Appunti di Antropologia

Preparazione delle librerie genomiche per l'NGS

Si definisce libreria genetica o genomica un insieme di molecole di DNA in forma stabile che rappresenta il genoma (o porzioni di esso) di un organismo.

Il principio di preparazione dei campioni per l'NGS prevede:

• Tutti i frammenti di DNA del campione vengono riparati alle estremità e legati ad adattatori universali. Gli adattatori permettono l'amplificazione e il sequenziamento di tutti i frammenti di DNA in parallelo, usando dei primers universali sia nella metodologia 454 FLX che nella metodologia Illumina.
• Esistono kit commerciali per la preparazione delle library, ma per il DNA antico l'efficienza con cui le molecole vengono riparate alle estremità e legate agli adattatori è spesso bassa, perché questi kit non funzionano bene.
• Sono stati quindi sviluppati dei protocolli homemade per migliorare questa efficienza e monitorare la resa del campione al termine di ogni passaggio.

Sperimentale e, pertanto, per costruire una libreria genomica per l'NGS.

Esistono due tipi di librerie genomiche:

1. Double-stranded (ds) library è la libreria che abbiamo già visto;
2. Single-stranded (ss) library la libreria viene costruita a partire da molecole di DNA a singolo filamento. Viene costruita una libreria su un filamento e su quello complementare, vengono sequenziati entrambi, e quindi abbiamo una maggiore informazione (perché leggo sia il filamento forward che reverse). La ss-library viene costruita in 3 step:
   1. Attacco del primo adattatore alle molecole a singolo filamento, mediante T4 DNA ligasi;
   2. Copia dei filamenti di DNA mediante proofreading polymerase;
   3. Attacco del secondo adattatore a doppio filamento all'altro filamento, mediante T4 DNA ligasi.

In questo modo andiamo a leggere sia il filamento superiore che quello inferiore, ovvero sia lo strand forward che lo strand reverse. La ss-library è, ovviamente, una

libreriaDorian Fink© Dorian Fink© Dorian Fink© Dorian Fink© Dorian Fink© Dorian Fink©che non viene utilizzata moltissimo; viene utilizzata abbastanza per l’analisi del DNA moltodegradato. Le ss-library sono infatti molto più efficienti per DNA altamente degradato, ma molto piùcostose delle ds-libraries.

Quando è stato analizzato il genoma di Homo heidelbergensis è stata elaborata una ss-library, proprio perchécon la ss-library abbiamo la possibilità di raddoppiare le informazioni provenienti da un genoma.

Gli step per la preparazione della libreria sono:

1. Blunt-end repairs;
2. Adaptor ligation;
3. Adaptor fill-in,in cui gli adattatori convergono ad un’unica lunghezza;
4. Indexing PCR, in cui vengono aggiunti gli indici.

Questi sono i 4 passaggi che ci permettono di andare a costruire una libreria.

1) BLUNT-END REPAIR. Le estremità sporgenti al 5’ o al 3’ vengono pareggiate tramite la

La ricostruzione della sequenza avviene mediante T4 DNA polimerasi. Gruppi fosfati vengono attaccati al 5’ mediante la T4 polinucleotidechinasi. Durante il blunt-end repair le informazioni che noi riusciamo ad ottenere sono relative alla formazione di misincorporazioni: vengono infatti ricostruite le estremità di un frammento degradato, e quindi in 5’ e in 3’ vengono inserite molte più misincorporazioni rispetto ad altre parti del frammento di DNA, perché alle estremità il genoma è scoperto. Quando la T4 va a inserire la base opposta, può a volte inserire un errore. È proprio questo (la presenza di misincorporazioni) il tratto distintivo che ci permette di distinguere la presenza di molecole endogene – che portano errori – da molecole esogene – che non li portano – o da molecole endogene che non portano errori ma siccome hanno la sequenza uguale a molecole endogene che portano errori mi consentono di ricostruire la sequenza corretta.

riconoscerle.

2) ADAPTOR LIGATION. I due adattatori (P5 e PT) vengono legati ad entrambe le estremità piante dei filamenti, mediante T4 DNA ligasi.

3) ADAPTOR FILL-IN. con la Bst polymerasi andiamo a rimuovere i nicks, andando a recuperare la lunghezza dei due adattatori.

