Appunti di Biologia Molecolare

Operone Lac ............................................................................................................................................. 86

Operone Gal............................................................................................................................................. 90

Operone araBAD ...................................................................................................................................... 92

Operone Mer ........................................................................................................................................... 93

Gene glnA ................................................................................................................................................ 93

Operone Trp ............................................................................................................................................ 94

Trascrizione negli eucarioti .......................................................................................................................... 99

Regolazione della trascrizione negli eucarioti ........................................................................................... 105

Meccanismi d’azione dei repressori ...................................................................................................... 109

Promotori RNA polimerasi I ................................................................................................................... 110

Promotori RNA polimerasi III ................................................................................................................. 110

6. Processamento del trascrittoma ............................................................................................................... 111

Capping dell’mRNA .................................................................................................................................... 111

Poliadenilazione dell’mRNA ...................................................................................................................... 113

Splicing dell’mRNA ..................................................................................................................................... 116

Trans-splicing ......................................................................................................................................... 122

Splicing alternativo ................................................................................................................................ 122

Editing dell’mRNA ...................................................................................................................................... 125

Processamento dell’ncRNA ....................................................................................................................... 127

Micro-RNA ............................................................................................................................................. 128

7. Sintesi proteica .......................................................................................................................................... 133

Codice genetico ......................................................................................................................................... 133

tRNA ........................................................................................................................................................... 136

ARS ......................................................................................................................................................... 138

rRNA e ribosomi......................................................................................................................................... 139

Anatomia del ribosoma ......................................................................................................................... 141

Selezione dell’AUG nei procarioti .............................................................................................................. 143

Fase d’inizio nei procarioti ......................................................................................................................... 144

Fase d’inizio negli eucariotici ..................................................................................................................... 145

Traduzione indipendente dal Cap al 5’ .................................................................................................. 147

Fase d’allungamento nei procarioti e negli eucarioti ................................................................................ 147

Entrata dell’aa-tRNA .............................................................................................................................. 148

Formazione del legame peptidico ......................................................................................................... 150

Traslocazione ......................................................................................................................................... 151

Fase di terminazione nei procarioti e negli eucarioti ................................................................................ 153

Rilascio del polipeptide .......................................................................................................................... 154

Post-terminazione ................................................................................................................................. 155

Regolazione della sintesi proteica ............................................................................................................. 155

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Antibiotici che bloccano la sintesi proteica ........................................................................................... 155

Meccanismi di ricodificazione ............................................................................................................... 156

Controllo traduzionale dell’espressione genica .................................................................................... 160

Meccanismi di controllo della qualità dell’mRNA ................................................................................. 162

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1. Introduzione alla Biologia Molecolare

Dogma centrale della Biologia Molecolare

Il dogma centrale della biologia molecolare è un

assioma che serve a descrivere il flusso di informazioni

che viene riscontrato all’intero di un sistema biologico

(appartenente ad ogni dominio ed avente qualsiasi

livello di complessità). Le informazioni in questione

sono contenute stabilmente all’interno del DNA. Il vero

patrimonio di DNA che caratterizza ogni forma vivente

prende il nome di genoma. Il DNA quindi è il depositario

di tutta l’informazione genetica che caratterizza quella

particolare forma di vita. Il DNA può andare incontro ad

un processo di auto-perpetuazione in quanto può

duplicarsi ed essere trasmesso, con tutta la mole di

informazioni che contiene, alle generazioni successive.

Parte dell’informazione contenuta nel DNA deve essere

selettivamente utilizzata (a seconda del tipo cellulare, a

seconda del momento di vita della cellula e a seconda delle condizioni ambientali) e per dar luogo a molecole

che sono gli RNA messaggeri (mRNA) l’unico tipo di RNA codificante. Tutta la popolazione degli RNA

(codificanti e non codificanti) prende il nome di trascrittoma. Il meccanismo biochimico che dal DNA dà luogo

all’RNA (indipendentemente dal fatto che quest’ultimo sia codificante o meno) si chiama trascrizione.

Dall’RNA bisogna esplicare la quota d’informazione che si sta traendo dal DNA dato che l’RNA rappresenta

un intermedio in questo processo di espressione dell’informazione genetica. Il materiale risultante che si

ottiene da questa quota di informazione sarà una proteina che si ottengono attraverso un meccanismo

biologico che prende il nome di traduzione (tutte le proteine prodotte costituiscono il proteoma). È possibile

notare nello schema un flusso unidirezionale dell’informazione che viene selettivamente utilizzata dal

genoma fino al proteoma. Soltanto il genoma è costante ed invariante per quella particolare forma vivente e

nel caso in cui sia un organismo multicellulare, anche se i tipi cellulari che lo costituiscono sono differenti, il

genoma contenuto in ogni cellula di questo organismo sarà sempre identico. Al contrario esiste

un’elevatissima dinamicità in quello che è il contenuto quali-quantitativo del trascrittoma e del proteoma.

Queste due componenti che sono interconnesse fra loro cambiano a seconda del tipo cellulare ma anche

all’interno della stessa tipologia di cellule a seconda delle condizioni ambientali, del ciclo cellulare e in base

alle segnalazioni delle fonti di stress a cui è sottoposta la tipologia di cellule in questione. Il trascrittoma e il

proteoma possiedono questa plasticità che si manifesta in risposta a particolari stimoli endogeni ed esogeni.

Quella descritta finora è la descrizione originale del dogma centrale che nel corso dei decenni ha subito

diverse modifiche. Infatti è stato scoperto che una quota dell’informazione contenuta nel DNA non dipende

esclusivamente dal contenuto quali-quantitativo del DNA ma anche da una serie di modificazioni che possono

essere associate al DNA (ovvero la cosiddetta epigenetica). Il concetto chiave dell’epigenetica è che

l’informazione genetica rimane inalterata però può variare, ad esempio, lo stato conformazionale dello

stesso genoma e questo può avere come conseguenza la produzione di trascrittomi e proteomi differenti.

Nello schema è possibile notare il “doppio senso di circolazione” tra RNA e DNA. Infatti studi effettuati su

particolari agenti biologici (i retrovirus) hanno messo in evidenza l’esistenza di un enzima (trascrittasi

inversa), unico nel suo genere e non ritrovato in nessun altra forma di vita, che è in grado di catalizzare la

reazione opposta a quella della trascrizione e cioè utilizzare uno stampo di RNA per generare DNA. In alcuni

virus (chiamati ribovirus) il patrimonio genetico è rappresentato esclusivamente da RNA che è in grado di

replicare e di auto-perpetuarsi. Infine anche le proteine possono comportarsi da tratti ereditari e questo

aspetto è stato riscontrato nei prioni proteine che hanno una certa “conformazione” e che possono indurre

in tale “conformazione” altre proteine che si ritrovano nella conformazione canonica.

5

Dalla scoperta del DNA alla dimostrazione del suo ruolo come materiale genetico

Johan Friedrich Miescher (Basilea, 13 agosto 1844 – Davos, 26 agosto 1895) è

stato un biologo svizzero, che isolò per la prima volta gli acidi nucleici. Il

laboratorio (situato nei sotterranei di un vecchio castello) dove Miescher isolò

per la prima volta la nucleina. Egli evidenziò infatti nel 1869, presso i laboratori

di Felix Hoppe-Seyler a Tubinga, la presenza di vari composti chimici ricchi in

fosfato all'interno dei nuclei dei leucociti. La scoperta di tali molecole, che egli

denominò nucleina, aprì la strada all'identificazione del DNA come molecola

responsabile della conservazione e della trasmissione dei caratteri ereditari.

Miescher proveniva da una famiglia molto in vista nella comunità scientifica: il

padre e lo zio erano infatti stati professori di anatomia all’università. Timido ed

intelligente, il giovane Miescher studiò medicina proprio a Basilea e, durante

gli studi, lavorò per un'estate (nel 1865) presso il chimico organico Adolf

Stecker a Gottinga. A causa di una febbre tifoide, che gli provocò anche gravi

problemi all'udito, Miescher dovette interrompere gli studi per un anno, per laurearsi in ogni caso nel 1868.

