Biologia Cellulare - appunti

SI UTILIZZNO I COLORANTI :

con il trypan blu : se la cellula si colora vuol dire che è entrato e quindi la membranan e la vitalità è

danneggiata, percio le cellule colorate non sono vitali. Il test non deve essere effettuato un liquido

contenente siero perché senno tutte le proteine legherebbero il trypan blu. È un test che deve essere

effettuato rapidamente perche avendo alta permeabilità di membrana le cellule in 10 minuti

assorbono il trypan blu.

Oppure con fluoresceina diacetato : in cellule con membrana plasmatica integra entra perche è

permeabile a questa ma non puo uscire perché viene idrolizzato a fluoresceina a cui la mambrana è

impermeabile , e se eccitata a 490 nanometri emette una fluorescenza a 525 nanometri (verde) . lo

ioduro di propilio invece nelle cellule vive non entra ma solo in quelle danneggiate che si colorano

di rosso perché entra e si lega al DNA mentre in cellule vive che nn hanno membrana danneggiata

non entra proprio.e anche se si produce fluoresceina questa non resta nella membrana perché

potrebbe essere danneggiata la sua permeabilità e quindi esce.

Citotossicità 3 saggi

Vitalita: valutano risposta di breve durata sulla perbeabilità di membrana: se una sostanza è tossica

per una coltura celulare possiamo valutarne la tossicità con i test di esclusione di coloranti

sullapermeabilità di membrana

Saggi di sopravvivenza: capacità replicativa a lungo termine: con le curve di crescita che vlutano le

variazioni di crescita in una popolazione. Se una sostanza è tossica la curva viene alterata

significativamente. Si conteggiano il numero di cellule per la curva o valutare variazioni della

massa cellulare.

Saggi metabolici.

MTT : test colorimetrico metabolico basato sul reattivo MTT giallo e solubile in acqua, e viene

ridotto da idrogenasi mitocondriali a formazano in cristalli color porpora . solo le cellule vitali con

mitocondri attivi lo trasformano perché l’attivitò deli enzimi mitocondriali sono le prime cose che

perdono le cellule se danneggiate. Le cellule pi vengono lisate e il prodotto solubilizzato viene

quantificato con il fotometro.

MTT è fotosensibile e percio bisogna schermare la coltura per evitare che la luce degradi l’MTT. La

soluzione di MTT deve essere rimossa e le cellula lavate con soluzione salina prima di essere liste.

Le cellule con maggior assorbanza ( di controllo) sono cellule più colorate e non sono trattate con

sostanza tossica.

Il dimetilsolfossico è una molecola incolore e un assorbente eccellente che penetra molte sostanze

anche i guanti di gomma quindi biogna maneggiarla con cura perche qualsiasi sostanza tossica puo

essere veicolata all’interno dell’epidermide. Si usa per la lisi cellulare dopo il formazano

Proliferazione cellulare:

1- Scopo quante sono le cellule in proliferazione rispetto a quelle totali. Division index : si

rivela la presenza di proteine specifiche che sono marker di cellule in crescita.

Ki67 : identifica quante cellule sono in proliferazione : è coinvolta nella trascrizione del

RNA

2- ribisomiale, tutte le cellule che la esprimono sono proliferanti, nelle cellule quiescenti non

c’è

PCNA : nelle fasi G1e S e non è espressa nelle cellule senescenti e quiescenti. A un

espressione piu ridotta ( solo nelle due fasi ) ma è un marker buono perche le cellule passano

la maggior parte del ciclo in queste due fasi. È un aproteina necessaria per la sinteis del

DNA.

3- Cicline : l espressione di onun delle proteine è limitata in ciascuna delle fasi cellulari

Immunochimica : utilizzo anticorpi specifici applicabile sia a colture cellulari che a preparati

istologici. Consente l’identificazione della preseza della proteina di interesse e permette di

localizzare la proteina nel preparato. Si usano due sistemi di rivelazione che permettono di capire

se e presente il complesso antigene- anticorpo:

- fluororofori collegati ad anticorpi. I fluorofori sono molecole che se colpite da una

radiazione ono eccitate a uno stato energetico superiore di poca durata perché lenergia

viene perse per dissipazine emettendo una radiazione luminosa quando ritorna allo stato

normale ma emette una minore energia rispetto a quando è eccitato perché avra perso per

dissipazione l’energia.

- Enzimi legati ad anticorpi : l’enzima trasforma la soluzione in complesso colorato

Puo essere collegato all’anticorpo primario, o all’anticorpo secondario che riconosce quello

primario che lega l’antigene. Quindi si distingue un metodo diretto e un metodo indiretto.

LEZIONE 27/03/2017

STUDIO DELLA PROLIFERAZIONE

Con l’ utilizzo di analoghi della timina ( bromodeossiuridina e timidina). non si marcano le cellule

in proliferazione cellulare ma solo quelle in fase S.

Bromodeossiuridina : è incorporata nelle cellule in proliferazione in fase S. e possiamo contarle

utlizzando un anticorpo specifico (marcato con cluorofori o legati ad enzimi) per bromodeoss.

Marcandole.

Es con il saggio ELISA.

Un altro metodo è con la timidina triziata, le cellule che la incorporano sono in fase S ( sintesi

neofiamenti di DNA). Si sfrutta la proprietà del trizio che è isotopo radioattivo, andando a calcolare

la quantità di radioattività che ci diranno la quantità di timidina incorporata.

