appunti microbiologia

Lezione 1: Storia della microbiologia

La scoperta dei microrganismi

La scoperta dei microrganismi è legata all'avvento del microscopio:

• Microscopi semplici nel XVII secolo
• Microscopi complessi nel XIX secolo

Il primo studioso a riportare di aver visto microrganismi con il microscopio è stato l'inglese Robert Hooke (1635-1703). Fu il primo a proporre forme cellulari di vita. Vede i funghi, ma non i batteri.

Antony van Leeuwenhoek (1632-1723), mercante di tessuti olandese che usava le lenti di ingrandimento, che produceva lui stesso, per osservare la trama dei tessuti che acquistava. Fu il primo a vedere e descrivere i batteri.

Nel 1676 scrive le sue osservazioni alla Royal Society di Londra mandando anche disegni di batteri.

La scienza microbiologica nel XIX secolo

• Si svilupparono tecniche microscopiche che consentirono di osservare i microrganismi ad ingrandimenti maggiori.
• Si svilupparono nuove tecniche di studio (isolamento e coltivazione) dei microrganismi.
• Si diede risposta definitiva a due complicati problemi: esiste la generazione spontanea? Qual è la natura delle malattie infettive?

Esperimenti significativi

Esperimento di Francesco Redi: Dimostrò che le larve presenti nella carne in decomposizione non si generano spontaneamente, ma derivano dalle uova deposte sulla carne dalle mosche. Egli prese due pezzi di carne e li mise in due recipienti di vetro, uno chiuso e uno aperto; dopo alcuni giorni, solo su quello aperto comparvero i vermi (che si trasformarono in mosche dopo circa tre settimane). Il mancato sviluppo di vermi sulla carne nel recipiente chiuso poteva essere imputato all’assenza di ricambio d’aria. Redi ripeté l’esperimento chiudendo il recipiente con una reticella in grado di lasciar passare l’aria, ma non le mosche: anche in questo caso, sulla carne non si formarono vermi, che comparvero invece sulla reticella (dove le mosche avevano deposto le uova) dimostrando che essi (larve di mosche) non si generano spontaneamente.

Esperimento di Pasteur: Se la generazione spontanea dei vermi era stata smentita, la scoperta dei microrganismi ripropose la stessa domanda: i microrganismi che si formano ad esempio in un brodo lasciato all’aria, originano spontaneamente? La risposta, decisamente negativa e definitiva, venne da Pasteur. Pasteur introdusse in un pallone di vetro col collo lungo un brodo nel quale apparentemente si generavano “spontaneamente” dei microrganismi. Piega a “S” il collo del pallone, in modo da consentire l’ingresso dell’aria, ma impedire la contaminazione del brodo da parte della polvere e dei batteri in essa presenti. Fece poi bollire il brodo contenuto nel pallone di vetro, in modo da uccidere tutti i microrganismi eventualmente presenti nel brodo e nel collo del recipiente. Lasciato raffreddare, Pasteur constatò che il brodo non aveva generato batteri. Quindi non esiste una generazione spontanea di microrganismi, che provengono invece dalla polvere. Pasteur dedusse che i microrganismi osservati non si originassero spontaneamente dal brodo, ma penetrassero al suo interno dall'ambiente circostante.

Contributi di Pasteur e Koch

1857: Napoleone III, avendo ammutinamenti a causa dell’inacidimento del vino, si rivolge a Pasteur. Pasteur con il microscopio trova gli agenti che causano il deterioramento del vino e introduce la pastorizzazione (trattamento al calore che uccide i m.o. alterativi ma non cambia le proprietà organolettiche del prodotto). Inoltre capisce che i lieviti che si trovano nel vino sono responsabili della produzione di alcol. Pasteur è anche il padre dell’immunologia. Mentre investigava il colera dei polli si accorge che iniettando l’agente indebolito (ipo-virulento) i polli resistevano a successive iniezioni con ceppi virulenti. Scopre anche l’esistenza di forme di vita anaerobiche. Dimostra che fermentazione e putrefazione sono fenomeni biologici.

Scoperta dei microrganismi come agenti di malattie

• 1836: Bassi scoprì che i miceti erano agenti patogeni dei bachi da seta.
• 1845: Berkeley scoprì che un micete (peronospora) era l’agente patogeno delle piante di patata in Irlanda, che causò a metà dell’800 la più grave carestia dell’Irlanda.
• 1860s: Joseph Lister gettò le basi della chirurgia asettica. Usò un disinfettante sugli strumenti chirurgici per prevenire le infezioni, riducendo drasticamente le morti per infezioni.
• 1860-1876: Koch scoprì l’eziologia del carbonchio, malattia infettiva acuta causata dal batterio Bacillus anthracis, produttore di spore che possono sopravvivere a lungo nell’ambiente. Colpisce soprattutto gli animali erbivori, ma può interessare anche l’uomo. Di solito gli uomini acquisiscono la malattia per contatto con animali infetti, soprattutto durante la lavorazione di derivati animali.