Ritenendo che la sua sordità parziale potesse ostacolare l'attività di medico, Miescher si avviò verso la

carriera di chimico fisiologo. Iniziò a studiare i linfociti, ma Felix Hoppe-Seyler lo incoraggiò a studiare i

leucociti. Miescher era infatti interessato soprattutto nello studio della chimica del nucleo: dal momento che

era difficile ottenere un numero di linfociti sufficienti per uno studio, la scelta ricadde sui leucociti, che erano

noti per essere il principale componente del pus, ottenibile facilmente dalle garze usate nei vicini ospedali.

Per evidenziare il nucleo dei leucociti presenti nel pus, Miescher dovette mettere a punto un protocollo

totalmente nuovo. Per recuperare le cellule dai bendaggi, utilizzò una soluzione salina a base di solfato di

sodio. Per separare i nuclei dai citoplasmi, sottopose le cellule ad una soluzione alcalina, seguita da una acida.

Il precipitato formatosi in seguito a tale processo fu, appunto, chiamato nucleina. In seguito Miescher scoprì

che la nucleina conteneva azoto e fosforo, ma non zolfo. Questi risultati si rivelarono così innovativi che

Hoppe-Seyler decise di ripetere tutti gli esperimenti prima di pubblicarli sul suo giornale. In seguito, Miescher

si spostò nel laboratorio di Carl Ludwig a Lipsia, dove studiò per un anno fisiologia prima di tornare a Basilea

come professore di fisiologia. A Basilea egli avviò proficui studi sulla chimica degli acidi nucleici, sebbene la

loro funzione continuasse a non essere chiara. In ogni caso il suo lavoro, fondamentale per l'identificazione

degli acidi nucleici come sede dell'informazione genetica, fu noto alla maggior parte della comunità scientifica

solo quando l'importante fisiologo tedesco Albrecht Kossel non portò avanti, a sua volta, esperimenti sulla

struttura chimica della nucleina. Miescher morì nel 1895 di tubercolosi, dopo aver condotto anche un

laboratorio della Max Planck Society a Tubinga ed un istituto di ricerca di Basilea che, dopo la sua morte,

prese il suo nome.

Phoebus Aaron Theodore Levene (Sagor, 25 febbraio 1869 – New York, 6

settembre 1940) è stato un biochimico lituano, emigrato nel1893 negli Stati Uniti

a causa dei pogrom antisemiti che avevano come bersaglio anche la sua famiglia,

di origine ebraica. Levene studiò lungamente il DNA e scoprì che esso contiene

adenina, guanina, timina, citosina, deossiribosio ed un gruppo fosfato. Nato in

una famiglia ebrea con il nome di Fishel Aaronovich Levin a Sagor, nell'attuale

Lituania (allora Russia), visse la sua giovinezza a San Pietroburgo (allora

Pietrogrado), dove si laureò nel 1891 in medicina presso l'Accademia Medica

Militare Imperiale e sviluppò la passione per la biochimica. A causa del crescente

odio antisemita, emigrò con la famiglia verso gli Stati Uniti nel 1893 ed iniziò a

svolgere l'attività di medico a New York. Levene fu assunto dalla Columbia

University, dove poteva svolgere ricerche biochimiche nel tempo libero, ed iniziò

a pubblicare articoli sulla struttura degli zuccheri. Nel 1896 fu assunto come

associato al Pathological Institute del New York State Hospitals e dovette curarsi per recuperare dalla

tubercolosi. In questo periodo conobbe e lavorò con chimici estremamente esperti di proteine, come

Albrecht Kossel e Hermann Emil Fischer. Nel 1905 Levene divenne il direttore del laboratorio di biochimica al

Rockefeller Institute of Medical Research, dove trascorse il resto della carriera ed identificò i componenti del

DNA (scoprì il ribosio nel 1909 ed il deossiribosio nel 1929). Oltre a scoprirne i componenti, Levene formulò

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alcune ipotesi sulla struttura del DNA che si rivelarono corrette. Egli

mise in luce la disposizione dei componenti secondo la sequenza

ripetuta fosfato-zucchero-base, unità che chiamò per la prima volta

nucleotide, ed ipotizzò che le molecole di DNA non fossero altro che

filamenti composti da nucleotidi collegati tra loro attraverso i gruppi

fosfato, considerati lo scheletro del DNA stesso. Le sue idee

complessive sulla struttura del DNA non si rivelarono tuttavia

corrette: egli infatti riteneva anche che ci fossero solo quattro

nucleotidi per molecola e, per tale motivo, escluse che il DNA

potesse essere il vettore dell'informazione genetica, perché la

riteneva una molecola troppo semplice per tale scopo. Intorno al

1910, Levene formulò l'ipotesi del tetranucleotide, che proponeva

che il DNA fosse costituito da quantità eguali di adenina, guanina,

citosina e timina. Prima della formulazione delle regole di Erwin Chargaff, tale ipotesi ebbe un successo tale

da portare la maggior parte della comunità scientifica a non credere che il DNA potesse essere vettore

dell'informazione genetica. In ogni caso, il lavoro di Levene fu fondamentale per delineare la vera struttura

del DNA, struttura che egli non poté tuttavia apprezzare, a causa della morte nel 1940, tredici anni prima

della pubblicazione su Nature della struttura a doppia elica da parte di James Watson e Francis Crick.

Esperimento di Griffith

L'esperimento di Frederick Griffith del 1928 fu uno dei primi esperimenti a suggerire che i batteri sono in

grado di trasferire informazioni genetiche attraverso un processo noto come trasformazione. In tal modo,

esso aprì la strada alla determinazione di quale fosse la natura del materiale genetico.

L'ufficiale medico inglese F. Griffith in quegli anni studiava un batterio in grado di causare la polmonite:

lo pneumococco (Streptococcus pneumoniae). Nei suoi esperimenti fece uso di due ceppi batterici:

 Il ceppo S, detto anche liscio dal momento che produce colonie lisce e lucenti (grazie alla presenza di

una capsula batterica polisaccaridica che avvolge ogni cellula). Questo ceppo è in grado di provocare

la polmonite.

 Il ceppo R, detto anche rugoso dal momento che produce colonie dall'aspetto "rugoso" (a causa

dell'assenza della capsula batterica). Questo ceppo non è in grado di provocare polmonite.

Di fatto ora sappiamo che il ceppo R deriva da una mutazione di un ceppo S.

Per quanto riguarda il ceppo S, ne esistono diverse varianti suddivise in base alla composizione chimica della

capsula. Griffith, in particolare, studiò le varianti note come IIS e IIIS. In seguito a mutazioni di batteri IIS si

potevano sviluppare batteri R (privi di capsula). I batteri R (detti IIR dal momento che derivano da batteri IIS)

possono retromutare (cioè riacquisire, in modo naturale, la capacità di produrre la capsula batterica) e

formare pneumococchi di ceppo S: ma solo IIS. Lo stesso discorso vale per i batteri IIIS. In definitiva IIR non

potrà mai retromutare in IIIS e IIIR ma potrà retromutare in IIS.

Schema dell’esperimento:

 Quando Griffith iniettò batteri IIR

in un topo, verificò che

la cavia non si ammalava e non era

possibile isolare questi batteri

dai tessuti dell'animale.

 Quando il medico iniettò batteri

IIIS in un topo, verificò che

l'animale si ammalava, moriva ed

era possibile isolare questi batteri

dai tessuti dello stesso.

 Successivamente prese alcuni

batteri IIIS e li uccise in seguito a

shock termico. Iniettò poi questi

batteri morti in un topo e come c'era d'aspettarsi il topo non si ammalò e non fu possibile isolare IIIS

dai tessuti dell'animale. 7

Da ciò si deduce che, per provocare la malattia, è necessaria la presenza della capsula e i batteri capsulati

devono essere ovviamente vivi.

