Appunti di Biochimica - Prof Pinotti

Introduzione alla biochimica

Concetti fondamentali per comprendere la biochimica:

• Conformazione: rotazione attorno a legame singolo (sfalsata-eclissata)
• Configurazione: necessaria rottura di un doppio legame (cis-trans), spesso necessari enzimi.
• Osmolarità: è la pressione osmotica generata dai soluti presenti in 1 L di soluzione. Quando incamero un monomero in una cellula aumenta la concentrazione; la cellula richiama acqua fino ad esplodere. Per evitare questo, il monomero viene trasformato in polimero. Più monomeri si uniscono in un polimero più grande e la concentrazione diminuisce.
• pH: cruciale in biochimica. Non è uguale da tutte le parti (compartimentalizzazione). Es: citosol pH neutro, lisosomi pH acido. Pepsina funziona nello stomaco a pH 2, tripsina lavora nell'intestino a pH 7. Ogni enzima è caratterizzato da un determinato range di pH nel quale la sua funzione è ottimale.
• Sistema tampone fisiologico: miscela di acido debole e la sua base coniugata che può tamponare l’aggiunta di acido in modo da limitare la variazione di pH.

In biochimica è importante tenere presente che tutto avviene in ambiente acquoso. È grazie alle proprietà dell’acqua, infatti, se hanno avuto origine le membrane cellulari, caratterizzate da code idrofobiche (che stanno all’interno della doppia membrana fosfolipidica) e teste idrofile, che stanno all’esterno a contatto con l’acqua.

Amminoacidi, peptidi, proteine

La digestione del legame peptidico avviene all’interno del sito attivo. La forma è legata alla funzione. Es. Emoglobina tetramero -> maggior capacità di trasportare ossigeno. Mioglobina (monomero) non trasporta ossigeno.

Funzioni delle proteine:

• Enzimi
• Trasporto
• Riserva
• Contrattili (actina/miosina)
• Di difesa (anticorpi)
• Regolatrici
• Strutturali

Amminoacidi

• Unità monomeriche che costituiscono le proteine.
• 20 tipi
• Struttura comune: gruppo alfa-carbossilico, gruppo alfa-amminico e gruppo R (catena laterale) caratteristico di ogni amminoacido.
• Asimmetrici (chirali)
• Le proteine, dopo essere state sintetizzate, vanno incontro a massicce modificazioni post-tradizionali. Se modifico la sequenza di amminoacidi modifico idrofilicità/idrofobicità e, di conseguenza, il ripiegamento della proteina.
• La carica di un amminoacido dipende dal pH
• Se il gruppo amminico è a sinistra, l’amminoacido è di classe L. Sono la classe più importante, infatti, nelle proteine degli esseri viventi ci sono solo amminoacidi di classe L. Solo la parete batterica ha amminoacidi di classe D.

Classificazione degli amminoacidi

1. Catena laterale idrofobica:

• Glicina
• Alanina
• Prolina, valina, leucina, isoleucina, metionina: hanno catene laterali idrocarburiche.
• Prolina: la sua catena laterale ha struttura ciclica, perciò conferisce rigidità alla struttura della proteina. Esiste la configurazione cis-trans: sono interconvertibili tramite rottura di un doppio legame. A temperatura ambiente, all’interno della proteina, sono presenti solo in configurazione cis o trans che non interconvertono l’una nell’altra. In base alla configurazione, la proteina assumerà una struttura diversa. PPI => sistema che consente di interconvertire proline cis/trans durante il ripiegamento delle proteine.

2. Amminoacidi aromatici idrofobici:

• Fenilalanina
• Tirosina
• Triptofano
• Catena grande che occupa molto spazio.
• Delocalizzano elettroni, assorbono luce UV. Ciò permette di misurare la concentrazione della proteina: tanto più proteina è concentrata, tanto più è ricca di amminoacidi aromatici e quindi tanto più assorbe luce UV.

3. Amminoacidi polari gruppo -OH:

• Serina (CH₂-OH): importante in enzimi per coagulazione, fertilità ecc., O può dare luogo a reazione di fosforilazione, attacchi nucleofili.
• Treonina: può perdere protoni per dare reazioni catalitiche.

