratura. Con il Ct della reazione effettuata,la quantità corrispondente in microgrammi; in questo modo posso dare un determinato valore diconcentrazione.

IL CODICE GENETICO E LA TRADUZIONE

Il meccanismo attraverso cui si passa da un linguaggio a nucleotidi presente sia nell'RNA che nelDNA al linguaggio ad amminoacidi presente nelle proteine è il codice genetico. Il codice genetico èda una serie di regole che permettono

d passare dal un linguaggio all'altro.composto è costituito da …, i quattroGli acidi nucleici sono costituiti da 4 nucleotidi, in particolare l'mRNAnucleotidi devono essere quindi letti per poter inserire nelle proteine tutti e 20 gli amminoacidi.seQuando viene letto l'mRNA, un nucleotide corrispondesse ad un solo amminoacido, verrebberorichiamati solamente 4 amminoacidi e 16 rimarrebbero fuori. Dunque, più di un nucleotide devecorrispondere ad un amminoacido. Se due nucleotidi corrispondessero a un amminoacidoverrebbero richiamati solamente 16 amminoacidi, e 4 rimarrebbero fuori. Se infine, 3 nucleotidicorrispondessero ad un amminoacido si avrebbe il richiamo di 64 combinazioni, un numerosufficiente a coprire i 20 amminoacidi. Il codice genetico è infatti costituito da triplette; una triplettacostituisce un amminoacido e viene anche chiamata codone.La combinazione a triplette porta quindi alla formazione di 64 codoni. 68sintesi di un

polipeptide e corrisponde all'amminoacido

Il codone AUG è il codone di inizio dimetionina che viene sempre posto all'inizio di una catena proteica. I codoni UAA UGA e UAG sono codoni di stop, che quando vengono letti dalla subunità minore del ribosoma durante la sintesi delle proteine interrompono la sintesi stessa. Molti amminoacidi sono codificati da più codoni.

Il codice genetico può essere definito attraverso tre aggettivi:

• universale: vale per tutti gli organismi viventi
• ridondante: perché un amminoacido può essere richiamato da più codoni
• non ambiguo: nonostante sia ridondante, non è ambiguo, perché un codone codifica solo e soltanto per un amminoacido.

Traduzione viene letto l'mRNA che porta l'informazione

Durante il processo di traduzione per la sintesi delle proteine, l'mRNA si forma attraverso la trascrizione ad opera della RNA polimerasi II che trascrive il filame