4) ATTACCO DEGLI INDICI – Indexing PCR. Ogni campione viene marcato con una specifica coppia di indici, dandoci la possibilità di sequenziare più campioni contemporaneamente nella stessa run. Le sequenze prodotte vengono distribuite nei rispettivi campioni che le hanno generate grazie all'associazione indici-campione. Questo significa fondamentalmente che se io metto degli indici, ovvero dei tag, riconosciamo che quella determinata libreria è costruita su quel determinato campione, e quindi possiamo far correre insieme più campioni e andarli a riconoscere. Questo lo possiamo anche fare con la 454FLX, anche se in tal caso si chiamano MID. Quindi, su un cluster ci sono frammenti di

librerie diverse, che però io riconosco perché hanno degli indici differenti. L'indice è identificato da una sequenza oligonucleotidica di 6-8 pb, con un frammento a sx che è complementare all'adattatore e una porzione a dx che è invece una porzione universale. Facendo una amplificazione di 10-20 cicli abbiamo quindi l'attacco degli indici P5 e P7 all'estremità 5' e 3' questo se utilizziamo due indici. A volte viene utilizzato anche un indice solo (è più che sufficiente), dipende dal tipo di esperimento.

Possiamo utilizzare l'Uracil-DNA glicosidasi (UDG) che è praticamente la stessa cosa del trattamento con UNG che avevamo visto. L'UDG è un enzima che riconosce l'uracile e taglia il legame tra la base e lo zucchero, creando un sito apiramidinico significa

metà).→Quindi: 1) No-UDG treatment le deaminazioni sono fondamentali per la distinzione tra molecole endogene e molecole contaminanti; 2)→Full-UDG treatment con trattamento full-UDG si riparano tutti i danni ma si perdono le caratteristiche principali per l'autenticazione del dato finale. 3)→Partial-UDG treatment io posso fare un trattamento parziale con UDG in maniera tale da avere la preservazione parziale del danno, che viene preservato alle ultime basi del frammento e, contemporaneamente, rimuovere gli errori nella parte centrale del frammento.

CONTROLLO DELLA LIBRERIA ALL'Agilent-BioAnalyzer

Alla fine della preparazione delle librerie si utilizza l'Agilent BioAnalyzer, che ci fa informazioni sulla lunghezza della mia libreria che, nell'esempio, è lungo intorno alle 181 pb (se si fa i conti Index P5 + Adattatore P5 + inserto + adattatore P7 + Index P7 si ottiene un frammento che va tipicamente dalle 170 alle 200 pb, e quindi è

giusto che abbia un picco in cui la frequenza maggiore dei frammenti ha una lunghezza di 180 pb). Perché la lunghezza della libreria è 170-200 pb? Per il motivo detto ora ma soprattutto perché l’inserto è un frammento di 50-80 pb, dato che il DNA antico è frammentato. Gli indici e gli adattatori hanno lunghezza costante, mentre la lunghezza dell’inserto varia, ed è dalla lunghezza dell’inserto che dipende la variabilità della lunghezza totale del frammento.

CATTURA CON PROTOCOLLO MARICIC

◼ Articolo: Multiplexed DNA Sequence Capture of Mitochondrial Genomes Using PCR Products – Tomislav Maricic et al.

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La differenza che possiamo osservare, rispetto alla metodologia PEC, non è altro che come andiamo a costruire i frammenti che vanno a catturare il DNA mitocondriale. La PEC si basa sull’utilizzo di

Primer PEC per andare a catturare molecole di mtDNA, e questi Primer PEC sono più di 500. Un primer PEC costatantissimo, perché costa tanto farlo sintetizzare. Pertanto, a Tomislav Maricic è venuto in mente di andare a preparare delle sonde per andare a catturare il mtDNA, andando a fare delle long-range PCR, ovvero delle PCR molto lunghe, su mitocondri attuali. Quindi, la metodologia Maricic si basa sulla costruzione di sonde mitocondriali recuperate dall'amplificazione di mitocondri umani. Attraverso un tampone basta prelevare delle cellule epiteliali della mucosa buccale, si fa l'estrazione del DNA mitocondriale, e con 2 long-range PCR faccio l'amplificazione di tutto il DNA mitocondriale, prima in un verso e poi nell'altro verso (freccia rossa e blu). Quindi, con 2 long-range PCR si ottengono prodotti parzialmente sovrapposti che coprono l'intero mtDNA, realizzate su DNA moderno estratto da saliva. In questo modo io posso costruire due