Biologia Molecolare Fiaschi

Biologia Molecolare

Indice degli argomenti trattati

Informazione genica

• Organizzazione del genoma

• Replicazione del DNA

• PCR

• Sequenziamento del DNA

• Riparazione dei danni al DNA

• La trascrizione

• La maturazione dell’mRNA

• Maturazione di rRNA e tRNA

• Real-time PCR

• La traduzione

• Mutazioni

• Controllo dell’espressione genica

• Chaperoni molecolari e proteasoma

• Lunghi RNA non codificanti

• Il destino delle proteine

• Il traffico vescicolare

• Il trasporto del glucosio

• La trasduzione del segnale

• Adesione cellulare

• Cellule tumorali

• Apoptosi, necrosi, autofagia

• I topi transgenici

•

CdL in Scienze Biologiche Anno Accademico 2019-2020

Informazione genica

Flusso dell’informazione genica

Il flusso dell’informazione nella cellula parte dal DNA, arriva all’RNA tramite la trascrizione e

• passa alle proteine, per mezzo della traduzione

→ →

DNA RNA proteine

trascrizione traduzione

L'informazione codificata nella sequenza delle basi del DNA viene trasferita nelle molecole di

• RNA; da esse passa poi nelle proteine

La produzione di mRNA è molto bassa, infatti solo il 3-4% dei geni codifica proteine, gli altri

• producono invece RNA con funzione di regolazione

L'informazione non può passare per la via inversa, ovvero da proteine a RNA e poi a DNA, difatti

• nell’uomo non si ha trascrizione inversa

I retrovirus hanno invece un genoma a RNA e possono compiere la trascrizione inversa grazie

• alla presenza dell'enzima trascrittasi inversa, questo enzima permette al retrovirus di trasformare

il proprio genoma in una molecola di DNA che può inserirsi nel genoma dell'ospite (si tratta

dell’unica modalità con cui tali virus possono trasferire il loro materiale genetico in altre cellule)

Nota Bene

L'informazione contenuta nelle proteine non viene mai trasferita negli acidi nucleici

•

Acidi nucleici

Il DNA (acido deossiribonucleico) e l’RNA (acido ribonucleico) sono polinucleotidi e sono

• costituiti dall'unione di monomeri chiamati nucleotidi

I costituenti di un nucleotide sono:

• Il gruppo fosfato, e ve ne possono essere uno (nucleotide monofosfato), due (nucleotide

• difosfato) o tre (nucleotide trifosfato)

Uno zucchero a cinque atomi di carbonio e, più precisamente, il ribosio per l’RNA e il

• Il DNA e l RNA sono polinucleotidi, formati cioè dall i e di monomeri

deossiribosio per il DNA

chiamati nucleotidi.

La differenza fra i due zuccheri è a livello del C2, il deossiribosio infatti presenta un atomo di

• ossigeno in meno rispetto al ribosio

DNA: deossiribonucleotidi

RNA: ribonucleotidi

Le basi azotate, le quali sono sia purine (adenina e guanina) che pirimidine (citosina, timina e

• uracile) Costituenti di un nucleotide

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Si parla di nucleoside se si intende la sola base azotata legata allo zucchero, senza i gruppi

• fosfato, ad esempio l’adenosina composta dall’adenina e dallo zucchero

I nucleotidi si legano fra loro tramite il legame fosfodiesterico, andando a formare le catene di

• DNA

Il legame fosfodiesterico si forma fra il gruppo ossidrile legato al carbonio in posizione 3 di un

• nucleotide e il gruppo fosfato legato al carbonio in posizione cinque del nucleotide successivo

che deve allungare la catena →

Il legame è direzionale e procede in direzione 5’-P 3’-OH

• Di conseguenza il primo nucleotide ha il gruppo fosfato libero mentre l'ultimo ha sempre il

• gruppo -OH libero per poter formare un nuovo legame

Il legame che si instaura fra la base azotata e lo zucchero è invece un legame glicosidico

•

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Il DNA

Il DNA è formato da un doppio filamento costituito da due catene antiparallele e complementari

• Ogni molecola di DNA si distingue per una specifica e unica sequenza delle basi azotate

• I due filamenti sono tenuti assieme da legami idrogeno, in particolare si formano due legami

