Biologia Cellulare - appunti

Biologia cellulare anno 2016/2017

Prima parte: Professoressa Bernacchioni

Lezione 02/03

Si definisce “coltura cellulare” la crescita di cellule isolate dal tessuto di partenza. Collezioni di linee cellulari: strutture specializzate nella conservazione e propagazione di cellule su larga scala. Disponibilità di linee cellulari stabilizzate provenienti da diverse specie le cui caratteristiche genetiche, morfologiche e di crescita sono ben note:

• ATCC - American Type Culture Collection - Mariland, USA
• ECACC - European Collection of Animal Cell Culture - UK, EN

Le informazioni inerenti tali linee cellulari sono raccolte in un database e coordinate dalla WFCC - World Federation for Culture Collections. L’opera di coordinamento di questa commissione consiste nella raccolta e nella distribuzione dei dati relativi a circa 500 linee cellulari distribuite in 55 paesi e nella descrizione delle loro caratteristiche. Le cellule conservate nelle banche internazionali sono di facile acquisizione e prive di contaminanti; sono inoltre accompagnate da un certificato di garanzia che informa su: tipo di cellula, origine, terreno di coltura da utilizzare per crescita e congelamento, caratteristiche di crescita, morfologia, numero di passaggi in coltura e cariotipo.

Vantaggi delle colture cellulari

• Controllo delle caratteristiche fisico-chimiche dell’ambiente (pH, temperatura, pressione osmotica, composizione del terreno di coltura, tensione di O₂ e CO₂)
• Omogeneità del campione
• Possibilità di analisi effetti tossici su cellule umane (correlazione con modelli animali-validazione dei modelli animali)
• Riduzione del numero di animali uccisi per la sperimentazione
• Abbattimento dei costi – risultati in tempi brevi
• Utilizzo di piccole quantità di sostanze da saggiare - cellule a contatto diretto con sostanze nel mezzo di coltura, non soggette a variabili farmacocinetiche

Limiti delle colture cellulari

• Expertise dell’operatore (sterilità assoluta)
• De-differenziamento e selezione
• Origine delle cellule-autenticazione
• Instabilità genetica
• Differenze da cellule in vivo: perdita dell’architettura tridimensionale del tessuto.
• Perdita delle specifiche interazioni cellulari caratteristiche dell’istologia del tessuto.
• Mancanza di regolazione omeostatica sistemica (sistema nervoso e sistema endocrino).
• Acquisizione di motilità. Crescita della frazione di cellule in proliferazione attiva.
• Mancanza di carrier dell’ossigeno (Hb) (metabolismo principalmente glicolitico).
• Difficoltà di correlare le concentrazioni e le condizioni di esposizione alle sostanze nelle colture in vitro rispetto alla situazione in vivo.

Le tecniche di coltura cellulare implicano l’isolamento e il mantenimento in vitro di cellule costituenti di tessuti od organi (di origine animale, vegetale o batterica).

Metodi per “iniziare” una coltura

Coltura d’organo: è mantenuta, almeno parzialmente, l’architettura tridimensionale del tessuto in vivo. Utilizzate principalmente per:

• Studi di morfologia, differenziamento embrionale e fisiologia.
• Studio dell’effetto di sostanze (es ormoni) sulla funzionalità dell’organo

Le cellule non crescono rapidamente e la proliferazione è limitata e confinata alla periferia dell’espianto.

Coltura cellulare primaria: coltura generata isolando direttamente le cellule dai tessuti dell’organismo modello. La proliferazione rende possibile la propagazione tramite l’allestimento di sottocolture (passaggio) e ottenere linee cellulari.

Colture adesione dipendenti: le cellule aderiscono al supporto (substrato) e si propagano (Ancoraggio dipendenza). L’adesione al substrato è un prerequisito per la sopravvivenza e la proliferazione.

Colture in sospensione o adesione indipendenti: le cellule sono disperse omogeneamente nel liquido di coltura, crescono in vitro in un mezzo fluido e possono proliferare rimanendo in sospensione senza aderire ad una superficie.

