Appunti di Biologia dello Sviluppo

Biologia dello sviluppo: presentazione del corso

Obiettivo del corso: fornire le conoscenze di base inerenti alle fasi, ai processi e ai meccanismi che portano la cellula uovo fecondata, o zigote, a dividersi e ad attivare l’espressione di specifici geni per produrre un organismo pluricellulare composto da tipi cellulari diversi (derivanti dai 3 foglietti).

NB:

• Lo zigote si divide mitoticamente per dare origine a tutte le cellule dell’organismo.
• Da una cellula uovo fecondata organismo pluricellulare composto da diversi tipi cellulari (dai 3 foglietti).
• Le cellule germinali (ossia i precursori di uovo e spermatozoo) si differenziano precocemente durante lo sviluppo e non provengono da alcun foglietto embrionale.

Obiettivi del corso

Come si può passare da una cellula costituita da un unico nucleo ad un organismo pluricellulare costituito da cellule diverse?

Processi che verranno affrontati nel corso

• Differenziamento: quali sono i meccanismi che controllano il differenziamento cellulare e lo svilupparsi di un organismo pluricellulare complesso, funzionante e integrato con il suo ambiente, partendo da un’unica cellula.
• Morfogenesi: come possono le cellule dell’embrione migrare all’interno dell’organismo, organizzarsi in foglietti separati e costituire organi e tessuti distinti.
• Accrescimento: come viene regolata la crescita delle varie strutture dell’embrione e la proliferazione cellulare.
• Riproduzione: come vengono distinte le cellule germinali, necessarie alla continuità della vita, dalle altre cellule. Riproduzione a partire dal differenziamento delle cellule germinali rispetto alle somatiche.
• Evoluzione: modificazioni ereditarie che originano nuove forme.
• Integrazione ambientale: in che modo l’ambiente influenza lo sviluppo embrionale.

Il nodo centrale del corso è il differenziamento cellulare: tutte le cellule hanno lo stesso DNA, ma si differenziano in tipi cellulari completamente diversi attraverso una diversa espressione genica (diversa a seconda del tipo cellulare).

La biologia dello sviluppo è una scienza che chiamiamo scienza di sintesi, ossia una scienza che prende informazioni, risultati sperimentali e dati da tantissimi approcci sperimentali diversi riceve contributi da numerose discipline. In particolare esistono tre approcci sperimentali diversi:

1. Anatomico/morfologico: nato negli anni passati, data l’assenza delle moderne tecnologie, ma tutt’ora utilizzato e fondamentale. Consiste nella descrizione dei processi che avvengono durante l’embriogenesi.
2. Sperimentale: studia gli effetti prodotti dalle manipolazioni sugli embrioni (es. prendo un pezzettino di embrione e lo sposto in un altro embrione e vedo cosa succede oppure marco una cellula e vedo dove va a finire man mano che si procede nello sviluppo ecc.) e come l’ambiente esterno influenza lo sviluppo dell’embrione.
3. Genetico: studia il controllo esercitato dai geni sullo sviluppo dell’embrione. Vengono isolati geni che lo modificano. Studia i processi biologici a livello dei meccanismi molecolari (silenziamento/attivazione geni). In pratica prendo un gene, lo silenzio o lo attivo, e vado a vedere che cosa cambia durante lo sviluppo, capisco dunque che cosa succede in seguito alla mancanza o presenza di un determinato gene. Questo approccio oggi viene utilizzato partendo dallo studio di un determinato gene: si fanno ipotesi sul suo funzionamento all’interno dello sviluppo, dopodiché si va a silenziare questo gene specifico attraverso le tecniche di mutagenesi mirata.

Fasi dello sviluppo embrionale

I primi eventi successivi alla fecondazione della cellula uovo sono più o meno gli stessi per tutti gli animali. Processi: segmentazione, gastrulazione, organogenesi, metamorfosi (in alcuni casi).

Possiamo classificare ogni fase diversa con dei nomi (es. stadio a 16 cellule eccetera) oppure con un orario (es. 2hr e 44min corrisponde allo stadio 16-cell) quest’ultimo però dipende moltissimo dalla temperatura alla quale teniamo i nostri embrioni, per cui è sempre meglio parlare di fasi utilizzando il nome dello stadio (2-cell, 4-cell e così via).

Embriogenesi: stadi di sviluppo compresi tra la fecondazione e la nascita (o la schiusa).