La radioatt è l’emissione spontanea di particelle o particelle elettromagnetiche da un nucleo

all’altro. Alcuni isotopi hanno una struttura del nucleo instabile tale che sono in grado di emettere

radiazioni di particelle e trasformarsi in un altro elemento con numero atomico differente, e sono

detti radioisotopi.

I diversi tipi di decadimenti possibili sono l’emissione di particelle alfa beta o gamma

Alfa : emissioni corpuscolate costituite da 2 protoni e 2 neutroni e corrispondono a un nucleo di

elio, e hanno una carica + 2. Il decadimento con queste emissione riguardano atomi con numero

atomico piu grande. L’emissione di una particella alfa dara origine a un elemento differente con

numero atomico -2 e massa – 4. Le particella alfa hanno una massa rilevante e vengono fermate

dalla pelle dell’operatore quindi non danno problemi a meno che non vengano ingerite o inalate. Il

tempo di dimezzamento è il tempo necess affinche la metà di isotopi …

Beta: particelle corpuscolate simile ad un elettrone celoce emesso dal nucleo drante un

decadimento. I neutroni si trasformano in protoni e elettroni . il trizio a seguito di decadimento beta

si trasforma in atomo di elio e ha tempo di dimezzamento di 12,5 anni. Vienen maggiorm utilizz

perche meno tossico del carbonio, ma ha meno energia e ha un percorso medio minore. Per il trizio

basta utilizzare guanti protettivi e camici, mentre per il fosforo o carbonio bisogna lavorare dietro

schermi di plexiglass.

Gamma: radiazioni prive di massa, elettromagnetiche ad alta energia con lunghezza d onda bassa,

vengono emesse da un nucleo mentre passa da uno stato eccitato a un normale. Un nucleo dopo le

radiazioni alfa o beta essendo ancora eccitato emette un elettrone per tornare allo stato normale.

Essendo prive di massa hanno potere di penetrazione maggiore rispetto le altre e per schermarsi da

queste che sono pericolose perche hanno elevata energia è necessario uno schermo di piombo o

cemento abbastanza spessi.

Le radiazioni che ci interessano pero sono le emissioni beta di cui il trizio è un esponente.

Ci sono due metodi per valutare la proliferazine cellulare con il trizio :

1. Solo in vitro con cellule in coltura.

Incubazione con timidina triziata in tempi brevi circa 1 ora. Si allungano i tempi fino a 24

ore nel caso si voglia valutare la sintesi di DNA, questo viene effettuato quando la velocità

di sintesi di DNA è bassa. Si va a valutare la radioattività del DNA in seguito a lisi cellulare.

Quello che viene conteggiato sono i colpi per minut : numero di decadimenti in elio che lo

strumento registra, e non devono essere confusi con le disgregazioni per minuti che sono il

numero di decadimenti che avvengono effettivamente nella soluzione cellulare, ovviamente

a noi interessano i decadimenti per minuto e dai colpi per minuto si possono calcorare i

decadimenti, perche ogni macchina ha un efficienza , e considerando questa con i colpi per

minuto la macchina è in grado di calcolare il decadimetno per minuto. A seguito del

trattamanto noi possiamo calcolare se la quantità di radioattività è maggiore rispetto a quella

di controllo, non si riesce a valutare precisamente quante cellule siano in fase S per questo è

stato sviluppato un altro metodo:

2. Marcatura con tripsina triziata in vivo e in vitro : sempre basato sull incorpor di timidina

triziata. Con questo metodo è possibile calcolare la quantità di cellule marcate cioè di cellule

in fase S, perche questo metodo non porta a lisi cellulare, ma conta il numero di cellule

marcate sul numero di cellule totali, che rappresenta l’indice di marcatura. Nel metodo

precedente per la conta della radioattività si utilizzava la lisi in questo caso si utilizza la

mitoautoradiografia perché la fonte che impressiona la lastra è all’interno del campione

stesso essendo rappresentata dagli stessi atomi radioattivi incorporati dalle cellule in fase S,

ma puo essere visualizzato solo in microscopio, per cui si sfrutta il decadimento di tipo beta

del trizio per impressionare una lastra fotografica. Utilizzando il processo fotografico

questa tecnica richiede una camera oscura con un illuminazione di una lampada a luce rossa.

Si parte da cellule in coltura , chamber slides, o partire da sezioni di tessuto di animali in cui

il tracciante radioattivo è stato precedentemente incorporato. Le cellule devono essere fissate

e il vetrino con il tessuto o le cellule vengono immesse in camera oscura in un emulsione di

gelatina in cui sono dispersi cristalli bromuro di argento, argento e zolfo. Nel punto in cui è

presente una cellula con timidina triziata il trizio decade emettendo elettrone che portano

alla riduzione di argento in argento metallico che si deposita nel punto in cui è avvenuta

l’emissione. La soluzione di fissaggio rimuove gli ioni argento che non sono decaduti con

l’emissione, cosi granellini di argento metallico si depositano sul nucleo e al microscopio si

possono contare i nuclei delle cellule.

Se la radioatt è distesa anche al citoplasma allora le cellule sono infette da microplasmi.

CRIOCONSERVAZIONE :

è un congelamento di cellule in coltura a bassisime temperature in moto tale che le attività

metaboliche siano azzerare, quiescenza, cosi possiamo avere stok di cellule che mantengono altrato

il patrimonio genetico e le cratt feotipice.

I vantaggi : la conservazione di una parte delle cellule ci consente di mantenerle stabili e

mantenere uno stok originar