 A questo punto Griffith preparò una miscela in cui erano presenti batteri vivi IIR e batteri morti IIIS

(uccisi da trattamento termico). Iniettò questa miscela in un topo: quello che ci si aspettava era la

NON comparsa di malattia nell'animale (dal momento che non sarebbero dovute sussistere le

condizioni appena citate). In realtà il topo si ammalò e morì; nei suoi tessuti si riscontrarono batteri

IIIS.

Per spiegare a prima vista questo strano risultato si potrebbe forse pensare che alcuni batteri IIR iniettati

siano retromutati in IIS (causando la polmonite), ma questo è da escludere dal momento che nei tessuti

dell'animale erano stati isolati batteri IIIS e non IIS. Griffith propose l'unica spiegazione plausibile: alcuni

batteri IIR, in seguito all'interazione con batteri morti IIIS si erano trasformati in IIIS. Evidentemente

all'interno dei IIIS morti doveva essere presente una qualche sostanza in grado di conferire ai batteri IIR che

l'acquisivano la capacità di sintetizzare la capsula polisaccaridica. Questa sostanza è il materiale genetico.

Griffith chiamò il materiale genetico principio trasformante. Erroneamente, come però la stragrande

maggioranza degli scienziati suoi contemporanei, riteneva che questa sostanza dovesse essere di

natura proteica. A partire da questo importantissimo esperimento, Avery, MacLeod e

McCarty nel 1943 dimostrarono che il materiale genetico in questione era il DNA (anche se la prova definitiva

arrivò solo dagli esperimenti di Hershey e Chase del 1953).

Esperimento di Avery

L'esperimento di Avery (Oswald Theodore Avery) e dei suoi

colleghi Colin MacLeod e Maclyn McCarty risale al 1943 e

rappresenta una delle esperienze fondamentali per

l'avanzamento delle conoscenze nel campo della genetica e

della biologia molecolare. Tramite l'esperimento gli scienziati

riuscirono a dimostrare che il cosiddetto principio trasformante

(ovvero il portatore di informazioni geniche) scoperto nel 1928

da Griffith in seguito al suo famoso esperimento era il DNA.

Avery si procurò una coltura di pneumococchi di tipo S. A questo

punto lisò le cellule (cioè ne ruppe la parete e la membrana

cellulare) in modo da ottenere una soluzione nella quale era

disciolto il materiale contenuto nei batteri, il cosiddetto estratto

cellulare o lisato cellulare. Il materiale genetico doveva

presumibilmente essere uno dei diversi tipi di macromolecole

biologiche presenti nei batteri: (proteine, polisaccaridi, acidi

nucleici – ovvero DNA e RNA– e lipidi). Avery e colleghi

riuscirono a separare l'estratto cellulare nelle varie componenti

macromolecolari appena citate. Successivamente cercarono di

capire quali di queste sostanze erano effettivamente in grado di

trasformare batteri R avirulenti in batteri S virulenti. Le cavie sopravvivevano quando trattate con tutte le

biomolecole tranne gli acidi nucleici: il materiale genetico doveva essere quindi DNA e/o RNA. Per capire

quale delle due sostanze fosse, divisero l'estratto contenente l'acido nucleico in due aliquote: una venne

trattata con l'enzima ribonucleasi (RNasi) che degrada selettivamente l'RNA e non il DNA, l'altra venne invece

trattata con desossiribonucleasi (DNasi) che degrada selettivamente il DNA e non l'RNA. Ciò che si osservò

era la trasformazione dei batteri R in batteri S solo in seguito all'aggiunta dell'aliquota trattata con RNasi (che

quindi aveva degradato l'RNA). Il materiale genetico doveva allora essere necessariamente il DNA. Il

sopracitato esperimento non convinse tutti gli scienziati dell'epoca. Vi era infatti in quel periodo la

convinzione diffusa (tra l'altro insita nello stesso Griffith) che il materiale genetico dovesse essere di natura

proteica. Sia il DNA che le proteine sono dei polimeri. Nel caso delle proteine i monomeri (le unità base che

ripetute danno il polimero) sono i 20 amminoacidi. Nel caso del DNA i monomeri sono solamente i 4

deossiribonucleotidi. Dal momento che l'informazione genetica doveva essere contenuta in queste

macromolecole lineari, e considerata la grande differenza genetica tra le varie specie, pareva più sensato che

il materiale genetico fosse natura proteica: in questo modo, rispetto agli acidi nucleici, sarebbero state

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possibili molte più combinazione tra i vari monomeri e di conseguenza l'informazione contenuta dalla

macromolecola sarebbe stata maggiore. Sotto la spinta di queste convinzioni, quello che veniva criticato ad

Avery era la non completa purezza degli acidi nucleici utilizzati nell'esperimento: all'interno delle soluzioni

contenenti DNA e RNA si ipotizzava fossero presenti anche tracce di proteine, le stesse proteine che gli

scienziati scettici pensavano costituissero il materiale genetico. In questo senso, pur non tralasciando

l'importanza dell'evidenza sperimentale, non si può dire che l'esperimento di Avery, MacLeod e McCarty

fosse la prova definitiva. Solo una decina di anni più tardi (1953) Hershey e Chase dimostrarono che il

materiale genetico è costituito da DNA.

Esperimento di Hershey-Chase

L'esperimento di Alfred D. Hershey e Martha Chase prova definitivamente nel 1952 che il materiale genetico

è costituito da DNA e non da proteine. In seguito a questi risultati incontrovertibili anche gli scienziati che

avevano criticato l'esperimento di Avery, di MacLeod e di McCarty si convincono dell'importantissimo ruolo

biologico del DNA. Hershey e Chase svolgevano studi su un fago, ovvero un virus in grado di infettare i batteri,

nel loro caso il batterio Escherichia coli (E. coli); in particolare il fago di loro interesse era noto come "T2".

All'epoca era noto che T2 era formato esclusivamente da DNA protetto da un involucro proteico. I due

scienziati prepararono in parallelo due colture di Escherichia Coli:

 Nel terreno di coltura della

prima introdussero fosforo

32

(l'isotopo P).

 Nel terreno di coltura della

seconda introdussero zolfo

35

(l'isotopo S).

I batteri delle due colture

metabolizzarono da una parte il

fosforo e dall'altra lo zolfo

introducendo questi atomi

radioattivi nelle biomolecole

presenti all'interno delle cellule. In

particolare:

 Il fosforo si troverà in gran

parte nei nucleotidi e di

conseguenza anche negli

acidi nucleici; non sarà presente invece in quantità significative nelle proteine.

 Lo zolfo si troverà nelle proteine (in particolare nell'amminoacido cisteina) e non si troverà nei

nucleotidi.

A questo punto i ricercatori infettarono parallelamente le colture batteriche con il fago T2. Questo virus

utilizza l'apparato biosintetico delle cellule di E. coli per replicare il proprio DNA e per sintetizzare le proteine

del rivestimento. Dal momento che i nucleotidi e gli amminoacidi utilizzati nella sintesi del DNA e delle

proteine virali sono quelli presenti all'interno della cellula infettata, ne risulta che i fagi sviluppati

dall'infezione nella prima coltura avranno un DNA marcato radioattivamente, mentre quelli sviluppati

dall'infezione della seconda coltura avranno il rivestimento proteico esterno marcato radioattivamente.

Hershey e Chase separarono i fagi neoformati (quelli marcati) dai due terreni di coltura e, separatamente, li

utilizzarono per infettare altre due colture di E. coli, in questo caso cresciute su terreni "standard" privi di

isotopi radioattivi:

 Nel caso in cui i fagi infettanti avessero il DNA marcato, in seguito all'infezione gran parte della

radioattività veniva misurata all'interno delle cellule batteriche colpite (e nel DNA di una parte dei

nuovi fagi sviluppatisi in seguito a questa infezione).

 Nel caso in cui i fagi infettanti avessero il rivestimento proteico marcato, la radioattività veniva

misurata solamente all'esterno delle cellule batteriche colpite (e non era presente sul rivestimento

proteico dei nuovi fagi sviluppatisi in seguito a questa infezione).