1. Fecondazione: fusione delle cellule sessuali mature (gameti: uovo e spermatozoo). Ogni gamete ha metà del numero di cromosomi della specie. La fusione dei nuclei dei gameti conferisce all’embrione il suo genoma (= corredo di geni che consente di svilupparsi “come” i suoi genitori). Vedremo due modelli: riccio di mare (fecondazione esterna) e mammiferi (fecondazione interna).
2. Segmentazione: serie di divisioni mitotiche rapide che seguono immediatamente la fecondazione. È una fase di attiva proliferazione cellulare. L'enorme massa del citoplasma dello zigote viene suddiviso in cellule di dimensioni inferiori (blastomeri) che alla fine della segmentazione formano una struttura sferica detta blastula. Le cellule alla fine del processo di segmentazione sono tutte uguali. Ciclo cellulare: fasi G1, S, G2, M, ma nella prima fase del processo di segmentazione il ciclo cellulare è diviso solo in fase S e M (G1 e G2 non ci sono). Nella fase G1 vengono prodotti gli istoni, ma la fase G1 qui non c’è perché la madre ha già messo questi all’interno del citoplasma (proteine, enzimi necessari). La cellula figlia si divide velocemente. Il nucleo non è ancora attivo a livello trascrizionale. In un punto si ha lo switch ad utilizzo di trascritti della madre a quello del figlio (switch diverso tra le specie).
3. Gastrulazione: durante il processo di gastrulazione le cellule (blastomeri) vanno incontro a movimenti con i quali modificano le loro reciproche posizioni (movimenti morfogenetici). Al termine l'embrione prende il nome di gastrula. Alla fine della gastrulazione l'embrione è costituito da tre foglietti embrionali: ectoderma, mesoderma ed endoderma (dovranno poi interagire tra loro per dare gli organi). Le cellule cominciano a muoversi, spostarsi per dare i tessuti. Le cellule non sono tutte uguali: movimenti morfogenetici + cambiamenti di forma. Cellule attive a livello trascrizionale, quindi i geni espressi dalle cellule saranno diversi.
4. Organogenesi: i diversi tipi cellulari completano i loro processi differenziativi e si organizzano per formare tessuti ed organi. Nei vertebrati la neurulazione è il primo evento di organogenesi e porta alla formazione del tubo neurale, che darà origine al cervello e dal midollo spinale.
5. Metamorfosi: fase del ciclo vitale di animali a sviluppo indiretto, corrispondente al passaggio da uno stadio giovanile o larva (sessualmente immaturo) allo stadio adulto (sessualmente maturo). Molto controllata da ormoni veri e propri (circolano all’interno di un organismo ben formato). Richiede una trasformazione radicale nell’anatomia dell’organismo e spesso anche di ambiente e modo di vita. Lo sviluppo indiretto interessa sia molte specie di invertebrati (insetti, crostacei, echinodermi) che alcune specie di vertebrati (anfibi, pesci).
6. Rigenerazione: riattivazione dello sviluppo durante la vita post-embrionale che permette ad alcuni organismi di ricostruire strutture perse. Processo limitato ad alcuni organismi. Come viene determinato il sesso a livello di organismo.

Determinazione del sesso

Embriologia medica e sostanze teratogeniche:

1. Anomalie dovute a cause genetiche sono dette malformazioni (es. recettore kit che porta alla assenza di melanociti in alcune parti del corpo). Cause genetiche possono essere: mutazioni geniche, aneuploidie, traslocazioni cromosomiche. Spesso le malformazioni si presentano come sindromi nelle quali sono contemporaneamente presenti diverse anomalie.
2. Anomalie dovute ad agenti esogeni sono dette disordini dello sviluppo (agenti come mancanza degli arti sia superiori che inferiori o orecchio dovute a molecole utilizzate per la cura del mal di testa e mal di pancia delle donne incinta che ha provocato questi disordini). Agenti esogeni possono essere: sostanze chimiche, virus, radiazioni, ipertermia = teratogeni. Es: molecola Talidomide proposta alle donne in gravidanza negli anni 50 si scoprì incidere in maniera fortissima nello sviluppo del feto (mancanza degli arti, disordini dello sviluppo degli arti ecc.). Vedremo come questa molecola possa interferire con lo sviluppo dell’arto e discuteremo sull’uso o non uso di organismi modello per la ricerca.