Lezione 06/03

Metodi per una coltura cellulare

Nel caso si voglia operare una coltura d'organo si va principalmente a cercare di ottenere quella che viene definita una coltura cellulare primaria, questa riflette al meglio le attività metaboliche delle cellule di origine. L'allestimento di essa prevede diversi passaggi: la rimozione del tessuto in maniera asettica, l'immediato lavaggio e trasferimento in una soluzione salina bilanciata, lo sminuzzamento e l'inoculazione in coltura. Per allestire queste colture di cellule primarie si seguono diverse linee come ad esempio:

• Tecnica dell'espianto primario: si sminuzza molto finemente il tessuto e tali frammenti sono poi impiastrati. In tali piastre va un terreno specifico a base di siero ad alta concentrazione che favorisce la crescita e la migrazione. Dopo il trasferimento le cellule migreranno dall'espianto e prolifereranno aderendo al substrato. Prevede un tempo abbastanza lungo e si privilegia per piccoli campioni. Le cellule che migrano sono ad esempio cellule epiteliali, embrionali, fibroblasti, ecc.
• Tecnica di disgregazione enzimatica: è una tecnica da sospensione cellulare, si tende a sminuzzare il tessuto con diversi enzimi anche combinati fra loro, migliorando la resa finale. Uno di questi enzimi è la tripsina, una proteina che taglia il legame peptidico a livello del gruppo carbossilico fra aminoacidi basici, ha un pH d'azione molto acido, vengono usati anche altri enzimi alternativi in quanto la tripsina ha una certa aggressività. Questi possono essere: collagenasi, dispasi, neuroaminidasi, DNA-asi e agenti chelanti di cationi bivalenti (Ca²⁺) come EDTA e EGTA, utilizzati in quantità di poche mM. L'uso della tripsina ha una resa maggiore rispetto alla tecnica dell'espianto primario e anche questa tecnica crea cellule resistenti alle sostanze utilizzate. Un tessuto embrionale è più facilmente disgregabile rispetto ad un tessuto adulto in cui il compartimento differenziato è più abbondante di quello proliferativo ed essendo inoltre più fibroso richiede tempi più lunghi. La tripsina inoltre è neutralizzata dal siero stesso presente nel terreno. Per la tripsinizzazione esistono due tecniche: la tripsinizzazione a caldo, usando la temperatura ottimale per l'enzima ovvero 37°C, durante la quale le cellule ottenute vanno tolte dal terreno ogni 30 min, è preferibile utilizzare questo metodo per campioni abbondanti ed è sconsigliato per i tessuti adulti. La tripsinizzazione a freddo invece prevede che il tessuto sia a contatto con l'enzima a 4°C per circa 6-18 h, questo consente all'enzima di diffondersi primo dell'attività catalitica, dopodiché ci si sposta ad una temperatura di 37°C così che l'enzima già diffusosi attivi ottenendo un'efficacia maggiore.
• Tecnica di disgregazione meccanica: è una tecnica utilizzata per superare le problematiche dell'espianto. Avviene mediante l'utilizzo di maglie fini o aghi a calibro crescente attraverso i quali viene fatto passare forzatamente il tessuto, distruggendone l'integrità. A causa del danno meccanico che questo comporta diminuisce però anche la vitalità cellulare.

Il siero fetale bovino, spesso indicato con la sigla FBS (o FCS, dall'inglese fetal calf serum, siero fetale di vitello) è un liquido costituito dalla frazione del plasma sanguigno che rimane dopo la coagulazione del sangue e quindi della conversione di fibrinogeno in fibrina. Il siero fetale bovino è un prodotto secondario dell'industria della carne, ottenuto dal sangue che viene raccolto dal feto di bovine gravide durante il processo di macellazione tramite un sistema chiuso di collettori che ne garantiscono la sterilità. Il siero fetale bovino è il supplemento più utilizzato per il mantenimento in vitro di colture cellulari di cellule eucariote. L'addizione di siero al terreno di coltura è fondamentale per l'apporto di fattori di crescita, ormoni, chelanti e sostanze detossificanti che inducono la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule in coltura. Il siero di origine fetale è caratterizzato da una maggiore concentrazione di fattori di crescita e livelli inferiori di anticorpi rispetto al siero prelevato da un individuo adulto.