Il processo utilizzato per determinare se la radioattività provenisse dall'interno o dall'esterno delle cellule fu

il seguente: dopo un certo tempo dall'inizio dell'infezione, il terreno di coltura veniva posto in un

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omogenizzatore. La conseguente agitazione provocava il distacco del rivestimento proteico dei virus dalla

membrana cellulare (in questo caso si parla di "ombre fagiche" poiché questi rivestimenti proteici non

contengono il DNA che è già stato iniettato nella cellula). Il tutto veniva poi centrifugato: la parte cellulare

(contenente eventualmente il DNA marcato) rimaneva sul fondo della provetta, mentre i rivestimenti proteici

distaccati dalle membrane cellulari rimanevano in sospensione. A seconda di dove si misurava la maggiore

radioattività era possibile dedurre se la molecola marcata si trovasse o meno all'interno della cellula. Nel caso

del DNA marcato la radioattività si misurò sul fondo della provetta mentre nel caso delle proteine marcate la

radioattività si misurò sul sopranatante. Dal momento che il fago per replicarsi ha bisogno di introdurre

all'interno della cellula ospite il suo materiale genetico per poter sfruttare l'apparato batterico di replicazione

del DNA, appare evidente che questo materiale genetico deve per forza essere il DNA poiché, come

dimostrato, le proteine non entrano nella cellula colpita mentre il DNA sì.

Il modello a doppia elica del DNA

Il 1953 è anche l'anno in cui, attraverso ulteriori immagini

da diffrazione a raggi X realizzate da Rosalind Franklin,

chimica-fisica inglese, James Watson e Francis

Crick presentarono, sulla rivista Nature, quello che è oggi

accertato come il primo modello accurato della struttura

del DNA, ovvero il modello a doppia elica. A disegnarne il

bozzetto fu Odile Speed, pittrice e moglie di Crick. Le

evidenze sperimentali a supporto del modello di Watson e

Crick furono riportate in una serie di cinque articoli

pubblicati sullo stesso numero di Nature. Tra questi

figurava l'articolo della Franklin e di Raymond Gosling, che

conteneva i dati di diffrazione a raggi X, fondamentale per

sostenere il modello. Tale numero conteneva anche un

articolo sulla struttura del DNA scritto da Maurice

Wilkins. Nel 1962, dopo la morte di Rosalind Franklin (a

causa di un tumore provocato, probabilmente, dalle alte

dosi di raggi X a cui si era esposta nel corso dei suoi

esperimenti), Watson, Crick e Wilkins ricevettero

congiuntamente il Premio Nobel per la medicina. Dal

momento che la scoperta del modello si basò

essenzialmente sui dati di Rosalind Franklin, ancora oggi

esistono pareri molto eterogenei nella comunità scientifica

su chi avrebbe dovuto ricevere tale premio.

Le regole di Chargaff

Erwin Chargaff è stato un biochimico austriaco. Emigrò negli Stati Uniti

d'America durante il periodo nazista in Germania. Chargaff è ricordato per

le sue regole, enunciate nel 1950, che diedero un importante contributo

nella determinazione della struttura della molecola di DNA. Eseguì

importanti ricerche sul metabolismo dei grassi e sul chimismo degli acidi

nucleici, in particolare sul DNA. Ricorrendo alla tecnica di cromatografia su

carta riuscì a separare la molecola del DNA nelle sue basi costituenti a

determinare la loro percentuale di abbondanza relativa. I suoi studi

costituirono un passo decisivo verso la conoscenza della struttura del DNA,

evidenziata poi in seguito da Watson e Crick. Le “regole di

Chargaff” derivano dagli studi condotti dallo stesso relativi

al DNA contenuto nelle cellule di diversi organismi. In particolare le regole

mostrano dei particolari rapporti tra le quattro basi azotate del DNA

(adenina, guanina, timina e citosina).

Si possono distinguere due regole: 10

 la prima regola mostra l'esistenza di un rapporto 1:1 tra le basi puriniche (A+G) e le

basi pirimidiniche (T+C) contenute nel DNA di una cellula. Il rapporto è costante in tutte le specie, ma

per specie diverse le percentuali delle varie basi saranno anch'esse diverse. Questo rispecchia

la diversità genetica delle diverse specie.

 la seconda regola mostra che in una molecola di DNA a doppio filamento la concentrazione di adenina

eguaglia quella di timina e la concentrazione di citosina quella di guanina (%A = %T; %C = %G). Questo

vale per il DNA estratto dalle cellule di tutti gli organismi, anche se considerando organismi diversi le

percentuali avranno valori diversi. Questa semplice regola è stata uno degli elementi essenziali che

hanno permesso la formulazione del modello di DNA da parte di James Watson e Francis Crick. Grazie

anche a questa regola si è dedotto come le corrette forme di appaiamento delle basi tra i due

filamenti del DNA.

Nel 2006 si è dimostrato che la prima regola di Chargaff è valida per quattro dei cinque tipi di genoma con

DNA a doppio filamento esistenti: quello eucariotico, procariotico (o batterico), quello virale e quello degli

archeobatteri. Non è invece applicabile per i genomi dei mitocondri e dei cloroplasti. Non vale inoltre

neanche per i genomi di DNA a singolo filamento (presenti soltanto in alcuni virus). L'origine della deviazione

dalle regole di Chargaff negli organelli si pensa sia legata al particolare meccanismo di replicazione che essi

adoperano. Durante la replicazione infatti i filamenti di DNA si separano; sul DNA a singolo filamento la

citosina lentamente va incontro a deaminazione trasformandosi in timina. Maggiore è il tempo nel quale il

filamento è separato maggiore è la frequenza con cui la citosina deamina spontaneamente. Per ragioni non

ancora chiare i filamenti tendono a restare separati molto di più negli organelli che non nel DNA

cromosomico. Il processo tende quindi a formare un filamento di DNA con più timina e guanina del normale;

l'altro con più adenina e citosina. I dati sulla sequenza di questi genomi hanno confermato questa ipotesi.

11

2. Struttura degli acidi nucleici

Struttura fisica del DNA

Gli acidi nucleici sono

composti dalla ripetizione di

un’unità costitutiva che è il

nucleotide. Il nucleotide è

formato da 3 specie chimiche:

una base azotata, un

carboidrato (e in particolare

uno zucchero pentoso) e un

gruppo fosfato. Un

nucleotide è suscettibile

all’aggiunta o alla rimozione di 1 o più gruppi fosfato e quindi, sulla base del fatto che si possono aggiungere

o rimuovere al massimo 3 gruppi fosfato, si parlerà di nucleotide monofosfato, difosfato o trifosfato a

seconda del numero dei gruppi fosfato legati ciascuno dei quali viene contrassegnato con una lettera greca

ben precisa (α, β e γ) rispettivamente in ordine di vicinanza rispetto allo zucchero (il residuo α è legato

direttamente allo zucchero e i restanti seguono l’ordine alfabetico). I residui ortofosforici. È sufficiente la

presenza di una base azotata e di uno zucchero (legati da un particolare legame che vedremo più avanti) per

formare un nucleoside. Le basi azotate nel DNA sono 4 e sono di 2 categorie: le purine (adenina e guanina)

caratterizzate da un doppio anello eterociclico e le pirimidine (citosina e timina) caratterizzate da un unico

anello eterociclico. Esiste un’ulteriore pirimidina che è l’uracile che non si ritrova mai nel DNA ma è una

componente esclusiva dell’RNA in sostituzione alla timina. Queste basi per convenzione si indicano con delle

abbreviazioni riportanti solo la prima lettera del loro nome (A, G, C, T e U). In base alla base azotata possiamo

avere due nomenclature rispettivamente per i nucleosidi e per i nucleotidi: per i primi è necessario

aggiungere il suffisso –ina (adenosina, guanosina, citidina, timidina e uridina) mentre per i secondi che hanno

in più i residui ortofosforici (derivanti dall’acido ortofosforico) aventi carattere acido è necessario aggiungere