4. Amminoacidi polari gruppo -SH:

• Cisteina (CH₂-SH): è ridotta, in ambiente riducente (es. citosol) non avviene niente. Se l'ambiente è ossidante (es. organelli), avviene generazione ponti disolfuro -> elemento di stabilità, si forma un legame covalente. All'interno della proteina non si rompe facilmente, servono metodi drastici. Es: quantità ponti disolfuro determina la durezza della cheratina -> determina capelli ricci/lisci. Per rompere ponti disolfuro serve agente riducente.
• Quando nelle proteine si formano ponti disolfuro illegittimi esiste una classe di isomerasi (PDI) che sono in grado di riarrangiare i ponti disolfuro.

5. Amminoacidi acidi:

• Carichi negativamente: acido aspartico, acido glutammico.
• Non carichi ma polari: asparagina, glutammina. Introdotti attraverso la sintesi proteica.

6. Amminoacidi basici:

• Lisina
• Arginina
• Istidina: anello imidazoico. Può essere carico o no e può accettare o cedere protoni.

Amminoacidi modificati

Alcuni amminoacidi non comuni presenti nelle proteine: tutti derivano dagli amminoacidi comuni. I gruppi funzionali in più sono aggiunti alla molecola mediante reazioni di modificazione.

Forme non ioniche e zwitterioniche degli amminoacidi

La forma non ionica non è presente in quantità significativa in soluzione acquosa. Quando un amminoacido che non possiede un gruppo R ionizzabile viene posto in acqua a pH 7, esiste in soluzione in forma zwitterionica. Uno zwitterione può comportarsi da acido (donatore di protoni) oppure da base (accettore di protoni). I composti che hanno questa doppia natura sono detti anofterici e spesso sono chiamati anfoliti (elettroliti anofterici). Per esempio, l’alanina quando è completamente protonata è un acido diprotico, in quanto possiede due gruppi funzionali che possono cedere protoni (-COOH, -NH₃⁺).

Punto isoelettrico

Il pK può essere considerato come la misura della tendenza di un gruppo a cedere il protone, che diminuisce 10 volte per ogni aumento del pH. A pK₁ < 2,34 la glicina è completamente protonata, a pK₂ > 9,60 la glicina è completamente deprotonata. Quando pK_a = 5,97, la glicina è presente in forma zwitterionica (punto isoelettrico). Il pK di un gruppo funzionale è influenzato dal suo intorno chimico. Quando un amminoacido è protonato (carica +) tende a deprotonarsi più velocemente per bilanciare le cariche.

Legame peptidico

- Reazione di condensazione tra NH e successivo COOH. Dal punto di vista termodinamico tende a idrolizzarsi, ma la reazione deve essere catalizzata da enzimi. Che cosa fa avvenire reazioni che non avverrebbero? Destabilizzazione/perdita gruppo uscente amminoacil t-RNA. Ha le caratteristiche di un parziale doppio legame -> non può ruotare. È planare, nel piano O e H sono disposti in trans. Se le proteine non sono planari ma globulari devono ruotare. Se i legami peptidici non ruotano, chi ruota? I legami covalenti che stanno ai lati. Questi legami prendono il nome di fi e psi. Tuttavia, non tutte le rotazioni sono possibili, il limite al numero di conformazioni permesse dipende dalle catene laterali. Es. Se due amminoacidi vicini hanno la stessa carica si respingono, quindi non possono ruotare. Se due amminoacidi vicini hanno catena laterale grande non possono ruotare per ingombro sterico.

Struttura delle proteine

Forze che stabilizzano le proteine:

• Interazioni idrofobiche nel core
• Massimo numero di legami deboli oltre a S-S bonds
• Legami a idrogeno
• Forze ioniche
• Gruppi idrofobici
• Determinanti di instabilità
• Temperatura fisiologica (37 gradi) è stabile

Definizioni:

• Conformazione: organizzazione nello spazio degli atomi di una proteina.
• Cambio di conformazione: variazione strutturale senza rottura di legami covalenti.
• Conformazione nativa: di solito quella a più bassa energia di Gibbs e funzionale.

Struttura primaria

Sequenza amminoacidica. La struttura primaria non dà informazioni riguardo l’orientazione della proteina nello spazio. La struttura primaria è definita geneticamente. Il ribosoma sintetizza la proteina partendo dall’ammino-terminale al carbossi-terminale. Per questo motivo, per convenzione, le proteine si leggono in questa direzione: ammino-terminale -> carbossi-terminale.