Separazione delle cellule

Per operare una separazione si possono utilizzare numerosi metodi fra cui:

• Terreni selettivi con particolari ormoni: ad esempio aggiungendo la D-Valina, un amminoacido essenziale che nella sua forma D può essere utilizzato solo da particolari linee cellulari.
• Variando i tempi di adesione al substrato.
• Utilizzando peso cellulare mediante centrifugazione: si basa sull'utilizzo di alcune molecole come il Ficoll. Le sostanze che costituiscono il gradiente devono essere non tossiche e non viscose ed esercitare una certa pressione osmotica, una di queste è il Ficoll, un polisaccaride idrofilo altamente ramificato. Dopo centrifugazione si crea un gradiente di densità in cui le cellule in sospensione. Viene utilizzato ad esempio per campioni di sangue per separare le cellule mononucleate.
• Tecniche basate su anticorpi: ci servono sostanze che discriminino determinati tipi cellulari contro altri, l'antigene deve essere esposto sulla superficie cellulare. Oltre a conoscere l'antigene allora ci serve anche l'anticorpo specifico. Sempre basata sugli anticorpi troviamo la separazione immunomagnetica in cui abbiamo biglie magnetiche con anticorpi specifici ad esse legati e l'incubazione con la sospensione cellulare eterogenea nella quale vogliamo trovare la nostra cellula specifica. È un tipo di selezione chiamato selezione positiva. In alternativa si potrebbe voler eliminare un tipo di cellule da tale soluzione eterogenea e quindi si replica la tecnica dell'immunomagnetica. Si può anche utilizzare la tecnica degli anticorpi per marcare anticorpi con composti fluorescenti in un separatore cellulare e quindi individuare cellulare riconosciute dagli anticorpi marcati (FACS), ha un'elevata risoluzione e permette di analizzare molte cellule in una volta sola.

Linea cellulare: vari tipi di cellula originariamente presenti nella coltura prima. Una coltura primaria quindi si definisce tale fino alla prima sottocoltura (tecniche di selezione appena descritte). Le caratteristiche di una linea cellulare sono: aumento del numero totale delle cellule, selezione ad ogni passaggio delle cellule con maggiore attività proliferativa e resistenza ai trattamenti come la tripsinizzazione, garantendo omogeneità alla coltura stabilendo una stabilità della coltura già a questo terzo passaggio.

Evoluzione di una coltura primaria: è logaritmica.

1. Fase di latenza.
2. Successive fasi di duplicazione linee cellulari pulite.
3. Limite Hyflik, seguito da senescenza e morte, limite di volte che una cellula ha per duplicarsi (telomeri).

Gli stimoli che portano alla senescenza sono diverse pathway che vedono coinvolti il P53 e la proteina del retinoblastoma.

Lezione 09/03

Linee cellulari continue

Linee cellulari continue: generate in modo spontaneo o indotto durante la fase di senescenza. Possono emergere cellule capaci di proliferare in maniera continua. Questo processo è definito trasformazione. La trasformazione è una mutazione fenotipica permanente spontanea o indotta e deriva da modifiche nelle sequenze e espressioni geniche, difatti è strettamente correlata ad instabilità genetica e dipende e favorisce la stessa. È associata a cambiamenti fenotipici caratteristici come:

• L'immortalizzazione: capacità di proliferare in modo indefinito.
• Controllo aberrante della crescita: perdita di inibizione da contatto, perdita di dipendenza da ancoraggio (necessaria ad eccezione delle cellule emopoietiche) e la limitazione della proliferazione.
• Acquisizione di malignità: capacità di generare tumori in vivo.

Una linea continua perciò è costituita da cellule con capacità illimitata di sopravvivenza. Anche all'interno della stessa linea ci saranno genotipi differente in sottofamiglie cellulari. La trasformazione può essere indotta da agenti virali, chimici o fisici, oppure spontanea.

Metodi per ottenere linee cellulari continue

• Da cellule di cancro: per la loro natura sono instabili geneticamente, immortali, sono generate dall'inibizione del controllo della crescita e caratterizzate da malignità.
• Da cellule staminali embrionali (hESC): 5-7 giorni dalla fecondazione, sono totipotenti e possono quindi differenziarsi e proliferare indefinitamente in coltura.
• Da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC): l'induzione della staminalità è ottenuta in vitro tramite 4 fattori di trascrizione aggiunti al genoma di fibroblasti, con trasformazione di esse in cellule staminali caratterizzate da pluripotenza. Lo stesso si ottenne su cellule umane.
• Da oncogeni virali (es. EBV, SV40, HPV): il risultato finale è l'espressione della telomerasi, in SV40 la proteina LargT è in grado di legare e disattivare la P53 e la proteina del retinoblastoma, perdendo il controllo del ciclo cellulare.
• Da induzione del gene esogeno che codifica per la subunità catalitica della telomerasi (TERT): in questo modo non si ha lo sviluppo della senescenza in quanto non si ha accorciamento dei telomeri.
• Da irradiazione mediante raggi UV: questo ovviamente induce mutazioni come quelle che colpiscono il ciclo cellulare generando linee cellulari continue.