acido e –ico come suffisso (acido adenilico, acido guanilico, acido citidilico e acido uridilico; nel DNA i

desossinucleotidi prendono il nome di acido desossiadenilico, acido desossiguanilico, acido desossicitidilico

e acido desossitimidilico). Le abbreviazioni possono essere di 3 lettere (AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP …) o

a 4 per indicare i deossiribonucleotidi (dAMP, dADP, dATP, dGMP, dGDP, dGTP …). Ogni tipo di base presente

su un filamento forma un legame con la base posta sul filamento

opposto. Tale evento è noto come appaiamento complementare. Le

basi puriniche formano legami idrogeno con le basi pirimidiniche: A

può legare solo T e G può legare solo C. L'associazione di due basi

viene comunemente chiamata paio di basi ed è l'unità di misura

maggiormente utilizzata per definire la lunghezza di una molecola di

DNA. Dal momento che i legami idrogeno non sono covalenti, essi

possono esser rotti e riuniti in modo relativamente semplice, poiché

questi sono legami ad alta energia. I due filamenti possono essere

allontanati tra loro, come avviene per una cerniera, sia dalle

alte temperature che da un'azione meccanica (come avviene

durante la replicazione del DNA). Conseguenza di questa

complementarità è che tutte le informazioni contenute nella doppia

elica possono essere duplicate a partire da entrambi i filamenti,

evento fondamentale per una corretta replicazione del DNA. I due

tipi di paia di basi formano un numero differente di legami idrogeno:

A e T ne formano due, G e C tre. Per quanto riguarda lo zucchero

pentoso anche in questo caso abbiamo una distinzione tra DNA ed RNA. Lo zucchero in questione è il ribosio

(un aldo-pentoso) i cui atomi di carbonio si possono distinguere in base alla posizione della base azotata (C1’,

C2’, C3’, C4’ e C5’). Il 2-deossiribosio (che si ritrova esclusivamente nel DNA) differisce dal ribosio (che si trova

esclusivamente nell’RNA) per la mancanza del gruppo ossidrilico sul C2’. I legami presenti tra lo zucchero e la

base azotata e tra lo zucchero e il primo residuo ortofosforico (α) si sono formati a seguito di una reazione di

12

condensazione (liberazione di una molecola di H O in seguito alla formazione di questo legame chimico

2

mentre la reazione inversa sarebbe l’idrolisi). Le basi azotate utilizzano un atomo di azoto che fa parte

dell’anello eterociclico (singolo o doppio a seconda del fatto che la base sia una pirimidina o una purina) per

formare il legame N-glicosidico con il C1’ dello zucchero. Il primo residuo ortofosforico contrae un legame

fosfomonoesterico con il C5’ dello zucchero. I singoli nucleotidi si legano l’uno all’altro (in maniera precisa e

vedremo come) formando delle catene lineari

dette polinucleotidi. In questi polinucleotidi si ha

una certa asimmetria che garantisce una polarità

che viene definita di tipo 5’-3’ (il gruppo fosforico

di un nucleotide contrae un legame

fosfomonoesterico con il C3’ dello zucchero di un

altro nucleotide quindi il nucleotide a cui

appartiene il gruppo fosforico è legato al

nucleotide successivo attraverso due legami

fosfomonosterici che insieme formano un

legame fosfodiesterico). Questa polarità si ripete

per ogni nucleotide (e quindi lungo la catena

polinucleotidica). Questa catena polinucleotidica

(potenzialmente infinita) inizia (arbitrariamente)

con un nucleotide fosforilato in posizione C5’

(che corrisponde all’estremità 5’ della catena polinucleotidica) e termina con un nucleotide che presenta un

C3’-OH libero da qualsiasi legame (che corrisponde all’estremità 3’ della catena polinucleotidica).

Nell’ipotetica catena polinucleotidica (o filamento polinucleotidico) presa in esame finora si può notare una

componente “ricorrente” e una componente “variabile”: la componente ricorrente è l’impalcatura zucchero-

fosfato (in quanto si ripetono gli zuccheri alternati ai gruppi fosforici) che è anche “statica” in quanto è quasi

completamente identica (tranne per un gruppo ossidrilico) tra DNA ed RNA; la componente variabile è

rappresentata dalle basi azotate.

Parametri strutturali della doppia elica

Passo dell’elica

(P) = distanza che intercorre tra due punti equivalenti nella struttura a doppia elica.

Altezza

h) = distanza che si ha tra due coppie di basi adiacenti; maggiore sarà questo parametro maggiore sarà il

passo dell’elica e viceversa.

Periodicità

(n) = il grado di avvolgimento dei due filamenti nucleotidici attorno a questo asse immaginario o il numero di

coppie di basi per giro d’elica; a parità di periodicità il passo d’elica può essere differente in dipendenza della

distanza delle coppie di basi stesse.

Perché il DNA è una doppia elica?

Il 2-deossiribosio come tutti i carboidrati è una molecola solubile in acqua e lo stesso vale per il gruppo

fosfato. Le basi azotate possiedono un comportamento di tipo idrofobico. Quando una molecola di DNA è

inserita in un sistema vivente, in cui la quota idrica è preponderante, la presenza di un numero elevato di

specie idrofobiche si oppone alla solubilità del DNA. Questa idrofobicità è però mascherata dalla presenza

dello scheletro zucchero-fosfato. Ciò che accade in natura è l’appaiamento delle basi azotate minimizzando

l’interfaccia di contatto con la soluzione acquosa (maggiore stabilità termodinamica) → struttura elicoidale

e in particolare a doppia elica (6 Å tra due gruppi fosfato, 5 Å di scivolamento elicoidale di una coppia di bassi

rispetto ad un'altra e 3,3 Å di spessore di una base azotata). Questa struttura a doppia elica è realizzata dalla

sovrapposizione e dall’interazione di 2 filamenti polinucleotidici aventi l’uno rispetto all’altro un

orientamento anti-parallelo (le polarità 5’-3’ dei due filamenti sono invertite). Per cui se un filamento ha

l’estremità 5’ a sinistra e l’estremità 3’ a destra il filamento anti-parallelo avrà l’estremità 3’ a sinistra e

l’estremità 5’ a destra. L’orientamento (o andamento) anti-parallelo è sinonimo di anti-complementarietà tra

i 2 filamenti polinucleotidici. 13

Isomorfismo geometrico delle coppie di basi

Le basi azotate libere potrebbero potenzialmente dar luogo a 28 differenti interazioni ma quando esse sono

collocate all’interno del DNA i gradi di libertà nella gestione di queste interazioni sono estremamente ridotti

e limitati alle cosiddette possibilità di Watson-Crick (A-T, C-G). Questa

situazione dipende da una motivazione energetica (le coppie di basi W-

C sono più stabili) e da un aspetto sterico (il caratteristico isomorfismo

di queste coppie di basi = hanno valori quasi identici di ampiezza,

distanza tra C1’ (10,85 Å) e degli angoli dei legami N-glicosidici (51,5°))

→ lo spessore costante della doppia elica di DNA. Il fatto che le coppie

di basi siano isomorfe dà la possibilità di descrivere due assi di

simmetria che vengono coniugati assieme in un unico asse detto “asse

di simmetria rotazionale doppio” o “asse di pseudodiade” perché nella

sua costituzione più intima A non è equivalente a T e G non è

equivalente a C e viceversa.

Conformazioni tautomeriche

Tutte le basi azotate esistono in natura in un equilibrio spontaneo tra

due forme che sono in risonanza stereoisomerica tra loro. Questo

equilibrio però è nettamente spostato verso uno dei due tautomeri (quello più stabile e termodinamicamente

favorito). Nel caso specifico delle basi azotate di parla di tautomeria

prototropica (poiché prevede lo spostamento di un protone e ciò

comporta una concomitante variazione nel posizionamento di un

doppio legame). Quindi per le basi azotate questa tautomeria

prototropica si traduce nell’equilibrio tra forme amminiche e

imminiche o tra forme chetoniche ed enoliche. Le forme

termodinamicamente più stabili e più rappresentate sono le forme

amminiche e chetoniche. Cambiando la disposizione dei gruppi

coinvolti nelle interazioni a idrogeno viene ad essere alterata quella

è che la possibilità per le basi azotate in seno ad una molecola di DNA

di condurre le corrette interazioni di tipo W-C. Ciò porta, durante la

replicazione o la trascrizione, a una lettura scorretta dell’informazione contenuta sul filamento

polinucleotidico che sta per essere replicato o trascritto.