Le infinite possibili strutture primarie:

Per ciascun amminoacido costituente la catena polipeptidica si presentano 20 diverse possibilità di catena laterale (o residui), per cui è facile immaginare l’enorme numero di diverse catene polipeptidiche che possono essere costituite:

• Dipeptide => 20² = 400 possibili dipeptidi diversi
• Tripeptide => 20³ = 8000 possibili tripeptidi diversi

Nel caso delle proteine, una piccola proteina è costituita da una singola catena polipeptidica di circa 100 residui: 20¹⁰⁰ = 1,27 * 10¹³⁰ possibili catene polipeptidiche diverse!

Gli organismi sulla Terra sintetizzano un gran numero di proteine con caratteristiche fisico-chimiche differenti che derivano dalle diverse proprietà dei 20 amminoacidi “standard” e da come questi si combinano nella catena polipeptidica.

Strutture secondarie

Struttura ad alfa elica: struttura avvolta a elica stabilizzata da legami idrogeno che si formano tra l’N del legame peptidico e l’O carbonilico del quarto residuo amminoacidico. Le catene laterali sono esposte all’esterno: es. riconosce le basi che compongono il DNA. La maggior parte delle proteine che riconoscono le basi di DNA (fattori di trascrizione) inseriscono nei solchi del DNA delle alfa eliche. Sono destrorse. I legami a H stabilizzano l’alfa elica: ogni legame peptidico forma un legame a H. Passo dell’elica = distanza che copre l’amminoacido per fare il giro completo attorno all’asse della proteina per tornare in quella posizione. Solitamente passo elica = 3,6 amminoacidi (5.4 Å). Alfa elica struttura più abbondante in natura. Sono molto variabili in termini di sequenza avendo le catene laterali all’esterno. La maggior parte degli amminoacidi sono compatibili con le alfa eliche. Ci sono amminoacidi più propensi a dare strutture ad alfa elica. Altri invece lo sono meno (prolina e glicina). Ala, Glu, Leu, Met: buoni iniziatori di alfa eliche. Glicina: la sua catena laterale è H che consente grande libertà di rotazione. Per questo motivo non dà alfa eliche perché è troppo instabile. Prolina: la sua catena laterale è ciclica, blinda insieme il carbonio alfa con il gruppo amminico. È troppo stabile. Non si trova mai dentro le alfa eliche. Si adatta bene nel primo giro dell’alfa elica, ma se si trova in qualunque altra posizione nell’elica di solito produce una significativa distorsione dell’asse dell’elica dalla linearità (25°).

Beta foglietto: i foglietti sono corte sequenze amminoacidiche. Mentre le alfa eliche sono composte da strutture amminoacidiche che si susseguono, nel beta foglietto si hanno corte sequenze amminoacidiche che si appaiano ingaggiando legami a H tra di loro. Le catene laterali stanno sotto e sopra il piano del beta foglietto. Le proteine di beta foglietti sono inestendibili (es. seta) poiché ricchi di prolina. Il collagene invece è elastico => alfa eliche. Quando ci sono inversioni nella direzionalità della proteina si hanno ripiegamenti beta. Foglietto beta parallelo: struttura estesa stabilizzata da legami a H che si formano tra gruppi NH e CO di catene diverse. Le catene laterali sono esposte sotto e sopra il piano.

Struttura terziaria

- Si tratta di interazioni tra alfa-eliche e beta-foglietti. Definisce la disposizione spaziale di tutti gli atomi della proteina. Gli amminoacidi localizzati in regioni anche lontane e parte di strutture secondarie diverse possono interagire e causare avvolgimenti della proteina su se stessa. La struttura terziaria non è rigida; gode di una certa flessibilità che permette modificazioni conformazionali. Queste conformazioni sono spesso associate alla loro funzione biologica. Esempio: un ligando può causare un cambio conformazionale (adattamento indotto). Determinanti stabilità struttura terziaria: tutti i legami tranne covalente e peptidico, principalmente quelli deboli. La struttura terziaria corrisponde alla struttura tridimensionale completa di una catena polipeptidica. In base alla struttura terziaria si possono distinguere due grandi classi di proteine: quelle fibrose e quelle globulari. Le proteine fibrose, che svolgono principalmente ruoli strutturali, sono costituite da elementi ripetitivi di strutture secondarie. Le proteine globulari hanno strutture terziarie più complicate e contengono diversi tipi di struttura secondaria nella stessa catena polipeptidica.

Comprendere la struttura tridimensionale

Per comprendere la struttura tridimensionale di una proteina occorre analizzare il modo in cui le sue parti si avvolgono nello spazio. Inizieremo definendo due termini importanti per le catene polipeptidiche.