Robert Koch (1843-1910) si interessa all’antrace, comune malattia sia per uomini sia per animali. Usando il microscopio rileva la presenza di un grosso batterio (Bacillus anthracis) nel sangue delle vittime e riesce a isolarlo. Il batterio isolato inoculato in animali sani provoca la malattia e può essere successivamente isolato da questi ultimi. L’antrace è causato da microrganismi.

I postulati di Koch

I postulati di Koch (o postulati di Henle-Koch) sono dei criteri destinati a stabilire la relazione di causa-effetto che lega un microrganismo a una malattia. Robert Koch fu il primo ad adottare sperimentalmente alcuni criteri, già in precedenza formulati da Friedrich Gustav Jakob Henle, che altro non sono se non quattro regole generali per stabilire se un certo microrganismo sia o meno la causa di una certa malattia. Koch isolò dai tessuti di animali malati i bacilli del carbonchio, li coltivò in laboratorio e ne identificò il ciclo vitale di tipo sporigeno. Attraverso l'inoculazione delle cellule in animali non affetti da alcuna patologia osservò l'insorgenza della malattia e la possibilità di isolare tale microrganismo dal tessuto degli animali infettati sperimentalmente. Questi criteri sono conosciuti appunto come postulati di Koch:

• Il presunto agente responsabile della malattia in esame deve essere presente in tutti i casi riscontrati di quella malattia.
• Deve essere possibile isolare il microrganismo dall'ospite malato e farlo crescere in coltura pura.
• Ogni volta che una coltura pura del microrganismo viene inoculata in un ospite sano (ma suscettibile alla malattia), si riproduce la malattia.
• Il microrganismo deve poter essere isolato nuovamente dall'ospite infettato sperimentalmente.

Se positivi, abbiamo la prova della patogenicità del microrganismo e della sua influenza in un determinato quadro patologico. Questi postulati, per quanto estremamente potenti, hanno evidenti limiti sperimentali:

• Alcuni microrganismi commensali o normalmente presenti nell'ambiente danno patologia solo in determinati soggetti o situazioni.
• Spesso l'inoculazione, invece di portare a una patologia conclamata, provoca danni subclinici.
• Alcuni microrganismi (ad esempio il Mycobacterium leprae o i fitoplasmi) non sono coltivabili in vitro o non è possibile trovare un animale adatto all'inoculazione (perché il patogeno ha tropismo unico per l'uomo o perché gli altri animali sviluppano una diversa patologia rispetto all'uomo).

Colture pure

Una coltura pura è una popolazione di organismi che sono la progenie derivante da un unico microrganismo. In natura i batteri vivono in colture miste. Crescita su fette di patate bollite (sterili). Isolamento è possibile solo in laboratorio. Si capisce che ci sono diversi tipi di microrganismi (tassonomia microbica).

R. J. Petri, assistente di Koch, inventa le piastre Petri (1887). La piastra di Petri o capsula di Petri è un recipiente piatto di vetro o plastica, solitamente di forma cilindrica; è un importante strumento di lavoro in molti campi della biologia, per la crescita di colture cellulari e perché permette di osservare a occhio nudo colonie batteriche. Essa prende il nome dal batteriologo Julius Richard Petri, assistente di Robert Koch, che la inventò nel 1877. Le piastre più utilizzate hanno un diametro tra i 50 e i 100 mm e un'altezza di 15 mm.

Nel 1874 Fanny Eilshemius sposò Walther Hesse, che lavorava nel laboratorio di Koch. Quando il marito, durante un’estate, non riusciva a lavorare con le piastre di gelatina gli suggerì l’utilizzo dell’agar-agar con il quale confezionava le sue marmellate. Agar-agar = polisaccaride usato come gelificante naturale e ricavato da alghe rosse (Gelidium). Polimero costituito principalmente da unità di D-galattosio. L'agar agar non può essere digerito dagli enzimi presenti nella maggior parte degli organismi, batteri e miceti compresi, per questo motivo è utilizzato in microbiologia per solidificare i terreni di coltura per tali microorganismi.

Martinus Beijerinck (1851-1931). Coltura d’arricchimento: mezzo che consente di isolare m.o. che si sono sviluppati in modo da sopravvivere a certe condizioni ambientali specifiche. Isola molti m.o. dotati di differenti attività fisiologiche. Scopre i batteri azotofissatori anche simbionti.