Due solchi: maggiore (M) e minore (m)

Il legame N-glicosidico in natura non è simmetrico ma si presenta inclinato e ciò comporta un’asimmetria

nella struttura del duplex di DNA e dalla quale dipende la coesistenza di un’alternanza tra solchi maggiori e

solchi minori. È possibile distinguere un margine del solco maggiore (angolo di congiunzione > 180°) da un

margine del solco minore (angolo di congiunzione < 180°); all’interno dei solchi maggiori e minori il DNA

espone le sue coppie di basi e queste sono accessibili al riconoscimento da parte di residui amminoacidici

contenuti nelle proteine (in particolare nei fattori di

trascrizione). Un fattore di trascrizione deve poter

riconoscere e discriminare solo una precisa sequenza,

deve avere la possibilità di legare il DNA a doppia elica

e deve poter discriminare tra le quattro possibili coppie

di basi (A-T, T-A, C-G, G-C). Ciò è possibile attraverso il

riconoscimento di gruppi chimici e atomi (accettori e

donatori di ponti a idrogeno, atomi di idrogeno e gruppi

metilici) dalle basi azotate, e il loro ordine, esposti nei

solchi maggiori e minori. I solchi maggiori hanno più

gruppi chimici e atomi esposti e questo è un vantaggio

decisivo nella discriminazione, da parte di un fattore di

trascrizione, delle coppie di basi. Infatti dalla presenza

e dall’ordine di determinati gruppi chimici e atomi

esposti nel solco maggiore è possibile distinguere le

14

diverse coppie di basi. Le proteine sono in grado di captare questa differenza poiché possiedono un

adattamento chimico con un meccanismo ad “incastro perfetto”. Se non c’è questo “incastro perfetto” il

riconoscimento non avviene. L’incastro perfetto si può avere solo se geometricamente e

tridimensionalmente i gruppi sono disposti in modo univoco. Se tutto ciò è valido per i solchi maggiori la

stessa operazione di discriminazione fine non avviene nei solchi minori (discriminazione limitata al 50% dei

casi). Ne consegue che la stragrande maggioranza delle proteine esercita la proprietà di riconoscimento e di

legame al DNA insediandosi a livello del solco maggiore (per via anche della maggiore accessibilità offerta dal

solco maggiore).

Conformazioni del DNA

Le conformazioni di DNA a doppia elica fino ad ora evidenziate sono almeno una dozzina. Tre di queste sono

ritenute essere presenti in natura: A-DNA, B-DNA e Z-DNA. La forma B (riportata al centro nell’immagine) è

quella originariamente descritta da James Dewey

Watson e Francis Crick ed è ritenuta essere

quella predominante nelle cellule. Essa è larga

23.7 Å e si estende per 34 Å ogni 10 bp. Questa

doppia elica compie un giro completo attorno

all'asse ogni 10.4-10.5 paia di basi. Questa

frequenza di rotazione, nota come passo

dell'elica dipende largamente dalle forze

di stacking che ogni base esercita su quelle

adiacenti. La conformazione del DNA può

dipendere dalla sequenza, dal

superavvolgimento, dalla presenza di

modificazioni chimiche delle basi o dalle

condizioni del solvente, come la concentrazione di ioni metallici. Di tali conformazioni, la conformazione B è

la più frequente nelle condizioni standard delle cellule. Le due conformazioni alternative sono differenti dal

punto di vista della geometria e delle dimensioni. La forma A (riportata a sinistra nell’immagine) è un'ampia

spirale destrorsa (il solco minore è largo ma poco profondo, quello maggiore è più stretto e profondo), con

un passo di 2,9 nm (circa 11 bp) ed un diametro di 2,5 nm. Tale conformazione è presente in condizioni non

fisiologiche, quando il DNA viene disidratato. In condizioni fisiologiche, questa conformazione caratterizza

gli eteroduplex di DNA e RNA e i complessi formati dalle associazioni DNA-proteina. La conformazione Z

(riportata a destra nell’immagine) è tipica invece delle sequenze che presentano modificazioni chimiche

come la metilazione, e dei tratti di DNA ricchi di basi C e G. Essa assume un andamento sinistrorso, opposto

rispetto alla conformazione B. Ha un passo di 4,6 nm ed un diametro di 1,8 nm, il solco maggiore più

superficiale e quello minore più stretto; deve il suo nome all'andamento a zig-zag che la caratterizza. Queste

strutture inusuali possono essere riconosciute da specifiche Z-DNA-binding proteins, con conseguenze

notevoli nella regolazione della trascrizione. Oltre ad A-, B- e Z-DNA, sono possibili anche altre conformazioni.

Sono state finora evidenziate C-DNA, D-DNA, E-DNA, H-DNA, L-DNA S-DNA e P-DNA. La proprietà di

polimorfismo (derivante dal fatto che il DNA all’interno di una cellula non esiste in una singola conformazione

ma assume in maniera dinamica tutte le varie conformazioni osservate e documentate) strutturale del DNA

dipende principalmente da due fattori: 15

 Angoli torsionali degli atomi dell’impalcatura zucchero-fosfato. Un angolo torsionale è costituito da

quattro atomi in sequenza legati da legami singoli (il legame singolo permette la rotazione degli atomi

attorno a sé stesso); l’angolo θ descrive la rotazione dei due legami che connettono A-B e C-D rispetto

al legame centrale che connette B-C; il valore complementare di θ è definito dall’angolo φ e

corrispondente all’angolo esistente tra le normali che giacciono sui piani (A-B-C e B-C-D) che

descrivono i tre atomi indicati. Se θ = 0° anche φ = 0° e tutti gli atomi giacciono sullo stesso piano, se

θ assume valori positivi c’è stata una rotazione in senso orario del legame C-D rispetto al legame A-

B mentre se θ assume valori negativi c’è stata

una rotazione in senso antiorario del legame C-

D rispetto al legame A-B. Osservando

l’immagine riportante un dinucleotide

(contenente A e C) si possono notare i diversi

angoli torsionali (scritti in bianco). Vi sono 5

possibilità torsionali teoriche per quanto

riguarda il 2-deossiribosio, 1 per quanto

riguarda il legame N-glicosidico e 6 per quanto

riguarda la restante impalcatura zucchero

fosfato. Una particolarità è che ν3 e δ risiedono

sullo stesso legame ma uno coinvolge il 2-

deossiribosio e l’altro la restante impalcatura

zucchero-fosfato.

o Puckering del furanosio. Sebbene sia rappresentato nei libri di testo

in forma planare il ribosio non esiste con questa struttura perché

termodinamicamente instabile e in quanto nella tridimensionalità

della molecola questa si assesta nelle tre dimensioni spaziali cercando

di ottimizzare le dimensioni e le cariche elettriche eventuali presenti

sui sostituenti che sono ai vertici della struttura pentagonale. Come

conseguenza la molecola circolare del ribosio deve necessariamente

incresparsi (puckering) per alloggiare al meglio questi sostituenti ed

evitare interazioni (collisioni steriche o repulsioni elettrostatiche).