• Motivo detto anche ripiegamento o struttura supersecondaria: un motivo o ripiegamento è costituito da un avvolgimento polipeptidico caratteristico, perciò ben riconoscibile formato da due o più elementi di struttura secondaria e dagli elementi di connessione tra essi. Un motivo può essere costituito semplicemente da due elementi di struttura secondaria e dagli elementi di connessione tra essi. Un esempio è l’ansa beta-alfa-beta.
• Dominio: è una parte di una catena polipeptidica di per sé stabile che potrebbe comportarsi come un’entità indipendente rispetto al resto della proteina. Es. fattore di trascrizione ha due domini appartenenti alla stessa proteina che nello spazio si organizzano in strutture distinte pur facendo parte di una stessa proteina ed hanno funzioni diverse.

Random coil (loop): alcune proteine o segmenti proteici sono intrinsecamente disordinati, essendo privi di una struttura definita. Hanno struttura irregolare nel senso che le coppie (fi, psi) degli amminoacidi che li compongono assumono valori tra i più svariati. Sono generalmente flessibili e possono adottare diverse conformazioni: per questo motivo sono difficili da rilevare sperimentalmente. Per esempio: estremità N- e C-terminali, zone particolarmente ricche di amminoacidi carichi (Lys in particolare). Oltre ad avere la funzione di collegare elementi di struttura secondaria, possono anche partecipare alla formazione di siti di legame e di siti attivi negli enzimi, per cui possono essere disordinati in assenza della molecola specifica e ordinati in presenza della molecola che legano.

Folding delle proteine: come le proteine assumono conformazione nativa

Ipotesi:

1. All’interno della proteina sono già presenti le informazioni per assumere la conformazione nativa e quindi si “folda” da sola senza bisogno di interventi esterni.
2. All’interno della proteina non sono presenti le informazioni per “foldarsi” e quindi c’è qualcosa che interviene.

Esperimento:

1. Denaturo la proteina.
2. Se dopo la denaturazione la proteina si rifolda da sola -> ipotesi 1.
3. Se non si rifolda -> ipotesi 2.

Come si denatura una proteina: bisogna rompere tutte le interazioni che tengono insieme la struttura terziaria.

• Scaldo la proteina: tutti i legami a H e ionici si rompono.
• Denaturazione con agenti chimici (agire sul pH).
• Aggiungere sostanze che agiscono sulle interazioni idrofobiche (UREA), però i ponti disolfuro non si rompono. Si generano in ambiente ossidante -> uso un riducente.

A questo punto la proteina perde la sua funzione.

Grafico di denaturazione delle proteine: la curva di denaturazione delle proteine è una sigmoide. Per un bel “range” di denaturante la proteina rimane ripiegata. Ad un certo punto la proteina inizia a denaturare e poi repentinamente denatura completamente -> non c’è una relazione lineare. Ciò significa che c’è un processo cooperativo di tanti legami deboli. Questo spiega perché quando metto il denaturante per un po’ la proteina mantiene la sua struttura. Questo accade anche quando si denatura il DNA. La temperatura alla quale la proteina si denatura si chiama temperatura di fusione o temperatura di Melting.

Esperimento effettuato con ribonucleasi

1. Ribonucleasi: enzima che degrada RNA, la mettiamo in una provetta (non ci sono agenti che interferiscono con il folding).
2. La mettiamo in un agente denaturante.
3. Se tolgo il denaturante si rifolda? Se sì, all’interno di lei ci sono le informazioni per rifoldarsi, altrimenti no.

La ribonucleasi degradata non era più capace di degradare RNA, una volta tolto il denaturante la proteina si rifoldava perfettamente e recuperava la sua funzione. Perciò all’interno delle proteine sono già presenti le informazioni del folding = Teoria di Anfinsen.

Come fa a rifoldarsi?

1. Ipotesi: siccome la proteina si rifolda utilizzando le rotazioni attorno ai singoli legami (fi e psi) possiamo immaginare che la proteina prima di foldarsi esplori tutte le possibili conformazioni.
2. Data una proteina di 150 amminoacidi in cui ogni amminoacido partecipa solo alla formazione delle conformazioni principali -> alfa elica, beta foglietto, foglietto beta. Ogni residuo ci mette un picosecondo.

=> il folding richiederebbe tantissimo tempo

=> questa ipotesi non può essere considerata valida.