Cenni storici

• Aristotele: Il primo studio di anatomia comparata dello sviluppo risale ad Aristotele (350 a.C.). Egli descrisse per primo (attraverso approccio visivo e morfologico) lo sviluppo embrionale di un pulcino. Lo sviluppo embrionale degli uccelli si può osservare in maniera semplice prendendo le uova e creando una piccola finestra sul guscio dell’uovo in modo da poter osservare in maniera agevole come procede lo sviluppo. È anche molto facile fare operazioni chirurgiche sullo stesso. Una serie di immagini furono create per descrivere lo sviluppo embrionale di pulcino, da Malpighi (1672) fino ad arrivare ai giorni nostri dove vengono utilizzate molecole fluorescenti visibili tramite microscopio a fluorescenza.
• Aristotele inoltre distinse le differenti strategie di riproduzione degli animali: oviparità, viviparità, ovoviviparità, ma soprattutto propose l’idea di epigenesi: la forma e la struttura degli embrioni emergono gradualmente con il procedere dello sviluppo. Da una struttura molto semplice ad una molto più complessa. Parto da cellula uovo fecondata e ho costruzione progressiva dell’organismo da cui emergono via via le varie strutture. Questa sua ipotesi contrastava con la teoria del preformismo.

Dunque nel 17° e 18° secolo vi erano due teorie che si opponevano l’una all’altra:

• Epigenesi: teoria sostenuta da Aristotele, Harvey, Wolff secondo la quale gli organi dell’embrione si formano de novo ad ogni generazione secondo un processo multifasico che utilizza il materiale da costruzione contenuto nell’uovo (la complessità aumenta progressivamente). Non si parte però da uno stato disorganizzato: lo zigote è organizzato sia a livello cellulare che molecolare.
• Preformismo: gli embrioni sono presenti in miniatura già nelle cellule germinali (solitamente veniva indicato il gamete maschile) e diventano via via più grandi con lo sviluppo (teoria sostenuta tra gli altri da Malpighi). Le informazioni per lo sviluppo sono presenti - preformate - nello zigote. Disegno proposto nel 1695 mostrava un homunculus all’interno dello spermatozoo. Tutta la progenie dovrebbe assomigliare al padre. Dal 1800: primi veri studiosi che hanno aiuto del microscopio = 3 ricercatori tedeschi:

• Christian Pander (1820) afferma che tutti i Vertebrati hanno un modello di sviluppo comune che prevede la formazione di tre strati o foglietti (che identifica): ectoderma, endoderma e mesoderma. La novità proposta da Pander è che i foglietti embrionali si influenzano a vicenda, egli dunque parla già del processo induttivo di comunicazione tra le cellule che fanno parte dello stesso embrione (concetto importante). Non possiamo parlare di sistema ormonale perché non c’è un sistema circolatorio e quindi non c’è sangue tramite cui gli ormoni vengono veicolati, ma dobbiamo parlare di molecole rilasciate che portano informazioni alle cellule vicine oppure di comunicazione cellula-cellula tramite contatto.
• Heinrich Rathke studia l’evoluzione degli archi faringei del capo dei vertebrati e mette in evidenza come dalle stesse strutture a livello embrionale si possa arrivare a strutture molto diverse nelle forme definitive dei crani.
• Von Baer (1828) identifica la notocorda (e la cellula uovo nei mammiferi che era soltanto stata ipotizzata). Parla di stadio filotipico. Baer afferma che il nostro sviluppo non può essere rappresentato con collo rovesciato. Egli mette in evidenza come le prime fasi dello sviluppo dei Vertebrati siano completamente diverse nelle diverse classi (e questo è dovuto come sappiamo dalla diversa quantità di tuorlo delle uova, quindi da diverse richieste nutrizionali ed ecologiche dell’organismo), ma che ad un certo punto si arrivi allo stadio filotipico nel quale tutti gli embrioni di vertebrati sono molto simili e facilmente scambiabili.

In questo stadio di sviluppo l’embrione, costituito dai tre foglietti embrionali, possiede una testa riconoscibile, un tubo neurale, archi branchiali e somiti. Solo più tardi emergono caratteristiche specifiche della classe, dell’ordine ed infine della specie. Con il progredire dello sviluppo, divergono sempre più sviluppando le strutture tipiche della specie. La rappresentazione migliore è quindi quella “a clessidra”, in cui partiamo da prime fasi molto diverse per arrivare allo stadio filotipico nel punto di strozzatura della clessidra e proseguire poi con una ulteriore divergenza col progredire dello sviluppo.

Dal punto di vista molecolare nello stadio filotipico vengono espressi i geni più antichi, comuni a tutte le classi fase filotipica: gli organismi si somigliano non solo dal punto di vista morfologico, ma anche dei geni che vengono espressi (nelle fasi seguenti invece vengono espressi geni differenti).

Le mappe presuntive

Obiettivo: cercare di capire a partire dall’embrione precoce (unica cellula in cui non è ancora iniziata la gastrulazione) quali regioni andassero a costituire nel futuro una parte specifica del nostro organismo. I ricercatori hanno cercato di costruire le mappe presuntive, le quali illustrano il destino delle singole cellule in sviluppo. Identificano la struttura larvale o adulta nella regione dell’embrione dalla quale tale struttura deriverà.