• idrogeno fra timina e adenina e tre legami fra guanina e citosina

Le basi si appaiano mediante legami a idrogeno seguendo il principio di appaiamento

• complementare delle basi azotate

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I due filamenti si spiralizzano attorno a un asse centrale in una doppia

• elica destrorsa

Lo scheletro zucchero-fosfato è costituito dal legame fosfodiesterico

• che si instaura fra i gruppi fosfato e il deossiribosio, inoltre, la

presenza dei gruppi fosfato conferisce una netta carica negativa alla

molecola di DNA

Il passo dell’elica è costituito da 10 basi

• La distanza fra due basi impilate nell’elica è di 3,4 nm

• La molecola presenta un solco minore e un solco maggiore, dovuto al

• fatto che i filamenti sono antiparalleli

Questo comporta alcune conseguenze, infatti, le proteine che

• interagiscono con il DNA si legano al solco maggiore, il quale permette

la formazione di un maggior numero di legami

Le proteine riconoscono determinate sequenza di nucleotidi che

• formano il solco maggiore, ad esempio A-T oppure C-G e vi si legano

in modo esclusivo

Forme del DNA

Esistono tre diverse forme del DNA: A, B, Z

• forma A

La è destrorsa, si trova in soluzioni a bassa concentrazione di acqua e ha 11 paia di

• basi per giro

forma B

La è quella scoperta da Watson e Crick, ha 10 paia di basi per giro, è destrorsa e si

• trova in soluzioni fisiologiche

forma Z

La è sinistrorsa, ha 12 paia di basi per giro, è allungata e ha funzione regolativa

• La lettera Z indica l'andamento a zig-zag dei nucleotidi

• Le forme B si possono alternare alle forme Z, le quali indicano zone dove vengono trascritti i

• geni

Conformazioni delle basi azotate

Le basi azotate, rispetto allo zucchero, possono assumere due diverse conformazioni per

• anti sin

rotazione del legame glicosidico, la conformazione e conformazione

Le purine possono assumere entrambe le conformazioni, mentre le pirimidine possono esistere

• anti, sin

solo in conformazione perché nella conformazione si genererebbe ingombro sterico

Le diverse conformazioni delle basi azotate discriminano i vari DNA

• anti, sin

Nel DNA A e B tutte le basi sono nel DNA di tipo Z le purine sono e le pirimidine sono

• anti

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Interazioni di Hoogsteen

Fra le basi si possono formare le cosiddette interazioni di Hoogsteen, diverse dai classici legami

• a idrogeno

Queste interazioni atipiche si formano quando la base purinica compie una rotazione di 180°

• Le interazioni di Hoogsteen sono alla base di strutture particolari come la tripla elica del DNA

• (DNA H) e i quartetti di G

La tripla elica di DNA si riscontra per esempio a livello dei telomeri; il terzo filamento forma le

• interazioni di Hoogsteen con gli altri due filamenti, fra i quali si intercala

Nei quartetti di G la molecola di DNA si stabilizza a formare 4 filamenti legati fra loro

• (quadruplex) mediante queste interazioni

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Superavvolgimento del DNA

Quando i due filamenti vengono separati tramite la rottura dei legami a idrogeno si forma una

• bolla

A monte e a valle di tale bolla il DNA cambia la sua spiralizzazione, si parla quindi di

• superavvolgimento positivo o negativo

Se questi superavvolgimenti diventassero troppo grandi andrebbero a bloccare la trascrizione e

• la traduzione, intervengono quindi le topoisomerasi, cioè degli enzimi che rimuovono i

superavvolgimenti quando si ha la separazione dei due filamenti

Si ritrovano due tipi di topoisomerasi:

• Le topoisomerasi di tipo I, per i superavvolgimenti più semplici

• Il superavvolgimento del DNA

Le topoisomerasi di tipo II, le quali rimuovono superavvolgimenti più complessi, come ad

• esempio i “nodi”

Superavvolgimento (-): sottoavvolto (DNA sotto spiralizzato)

Superavvolgimento (+): superavvolto (DNA superspiralizzato)

Superavvolgimento (-): sottoavvolto (DNA sotto spiralizzato)

Superavvolgimento (+): superavvolto (DNA superspiralizzato)

Frazionamento di topoisomeri mediante elettroforesi su gel di agarosio

Figura 2.35 Frazionamento di topoisomeri mediante elettroforesi su gel di

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agarosio.