Essendo “increspato” i vertici della molecola di ribosio non giacciono

sullo stesso piano e sfasano la forma planare. In base

all’orientamento dei atomi ai vertici esistono due possibilità:

 4 atomi giacciono sullo stesso piano e 1 atomo ha libertà di

movimento sopra o sotto il piano si genera un profilo di increspatura del

ribofuranosio ad “envelope” (a busta); l’envelope può essere “endo” nel caso in cui

l’atomo in questione si trovi nell’emispazio in cui si trova il legame N-glicosidico o

può essere “exo” nel caso in cui l’atomo in questione si trovi nell’emispazio opposto;

 Spostamento simultaneo, reciproco e opposto di 2 atomi (per una migliore

distribuzione dei sostituenti) si genera un profilo di increspatura del ribofuranosio a

“twist” che è possibile differenziare in “endo-exo” o “exo-endo” in base allo stesso

criterio citato pocanzi. Il profilo di increspatura a “twist” può essere simmetrico o

asimmetrico. 16

A fronte del fatto che il ribofuranosio possiede una

serie di possibilità torsionali nel DNA non sono tutte

rappresentate perché il 2-deossiribosio è intrappolato

fra due fronti: l’impalcatura zucchero-fosfato di cui è

parte integrante e la base azotata. Le possibilità

torsionali energeticamente e termodinamicamente

favorite e rappresentate nel DNA sono la C2’-endo

(caratteristica della struttura B del DNA) e la C3’-endo

(caratteristica della struttura A del DNA). Il fatto che il

C2’ si increspa in endo ha delle conseguenze

significative sull’organizzazione strutturale del resto

della molecola che quindi si deve riadattare al meglio.

In questo caso il riadattamento prevede la variazione della distanza tra i due gruppi fosfato da una

distanza di 6 Å a 7 Å (l’allontanamento dei gruppi fosfato carichi negativamente rende la struttura

nel suo complesso più stabile). Il C3’ increspato in endo non provoca una variazione sostanziale come

nel caso precedente infatti prevede una variazione tra i gruppi fosfato da 6 Å a 5,9 Å, e che può essere

artificialmente ulteriormente abbassata a 5,5 Å (distanza limite oltre la quale la struttura dell’intera

molecola di DNA si destabilizzerebbe a causa dell’intensità delle cariche negative portate dai gruppi

fosfato), che non sconvolge l’intera struttura. L’angolo

torsionale χ del legame N-glicosidico è un parametro

geometrico importante in quanto da esso deriva

l’orientamento della base azotata rispetto all’impalcatura

zucchero-fosfato. È possibile notare delle differenze

morfologiche causate dall’angolo torsionale χ rispetto alla

tipologia di base azotata presente. Nel caso delle purine χ

può assumere due tipologie conformazionali definite

“anti” (prevede l’allontanamento della purina dal ribosio)

e “syn” (prevede l’avvicinamento della purina al ribosio).

Solitamente una conformazione in anti di una purina si

accompagna ad una increspatura C2’ endo del

deossiribosio. Nel momento in cui però grazie alla libera

rotazione del legame N-glicosidico la purina assume una

conformazione syn la presenza dell’ingombro sterico,

generato dalla purina stessa e dal sostituente portato dal

C2’ endo, creerebbe una destabilizzazione e quindi questa situazione non esiste in natura non

essendo termodinamicamente favorita. La transizione da anti a syn della purina comporta una

concomitante riorganizzazione del profilo di increspature del 2-deossiribosio che passa da C2’ endo

a C3’ endo (la distanza dei gruppi fosfato varia da 7 Å a 5,9 Å). Le pirimidine possono assumere solo

ed esclusivamente una conformazione di tipo anti perché se la base azotata si trovasse in syn il

gruppo chetonico in posizione 2 dell’anello eterociclico andrebbe a collidere stericamente con

l’impalcatura zucchero-fosfato a livello del C5’.

 Parametri rotazionali e traslazionali delle basi azotate. Una singola base rispetto all’altra della stessa

coppia può subire movimenti rotazionali, una coppia di basi può subire movimenti rotazionali e

traslazionali e due coppie di basi adiacenti possono subire movimenti rotazionali e traslazionali. Tutto

ciò dipende dal fatto che l’impalcatura zucchero-fosfato ha una certa flessibilità e le coppie di basi

che sono innestate in essa rispondono ad eventuali modificazioni dell’impalcatura variando il loro

orientamento nei tre assi dimensionali. Per quanto riguarda la rotazione esistono varie possibilità:

o Rotazionali:

 Roll: Rotazione di due coppie di basi sovrapposte attorno all’asse Y.

 Tilt: Rotazione attorno all’asse corto X. Se Roll e Tilt sono molto diversi da zero, l’asse

locale Z si flette. Determinano la flessibilità assiale del DNA (DNA curvo).

17

 Twist: Rotazione di due coppie

di basi sovrapposte attorno

all’asse Z. Determina il grado di

avvolgimento delle due eliche

e quindi la periodicità (numero

di residui per giro d’elica).

 Propeller Twist (P.T.):

Rotazione di due basi di una

coppia in senso opposto

attorno all’asse Y.

o Traslazionali:

 Rise (Innalzamento Assiale):

Movimento lungo l’asse Z.

Determina la distanza tra due

coppie di basi sovrapposte e

quindi il Passo dell’elica (la

distanza tra due punti

equivalenti della doppia elica).

 Slide: Spostamento lungo l’asse Y

 Shift: Spostamento lungo l’asse corto X.

Il tilting delle coppie di basi, associato allo sliding, consente un innalzamento assiale (Dz) minore della

distanza di van der Waals (0,33 nm). La doppia elica di tipo A risulta così più corta e più spessa di

quella di tipo B. Il solco M è più profondo e meno ampio mentre il solco m è meno profondo e più

ampio.

I parametri geometrici dipendono dalle sequenze nucleotidiche e

differiscono per ogni coppia di basi.

 Forze di legame che stabilizzano la doppia elica.

o Ponti a idrogeno che intercorrono tra le basi azotate

dei due filamenti polinucleotidici. Esistendo 3 legami

a idrogeno in una coppia G-C o C-G per poter

interrompere queste interazioni è necessario fornire

un apporto energetico che deve essere superiore

rispetto a quello utile alla rottura dei due legami

idrogeno che si instaurano nelle coppie A-T e T-A.

Quindi una coppia C-G o G-C è più stabile di una

coppia A-T o T-A.

o Forze di impilamento (stacking).

 Forze di Van der Waals a carattere idrofobico

dalle quali dipende l’affinità che le coppie di

basi hanno a rimanere l’una impilata all’altra

piuttosto che essere esposte alla soluzione

acquosa. Le molecole d’acqua in soluzione

acquosa non sono libere di vagare dentro la

soluzione stessa ma tendono a formare un

reticolo di interazioni deboli (una struttura

ordinata). Interrompere questo reticolo di

interazioni tra le molecole d’acqua è una

situazione energeticamente sfavorita. L’esposizione delle superfici delle basi azotate

comporterebbe da una parte l’instaurazione di interazioni repulsive perché le basi

hanno carattere idrofobico e dall’altra la distribuzione in tutti gli spazi, eventuali,

liberi fra le coppie di basi di molecole d’acqua andrebbe a ledere quella che è la

18

struttura ordinata del reticolo. L’insieme di queste

due situazioni converge verso lo stesso fenomeno

che è l’impilamento delle coppie di basi.

 Interazioni elettrostatiche. La delocalizzazione degli

elettroni π, dovuta alla presenza di tutti quei doppi

legami che sono presenti nelle strutture

eterocicliche delle basi azotate, porta a una certa

esposizione di carica sulle coppie di basi derivante

dalle cariche parziali delle singole basi azotate.

Questa situazione è utile all’instaurazione delle

forze di stacking e anzi risulta

necessario compenetrare il più

possibile le affinità di cariche

elettrostatiche tra le coppie di basi. Lo

slide (positivo o negativo) riduce la

repulsione tra le cariche negative e

permette interazioni elettrostatiche.

Se lo slide è 0, le forze idrofobiche

sono maggiori della repulsione

elettrostatica.