I vantaggi di tali linee sono diversi: ci dà modelli ripetibili delle colture primarie, sono facili da mantenere in coltura in quanto hanno minore necessità di fattori di crescita che di siero, questo infatti è uno dei substrati più costosi, inoltre hanno tempo di raddoppiamento più breve. I limiti sono però numerosi perché tali linee sono caratterizzate da instabilità e da eterogeneità del genoma all'interno della stessa popolazione. La crescita è incontrollabile. Se ne osserva inoltre una mancata espressione di geni caratteristici del fenotipo differenziato in vivo, perdono inoltre molto spesso la dipendenza da adesione e contatto.

Metodi impiegati per selezione di una coltura primaria

Per ognuno di questi step osserviamo diversi fattori che possono andare ad influenzare la selezione. Durante l'isolamento possiamo causare un danno meccanico o enzimatico dovuto all'espianto; durante la coltura primaria possiamo osservare proliferazione, migrazione e adesione della coltura; nell'ottenere la sottocoltura possiamo osservare una sensibilità eccessiva alla tripsina o altri enzimi utilizzati; durante l'ottenimento della linea cellulare pulita possiamo osservare diversi tassi di crescita e per finire nella fase terminale di senescenza si osserva la morte delle cellule isolate. Ciò che determina quali sono le cellule che ottengo in coltura è la fonte dalla quale esse derivano inizialmente (coltura primaria). Quelle derivate da embrioni mi daranno il maggior numero di cellule staminali e precursori. Queste saranno capaci di autorinnovamento maggiore rispetto a cellule di tessuto adulto. Quando si parla di tessuto adulto bisogna distinguere cellule derivate da epiteli in continuo rinnovo come epiteli e cellule emopoietiche che saranno comunque caratterizzate da cellule staminali, o tessuti che si rinnovano soltanto in condizioni di stress (fibroblasti, muscolo, o glia) non staminali ma che contengono precursori proliferanti. Le cellule in coltura perdono per la maggior parte le caratteristiche fenotipiche del tessuto di provenienza perché:

• Si è selezionato il ceppo cellulare sbagliato,
• Le cellule non differenziate della stessa linea crescono a discapito di quelle differenziate con ridotta capacità proliferativa.
• Assenza di induttori di differenziamento appropriati come ad esempio ormoni, le interazioni cell-cell o cell-ECM (matrice extra cellulare). Questo potrebbe essere a causa di una perdita adattativa.
• Le cellule differenziate revertono ad un fenotipo primitivo o addirittura a cellule staminali, es. gli epatociti differenziati a seguito di epactomia parziale (in seguito a epactomia proliferano differenziandosi finché non è stato ricostituito il tessuto epatico).

Fra la crescita in vivo e in vitro abbiamo delle sostanziali differenze. In vivo abbiamo un limitato pool di cellule staminali che da origine ad un compartimento dei progenitori proliferativi che a loro volta portano al pool di cellule differenziate. In vitro invece il differenziamento è limitato dalla necessità di proliferare, per cui la popolazione predominante diventa quella del progenitori proliferanti e non quella delle cellule differenziate. Le cellule in coltura possono considerarsi come in equilibrio fra le staminali, i precursori e le differenziate, tale equilibrio si può spostare in base alle condizioni del microambiente. Alcuni dei fattori di cambiamento che portano alla differenziazione delle cellule sono una alta densità cellulare, fattori di differenziazione e interazioni fra cellula-cellula e fra cellula-ECM, fattori invece che favoriscono la proliferazione dei progenitori proliferanti sono una bassa densità cellulare, la migrazione cellulare e bassa interazione, fattori di crescita e mitogeni. Un esempio lo danno i mioblasti (muscolo di topo, il muscolo rigenera solo in seguito a danno). In seguito al trauma le cellule satelliti quiescenti si attivano e originano i progenitori proliferanti ovvero i mioblasti capaci di fondersi alle miofibre per ripararle o generando nuove miofibre caratterizzate però da un nucleo centrale. Questo processo può essere replicato il vitro replicando le condizioni. Cambiando le condizioni di coltura passando magari dal 10% al 2% di siero si osservano miotubi polinucleati invece che mono.