Topoisomerasi di tipo I

Topoisomerasi di tipo I Le topoisomerasi

Topoisomerasi di tipo II

Topoisomerasi di tipo II Topoisomerasi di tipo II

Reazioni di superavvolgimento-

rilassamento

Reazioni di formazione-

svolgimento di nodi

Reazioni di concatenazione-

deconcatenazione

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Denaturazione e rinaturazione

L’aumento della temperatura fino a circa 90 °C induce la denaturazione, ovvero la rottura dei

• legami idrogeno che tengono uniti i filamenti; conseguentemente i due filamenti si separano

completamente e si ottiene il cosiddetto DNA denaturato

Se il DNA denaturato viene poi posto a temperatura ambiente, dopo una determinato lasso di

• tempo che corrisponde a poco meno di un'ora recupera totalmente la sua struttura, poiché i

filamenti si riuniscono esattamente com'erano in precedenza, si parla quindi di rinaturazione

Questa caratteristica è peculiare del DNA, le proteine, al contrario, possono rinaturarsi solo se la

• denaturazione non è stata completa, altrimenti rimangono denaturate

Questa proprietà del DNA è anche alla base della tecnica della PCR

• Le proteine generalmente assumono a una lunghezza d’onda intorno ai 280 nm, gli acidi nuceici

• invece assorbono a una lunghezza d’onda di 260 nm

Una molecola di acido nucleico denaturato assorbe di più di una molecola di acido nucleico non

• denaturata, si parla in questo caso di effetto ipercromico

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L’RNA

Nell’RNA lo zucchero è il ribosio

• S a c ca d RNA

Le basi azotate presenti nella molecola sono l’adenina, la citosina, la guanina e l’uracile

• RNA:

ribosio

adenina (A)

citosina (C)

guanina (G)

uracile (U)

L’RNA è sempre una molecola a singolo filamento ma ciò non vieta che in alcune zone si

• formino strutture secondarie, dove il filamento si struttura come un doppio filamento, sfruttando

la complementarietà fra basi secondo Watson e Crick

Alcuni esempi sono la forcina, la gemma e l’ansa

• 1. Forcina (hairpin)

a) forcina (hairpin)

2. Gemma (bulge)

b) gemma (bulge)

3. Ansa (loop)

c) ansa (loop)

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Organizzazione del genoma

Complessazione del DNA

Il DNA all’interno delle cellule umane deve essere fortemente compattato

• Il DNA viene “complessato” in cromosomi, i quali possono essere singoli o doppi e formati da

• due cromatidi fratelli legati

Il DNA presente in una cellula umana diploide è lungo circa due metri e deve essere inserito nel

• nucleo che ha un diametro di circa 10 μm, in base al tipo di cellula, di conseguenza deve essere

estremamente complessato

Il DNA ha una carica netta negativa, tali cariche negative tendono a far sì che le varie regioni del

• DNA si respingano reciprocamente, dunque esso non è in grado di complessarsi da solo

Per il complessamento del DNA intervengono gli istoni, proteine basiche, cioè proteine a carica

• positiva e quindi adatte a legarsi al DNA

Tali istoni sono cinque e sono: H2A, H2B, H3, H4 e H1

•

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step

Il primo della complessazione coinvolge i primi 4 istoni (tutti ad esclusione di H1), dei quali

• ciascuno si ripete due volte a formare un ottamero istonico a struttura circolare

Per formare l’ottamero istonico si formano due dimeri di H2A-H2B e un tetramero H3-H4 che si

• core

legano a formare il istonico

La prima classe di istoni che partecipa alla formazione al

primo stadio di compattamento del DNA

Le code ammino-terminali non partecipano alla formazione dell'ottamero, ma sono libere

• Esse sono le regioni su cui avvengono i meccanismi epigenetici (vengono modificate per

• regolare la funzione del nucleosoma) Le code istoniche N-terminali

non sono necessarie per

a c a d DNA c

a c , a

invece modificate per regolare la

funzione del nucleosoma stesso

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Sull’ottamero formato vi si avvolge il DNA per due volte, andando a formare il nucleosoma

• linker

Due nucleosomi adiacenti sono tenuti assieme da un tratto di DNA privo di istoni, il DNA