DNA a tripla elica DNA contenente tratti di 20-30 unità di

ripetizioni di Pyr in un filamento e Pur

nell’altro, in cui si inserisce un terzo

filamento di poly-Pyr con la stessa sequenza

del primo, ma con polarità inversa. Si forma

a pH acido per denaturazione parziale del

duplex e ripiegamento del tratto di poly-Pyr

nel solco M del duplex rimanente. Il terzo

filamento si appaia con le Pur del duplex

formando dei legami di Hoogsteen (non

canonici) senza compromettere gli

appaiamenti convenzionali W-C. Originariamente descritta nel 1957, la tripla

elica è stata evidenziata in vivo solo durante l'azione

della ricombinasi di Escherichia coli RecA, ma il suo ruolo non è ancora stato

compreso. Numerosi laboratori di ricerca stanno investigando la possibilità

che le triple eliche di DNA possano costituire un meccanismo di regolazione dell'espressione genica.

DNA a quadrupla elica

Le sequenze di acidi nucleici ricche in guanina sono in

grado di formare strutture a quattro filamenti note

come G-quadruplex (o G-tetradi o G -DNA). Tali

4

strutture sono generate attraverso legami idrogeno tra

quattro guanine (che formano la cosiddetta tetrade), in

cui ogni G usa la faccia W-C per formare ponti a H con

la faccia Hoogsteen della G vicina, e stabilizzate

attraverso la presenza di un catione monovalente

(solitamente il potassio) che si dispone al centro della

tetrade stessa. Si forma in molecole a singolo o a doppio

filamento che presentano almeno 4 tratti contenenti

ciascuno almeno 3-4 Guanine consecutive. Può derivare dalla medesima molecola di DNA, da molecole di

DNA differenti e dall’associazione ibrida di filamenti di DNA e di RNA. È una struttura frequente nei telomeri.

19

Forcine e strutture cruciformi Il DNA è costituito da 4 basi

azotate per cui può capitare che

nell’ordine di rappresentatività

di queste basi azotate si abbiano

delle sequenze che sono

identiche e ripetute variamente

nella molecola di DNA. Quando

ciò accade si formano delle

ripetizioni dirette (5’-

GACT…GACT-3’). Talvolta si

possono riscontrare ripetizioni invertite (che possono essere perfette nel

caso in qui non vi sia una sequenza spaziatrice e vengono chiamate anche

sequenze palindromiche perfette). Se esistono palindromi o ripetizioni

invertite in un singolo filamento polinucleotidico indipendente (derivante

per esempio dalla denaturazione locale del DNA) queste possono dar

luogo a interazioni anticomplementari (intracatenarie) e quindi generare delle strutture non convenzionali

in cui si instaurano interazioni convenzionali (utilizzando l’interfaccia W-C). Strutture di questo tipo vengono

denominate forcine (formate da una base, dallo stelo che è la porzione localmente a doppia elica e da

un’ansa). È chiaro che anche l’altro filamento (essendo il DNA un duplex) ha le medesime potenzialità di

formare una forcina dato che la ripetizione invertita si ripercuote su entrambi i filamenti. Quindi in questo

caso si ha la coesistenza di due forcine (identiche in dimensioni) nella stessa molecola di DNA che

complessivamente formano una struttura cruciforme.

Caratteristiche delle principali forme di DNA A-DNA B-DNA Z-DNA

Senso di rotazione destrorso destrorso sinistrorso

Deossiribosio C3’-endo C2’-endo C3’-endo (Pur) C2’-endo (Pir)

Legame N-glicosidico anti High-anti Syn (Pur - G) anti (Pir – C)

Unità ripetuta 1 bp 1 bp 2 bp

Tilt 19° -1,2° -9°

Twist 33,6° 35,9° -60°

Propeller-twist 18° 16° 0°

Shift (Dx) -4,4 Å 0,6 Å 3,5 Å

Slide (Dy) -2 Å 0,4 Å 5 Å

Rise 2,25 Å 3,32 Å 3,8 Å

Ampiezza solco M 2,7 Å 11 Å

Profondità solco M 13,5 Å 8,5 Å

Ampiezza solco m 11 Å 5,7 Å 3 Å

Profondità solco m 2,8 Å 7,5 Å 8 Å

Passo dell’elica 24.6 Å 33.2 Å 45.6 Å

Periodicità 10.7 10.0 12

Diametro 25.5 Å 23.7 Å 18.4 Å

20

Topologia del DNA

La topologia o studio dei luoghi (dal greco τόπος, tópos, "luogo", e λόγος, lógos, "studio") è una delle più

importanti branche della matematica moderna. Si caratterizza come lo studio delle proprietà delle figure e

delle forme che non cambiano quando viene effettuata una deformazione senza "strappi", "sovrapposizioni"

o "incollature". Il concetto traslato alla biologia molecolare, in senso astratto, è quello della mancanza di

rottura di uno o di entrambi i filamenti polinucleotidici di DNA. I problemi topologici del DNA in vivo derivano

dal fatto che il DNA non è una molecola semplicemente esistente in forma lineare all’interno della cellula e

libera da qualsiasi altra interazione. Il DNA in vivo non ha estremità libere infatti esiste in forma circolare

covalentemente chiusa (dominante nei procarioti, nei mitocondri e nei virus) o lineare localmente ancorata

alla matrice nucleare formando delle anse (quindi dei domini topologici indipendenti) e quindi i cromosomi

eucariotici (formati ognuno da una singola molecola di DNA), nei quali varie porzioni di DNA si ancorano alla

matrice, possono essere considerati insiemi di domini topologici indipendenti. Il fatto che sia il DNA circolare

che il DNA eucariotico organizzato in anse non presentino estremità libere causa i problemi di ordine

topologico che la cellula deve risolvere. I problemi in questione derivano dal presupposto che tutti i processi

biologici che insistono sul DNA (replicazione, trascrizione, traduzione e

ricombinazione) necessitano di una locale, temporanea e più o meno estesa

denaturazione della molecola (separazione dei due filamenti polinucleotidici).

Quando questa situazione si verifica in una molecola di DNA lineare non ancorata

(non esistente nei sistemi biologici) non si crea nessun problema di ordine

topologico perché essendo tutte e quattro le estremità libere ci sarà uno

svolgimento dei due filamenti attorno all’ipotetico asse centrale e il processo

biologico può avviarsi, ipoteticamente, senza incontrare ostacoli. Ciò non si verifica

quando il DNA presenta estremità vincolate. Nel momento in cui la denaturazione

inizia (la figura a destra dell’immagine a fianco) proporzionalmente, nella porzione

rimanente della molecola, si incominciano a formare una serie di aggrovigliamenti

frutto dell’accumulo di energia torsionale e sono esattamente questi

aggrovigliamenti i problemi, e i limiti, topologici che devono essere risolti

all’interno di una cellula. Infatti gli aggrovigliamenti che si formano nella porzione

non ancora denaturata non consentono la sua denaturazione.

Avvolgimento e superavvolgimento

Avvolgimento - coil (twist) = grado di avvolgimento

delle due catene polinucleotidiche l’una sull’altra

attorno all’asse centrale.

Superavvolgimento - supercoil = numero di torsioni che

l’asse della molecola effettua su sé stesso. Può essere

di due tipi: positivo (destrogiro) e negativo (levogiro). È

possibile un’interconversione fra i due tipi di

superavvolgimenti (prevede il passaggio attraverso una

situazione intermedia in cui il DNA non contiene nessun

tipo di superavvolgimento e viene definito rilassato).

Per poter distinguere un supercoil è necessario

osservare il punto di incrocio delle due doppie eliche e verificare in che direzione punta l’elica visibile

all’osservatore (se punta in alto a destra è destrogira e se punta in alto a sinistra è levogira). Il

superavvolgimento può essere suddiviso in due tipologie differenti:

 superavvolgimento plectonemico o intrecciato che prevede un superavvolgimento della molecola

attorno ad un ipotetico asse longitudinale maggiore;

 superavvolgimento toroidale o solenoidale che prevede una spiralizzazione attorno ad un ipotetico

anello.

Il numero di legame o linking number (Lk) = parametro topologico per eccellenza di una molecola di DNA che

presenti un dominio topologico indipendente che deriva dalla somma di due parametri geometrici Twist (Tw

= numero di avvolgimenti) e Writhe (Wr = numero di superavvolgimenti) → Lk = Tw + Wr.

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