Tracciare linee di discendenza cellulare: seguire singole cellule (o gruppi di cellule) per osservare che cosa diventano costruire una mappa presuntiva. Le mappe presuntive forniscono informazioni su quali aree dell’embrione diventeranno, in condizioni normali, specifiche strutture adulte o larvali.

Blastula costituita da molte cellule, ogni cellula ha un suo proprio destino, andrà a sviluppare una struttura particolare. Mappe presuntive = mappa dell’embrione in cui i diversi colori vanno a illustrare il destino delle cellule dell’embrione precoce in quella posizione.

• Es. Rosa = ectoderma nervoso → tubo neurale, cervello

Nonostante i vari animali siano diversi allo stato adulto, le loro mappe presuntive mostrano molte somiglianze: nell’emisfero animale si ha sempre ectoderma (azzurro), nella parte intermedia il mesoderma (rosso) e infine l’endoderma (giallo).

Modi di mappatura presuntiva

1. Osservazione diretta di embrioni viventi: Mappa presuntiva dell’embrione del tunicato Styela partita, Conklin. I pigmenti naturali posseduti dall’uovo possono funzionare da marcatori. Permettono di seguire i movimenti e il destino delle cellule, che derivano da specifici blastomeri. L’ovocita ancora da fecondare (di questa specie) ha un colore arancione molto uniforme in tutta la struttura, ma subito dopo fecondazione si ha il movimento del citoplasma che porta una parte di questo (parte arancio scuro) a localizzarsi prima nella regione in basso e poi quando cominciano le divisioni a disporsi sempre in posizione ventrale e in seguito caudale → le cellule che contengono questo materiale citoplasmatico sono destinate a diventare le cellule della muscolatura della coda della larva. Asportando queste cellule che contengono il citoplasma scuro (mioplasma), l’embrione che si sviluppa e in seguito la larva sarà priva della muscolatura della coda. (in questo momento non si riescono a marcare le altre cellule e quindi non si possono conoscere i destini delle altre cellule: quella del mioplasma è una pigmentazione naturale).
2. Mappa presuntiva mediante coloranti vitali: Nel 1929 Vogt si inventa un sistema per decifrare il destino di alcune cellule: marcature sperimentali con coloranti vitali. Prende dei frammenti di agar (matrice porosa che assorbe anche i coloranti), li colora in maniera diversa e li “appiccica” all’embrione precoce in modo che il colorante passasse dall’agar alle cellule con cui veniva in contatto. Il colorante diffonde in alcune cellule dell’embrione e quindi questo non avrà più il colore naturale ma artificiale, che rimane per un po’ e man mano che le cellule si dividono l’intensità del colore è sempre più lieve, perché diffonde anche nelle nuove cellule → marcando le cellule si possono osservare alcune zone; il colorante, però, poi si distribuisce in cellule diverse. Segue il movimento delle cellule colorate e arriva a determinare il destino di specifiche cellule. Sistema artificioso, molto lungo da fare e che dà risultati molto limitati nel tempo: problema del metodo = progressiva diluizione del colorante ad ogni divisione cellulare.
3. Mappa presuntiva mediante tracciante fluorescente: Nel 1966 Rosenquist utilizza dei traccianti fluorescenti che inietta direttamente all’interno delle cellule. Questi possono essere visti con il microscopio a fluorescenza, che ha un’alta sensibilità al colorante e quindi può individuarli per un tempo più lungo rispetto al metodo visto in precedenza. I colori comunque pian piano si diluiscono col passare del tempo. Vantaggio rispetto al precedente: la molecola fluorescente permane visibile anche dopo molte divisioni cellulari, alcune cose vengono viste più a lungo. È comunque molto limitato nel tempo.
4. Mappa presuntiva mediante marcatura genetica: Metodo per marcare in modo permanente le cellule e seguirne il destino. Embrioni chimera: costruiti da tessuti provenienti da più di un’origine genetica si identifica quali strutture provengono dal tessuto del donatore e quali da quello dell’ospite. Nel 1969 Le Douarin prende gli embrioni di due specie animali molto vicine (la quaglia e il pollo), i quali hanno sviluppo molto simile, e trapianta un pezzettino di embrione di quaglia (embrione donatore) in un embrione di pulcino (embrione ricevente) costruzione di embrioni “chimera”, nei quali le cellule donatrici possono essere facilmente riconosciute grazie alla differenza genetica e morfologica.