• La formazione del nucleosoma

A questo livello si parla dunque di “struttura a collana di perle” (ovvero di cromatina)

• L’interazione del DNA con l’ottamero istonico è dinamica e consiste di tre fasi:

• Scivolamento

• Trasferimento

• Rimodellamento

• L a d DNA c a c d a ca

L'istone H1 serve a compattare ulteriormente il nucleosoma

• L’istone H1 si posiziona sopra al nucleosoma, prende quindi contatto con l'istone H1 del

• L H1

nucleosoma vicino e si formano interazioni deboli fra gli istoni di modo che i nucleosomi si

avvicinino arrivando alla formazione di una fibra di cromatina di 30 nm

L H1 si lega al singolo nucleosoma ed avvicina 2 nucleosomi adiacenti mediante un legame

testa-coda

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linker

L’istone H1 si lega al DNA e alla zona centrale del DNA nucleosomico determinando una

• maggiore adesione del DNA all’ottamero istonico

L i e H1 si lega al DNA linker ed alla zona centrale del DNA

nucleosomico determinando una maggiore adesione del DNA

a a e i ic

Senza istone H1 con istone H1

L agg a de e H1 a ad

maggior compattamento del DNA

DNA non complessato con H1 DNA complessato con H1

FIBRA da 30nm

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Modelli strutturali della fibra a 30 nm

Si distinguono due modelli strutturali per la fibra a 30 nm:

• Modello a zig zag

• linker

Si ha se se il DNA è lineare

• In tale modello si formano file adiacenti di nucleosomi

•

Modello a solenoide

• linker

Si ha se se il DNA è curvo

• In tale modello si forma una struttura elicoidale

•

Cromatina

Tanto più il DNA è legato agli istoni e tanto più la cromatina assume un colore scuro

• Si distinguono eterocromatina e eucromatina:

• L’eterocromatina è una regione del DNA fortemente complessata con gli istoni

• E’ di colore più scuro poiché a livello funzionale è inattiva

• Dal punto di vista trascrizionale i geni che vi si trovano non vengono mai trascritti perché gli

• istoni bloccano il processo, di conseguenza l’eterocromatina è inattiva anche dal punto di

vista trascrizionale

L’eucromatina è una regione in cui il DNA è poco complessato

• Essa appare più chiara ed è attiva dal punto di vista funzionale e trascrizionale

•

Una regione che si trova in uno dei due stati può passare all'altro stato, dunque certe regioni

• non trascrivibili possono diventare trascrivibili

Questo è permesso dal fatto che il legame del DNA con l'ottamero istonico è dinamico e

• l'ottamero si può quindi staccare

Le modificazioni chimiche che fanno sì che gli istoni siano più o meno complessati con il DNA

• avvengono sulle code N-terminali

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Strutture di ordine superiore alla cromatina

Si assiste ad un ulteriore impacchettamento, tale ulteriore impacchettamento consiste nella

• Strutture di ordine superiore della cromatina

formazione di anse, bloccate alla base da una struttura proteica detta “impalcatura nucleare”

Si assiste ad un ulteriore impacchettamento: formazione di anse, bloccate alla base da una

arriva infine al livello di cromosoma

• struttura proteica detta impalcatura nucleare .

Il singolo cromosoma ha una dimensione di 700 nm, un cromosoma duplicato ha invece una

• dimensione di 1400 nm 300 nm

700 nm 1400 nm

Schema dell’impacchettamento del DNA

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Replicazione del DNA

Natura semiconservativa del DNA

Nel meccanismo di tipo semiconservativo da una molecola madre di DNA si ottengono due

• molecole figlie, ciascuna con un filamento proveniente dalla madre (parentale) e un filamento di

nuova sintesi

Per la scoperta di tale meccanismo si rimanda all’esperimento di Meselson e Stahl, trattato nel

• corso di Genetica con Laboratorio (II Anno, I Semestre)

In una fase iniziale si ha la separazione dei due filamenti di DNA con rottura dei legami idrogeno,

La duplicazione del DNA prevede la formazione di

• ciò avviene a partire da siti particolari dei cromosomi, chiamati siti ORI (ad indicare “l’origine”)

una forcella di replicazione

Si tratta di regioni ricche in adenina e timina (tra le quali si formano solamente due legami a

• idrogeno)

Si ha quindi la formazione d