Sergei Winogradsky (1856-1953), padre della microbiologia del suolo. Isola i batteri nitrificanti. Colonna di Winogradsky: la comunità microbica si sviluppa lungo un gradiente di ossigeno. Chemiolitotrofia e autotrofia.

1928: Alexander Fleming scopre il primo antibiotico. Il fungo Penicillium produce la penicillina che riesce ad inibire la crescita di Staphylococcus aureus.

La microbiologia recente

• 1943: Delbruck e Luria scoprono modalità di trasferimento genetico diverse dalla ricombinazione sessuale.
• 1953: Watson e Crick scoprono la struttura del DNA (nascita della biologia molecolare).
• 1966: Lynn Margulis propone la Teoria dell’Endosimbionte.
• 1977: Carl Woose propone la classificazione in tre domini degli organismi viventi.
• 1983: Kary Mullis inventa la PCR (polymerase chain reaction).
• 1995: Craig Venter pubblica il primo genoma completo di un batterio (2003 genoma umano).
• 1996: Ecologia Microbica Molecolare.

Lezione 2: Origine della vita cellulare sulla terra

Origine ed evoluzione della cellula vivente

Origine ed evoluzione della cellula vivente: 3,5 miliardi di anni fa.

La prima interessante ipotesi riguardo all’origine della vita fu elaborata dal biochimico russo Aleksandr I. Oprain (1894-1980) e venne ripresa dal genetista scozzese J. B. Haldane (1894-1964). Secondo questi scienziati, la comparsa della vita sulla terra fu preceduta da una lunga serie di eventi che prende il nome di evoluzione chimica.

Nell’atmosfera primitiva e nei mari:

• L’ossigeno libero era quasi del tutto assente nell’atmosfera, mentre era ancora abbondante nell’atmosfera.
• I 4 elementi (idrogeno, ossigeno, carbonio e azoto) che oggi costituiscono più del 95% dei tessuti degli organismi viventi erano in qualche modo già disponibili nell’atmosfera e nelle acque.
• Oltre a questi materiali grezzi sul nostro pianeta c’era moltissima energia che si manifestava sotto forma di calore, scariche elettriche, radioattività e radiazioni provenienti dal sole. Oprain ipotizzò che, in tali condizioni, dai gas dell’atmosfera si sarebbero potute formare grandi quantità di quelle molecole che costituiscono il materiale chimico di base dei tessuti viventi, ossia le molecole organiche; col tempo, esse si sarebbero raccolte nei mari e nei laghi del pianeta, dando origine a un “brodo primitivo”.

Prime forme di metabolismo cellulare

Meccanismi:

• Fotosintesi anossigenica: H₂S è il donatore di elettroni (fonte di potere riducente) (Era: Precambriana, Periodo: Archeano inferiore).
• Fotosintesi ossigenica: H₂O è il donatore di elettroni. Cianobatteri. Quindi, emissione di ossigeno in atmosfera e sviluppo di microrganismi aerobi (2,6 miliardi di anni fa) che hanno portato all’evoluzione di vie metaboliche diversificate per lo sfruttamento delle fonti di energia nei diversi ambienti.

L’esperimento di Miller

L’esperimento di Miller confermò l’ipotesi di Oprain. Miller simulò in laboratorio le condizioni ambientali probabili sulla terra primitiva facendo circolare, fra un “oceano” posto in basso e una sovrastante “atmosfera”, alcuni gas come l’idrogeno, il vapore acqueo, il metano e l’ammoniaca. L’“oceano” venne scaldato per far evaporare l’acqua e per spingere i gas dentro i tubi del dispositivo, attraverso cui si fecero passare scariche elettriche che simulavano l’azione dei fulmini. Quando i gas fluivano lungo la parte di tubo che era circondata da acqua di raffreddamento, il vapore acqueo si condensava e tornava allo stato liquido portando con sé qualsiasi molecola organica si fosse formata. Queste molecole si accumulavano in basso, nella porzione di tubo che ricollegava con l’oceano. Dopo 24 ore, circa la metà del carbonio presente inizialmente nel metano era stato incorporato in vari tipi di molecole organiche formando, in particolare, gli amminoacidi (biomolecole fondamentali per gli organismi viventi). L’importanza dell’esperimento fu quella di aver dimostrato in laboratorio in che modo abbiano potuto formarsi spontaneamente le molecole che sono alla base della vita (fulmini, radiazioni ultraviolette o ceneri vulcaniche bollenti avrebbero potuto trasformare le molecole presenti sulla superficie terrestre in composti organici complessi).

Filogenesi

La “storia evolutiva e correlazioni genetiche tra organismi" è nota come Filogenesi. La molecola più utilizzata per indagare il grado di relazione evolutiva tra gli organismi è l’rRNA = RNA ribosomiale. (è la tipologia più abbondante di RNA presente nella cellula ed è il principale costituente dei ribosomi, i macchinari per la sintesi delle proteine. La cellula possiede milioni di ribosomi che sono costituiti da alcune molecole di rRNA e da proteine, per questo motivo l’rRNA rappresenta circa l’80% di tutto l’RNA presente in una cellula.)

• rRNA è contenuto nei ribosomi (sintesi proteica) di tutti gli organismi diffusione universale, quindi è possibile fare paragoni tra tutti gli organismi.
• rRNA ha subito modificazioni molto lente durante l’evoluzione, quindi è una molecola altamente conservata: è un orologio molecolare evolutivo.

L’unità di misura del “peso” delle subunità dei ribosomi S(coefficiente di Svedberg) è un coefficiente di sedimentazione che dipende dalla forma oltre che dalla composizione molecolare delle particelle soggette a sedimentazione, ciò spiega come mai il peso delle due subunità unite a formare il ribosoma completo sia differente dalla somma algebrica dei pesi delle singole subunità.

Esistono tre molecole di RNA ribosomiale che nei procarioti hanno le dimensioni di 5S, 16S e 23S. L’RNA 16S è stato molto utilizzato per lo studio della filogenesi dei procarioti, mentre negli eucarioti la molecola sequenziata è l’RNA 18S, che rappresenta in queste cellule il corrispondente funzionale del 16S.

Analisi della sequenza del gene 16S rRNA

Il gene è lungo circa 1500-1600nt, dopo la trascrizione non è tradotto in proteina, ma assume una particolare struttura secondaria che serve per la costruzione del ribosoma. Codifica per la subunità piccola del ribosoma (16S nei procarioti; negli eucarioti come i funghi è il 18S rRNA). Deve assumere una determinata struttura tridimensionale per assolvere la sua funzione, quindi ha un basso tasso di mutazione (la maggior parte delle mutazioni producono ribosomi non funzionanti e non vengono trasmesse alla progenie). È presente nei genomi in multicopia (anche 15 copie), proprio perché è essenziale per la vita.

• Confrontando la sequenza nucleotidica di questo gene è possibile:
• Quantificare la distanza filogenetica: determinare a che punto dell’evoluzione 2 organismi si sono differenziati a partire da un progenitore comune.
• Determinare la biodiversità tra gli organismi.
• Identificare un batterio: se 2 organismi hanno 16S rRNA con più del 97% delle basi omologhe, possono appartenere alla stessa specie.

Filogenesi e albero della vita: In seguito agli studi filogenetici basati sulla sequenza dell’RNA ribosomale, Carl Woese (1977) propose i seguenti 3 domini: Bacteria, Archaea, Eukarya.

Teoria dell’endosimbionte

Gli eucarioti si sono evoluti quando:

• L’urcariote divenne un ospite per alcuni endosimbionti batterici che si trasformarono successivamente in mitocondri e cloroplasti.
• La cellula degli eucarioti ha acquisito RNA sia dagli archea che dai bacteria, risultando in una “chimera”.

Urcariote: stadio evolutivo intermedio della cellula eucariote.

Progenote: progenitore comune a procarioti ed eucarioti (LUCA).

Mitocondri e cloroplasti hanno ribosomi 70S e DNA non avvolto da membrana, come i batteri. Mitocondrio: attività respiratoria eucarioti, delimitato da membrana, possiede DNA (non avvolto da membrana) e ribosomi 70S. Cloroplasto: fotosintesi eucarioti, delimitato da membrana, DNA non membrana nucleare, ribosomi 70S.

• Solo eucarioti
• Contengono elementi genici non cromosomali
• Oltre al DNA contengono i componenti per la sintesi proteica (compresi ribosomi 70S, tRNA, e funzioni di traduzione e formazione di proteine funzionali)
• La loro esistenza è dipendente dal cromosoma della cellula perché la maggior parte delle proteine contenute sono codificate dal DNA cromosomale della cellula

Secondo la teoria dell’endosimbiosi, i cloroplasti e i mitocondri delle cellule eucariotiche rappresentano il risultato evolutivo di un’associazione simbiotica tra cellule procariote e una cellula più grossa al cui interno essi si sono venuti a trovare.

Eventi evolutivi secondo la teoria dell’endosimbionte: Dal momento in cui gli endosimbionti si stabiliscono nella cellula di Archea, l’evoluzione verso forme di vita superiore procede molto velocemente grazie alla migliore efficienza energetica del sistema.

Albero filogenetico: Non tutti i procarioti sono filogeneticamente strettamente correlati tra loro.