Appunti del corso di biotecnologie delle fermentazioni

P P/X

dove q rappresenta la velocità specifica di formazione del prodotto (misurata come g di prodotto

P

per g di biomassa nell’ unità di tempo)

Moltiplicando per la biomassa totale si ottiene la PRODUTTIVITA’ VOLUMETRICA (g di

prodotto per volume nell’unità di tempo)

R= q · X

P

la cinetica di produzione è collegata alla cinetica di crescita attraverso una costante

Produzione di prodotti parzialmente correlati con la crescita => Si introducono altre costanti

processo -dipendenti che descrivono quando inizia la fase di produzione rispetto alla fase di crescita

dP/dt = α · dX/dt + β·X

dove α e β sono costanti dipendenti dal processo

Produzione di metaboliti secondari => Normalmente la produzione inizia quando µ diminuisce

Fed-batch =>

Un processo di fed-batch ha i seguenti pro e contro:

Pro

-prolungata fase di crescita e/o produzione

-si evita la repressione da catabolita e problemi osmotici dovuti ad alte concentrazioni di zuccheri

che provocano stress osmotico

-diminuisce la viscosità del brodo

-diluizione di metaboliti tossici

contro

-elevato rischio di contaminazioni

-processo complesso

-elevata instabilità genetica

in un processo di fed batch, il feeding si inizia a fare quando il microrganismo tende ad entrare

nell’ultima fase di crescita esponenziale; questo causa il proseguito della fase di crescita

esponenziale.

In questa nuova fase di crescita esponenziale si ha una mu ridotta rispetto alla mu della prima fase

di crescita esponenziale ( graficamente si ha una pendenza minore).

Il feeding introdotto (il feeding è un flusso,volume/ tempo ) deve essere calcolato in modo da

mantenere stabile la concentrazione dei substrati rimanenti; tutto il feeding introdotto deve essere

utilizzato dal microrganismo per crescere! in questo modo il substrato nutritivo rimane costante.

Per concludere, la quantità di substrato aggiunto deve essere uguale a quella utilizzata dal

microrganismo!

La crescita del microrganismo è regolata da mu; inoltre si deve considerare il volume del

bioreattore; non si può aggiungere troppo feeding!

Il substrato feed dipende ovviamente dalla produzione; in caso in cui si vuole ottenere biomassa si

immettono zuccheri mentre nel caso della produzione di amminoacidi si aggiungono delle fonti di

azoto.

Anche nel caso dell’azoto, il feeding permette di mantenere la concentrazione di questo elemento

costante nel tempo della fermentazione

In caso di produzione di un metabolita secondario, il feeding può essere fatto quando il substrato è

sotto a un determinato valore soglia; ciò permette di evitare la repressione da catabolita! in caso di

repressione da catabolita non si ha la produzione del prodotto del metabolismo secondario.

Fermentazione in continuo => La fermentazione in continuo è un sistema aperto

La soluzione sterile nutriente è aggiunta al bioreattore continuamente e ,in parallelo, il terreno

esauso dai nutrienti insieme ai microrganismi viene rimosso dal sistema.

Anche in questo caso l’immissione di nutrienti deve avvenire sotto a una certa soglia e deve

permettere il mantenimento a concentrazione costante di quest’ultimi.

La produzione si ha in una situazione di equilibrio tra flusso in ingresso e flusso in uscita

Si possono distinguere due tipi di fermentazione in continuo:

manca

-chemostato

-tubidostato

-Plug flow reactor

Nel plug flow reactor la soluzione nutriente entra dal fondo mentre il prodotto esce dalla testa; sono

utilizatti nelle bioconversioni.

Si ha la formazione di un gradiente di sostanze nutrienti e la biomassa è immobilizzata

Nel chemostato si mantiene costante il volume.

Nel turbidostato si mantiene costante la concentrazione di biomassa nel sistema.

Il chemostato è un reattore agitato meccanicamente in cui si ha un sistema per l’immissione della

soluzione nutriente e un sistema per l’asportazione della soluzione esaurita,il tutto mantenendo

costante il volume di terreno contenuto nel bioreattore

Il terreno di coltura viene immesso nel recipiente per coltura ad una velocità che assicura un tasso di

crescita costante.

Questo sistema ha lo svantaggio di permettere una continua replicazione cellulare; ciò non assicura

una buona stabilità genetica.

Questo processo è tuttavia molto efficiente dal punto di vista della produzione, in quanto permette

la produzione continua per molto tempo, evitando di fare l’harvest al termine di ogni produzione

però ,proprio a causa delle lunghe tempistiche di produzione e per le varie entrate nel bioreattore, il

chemostato è molto suscettibile a eventuali contaminazioni.

Crescita nel chemostato=> nel chemostato, un flusso F passa attraverso il reattore che ha un volume

operativo V.

Il flusso è sempre mantenuto costante (sia in ingresso che in uscita) per mantenere il volume

costante.

Se D(h-1) è la velocità di diluizione:

D= F/V F= mL /h V=volume operativo mL

Se il volume è costante,il terreno fresco entra con una velocità di diluizione D e la biomassa e il

terreno fermentativo escono con la stessa velocità di diluzione .

La quantità di biomassa dipende dalla concentrazione del substrato limitante.

Nella fermentazione in batch : dX/dt = mu * X

Nella fermentazione in continuo :crescita- effluente dX/dt = (mu*X) - (D*X) = (mu-D) X

Se mu è maggiore della D si ha un aumento della biomassa

Se mu è minore della D si ha una diminuzione della biomassa

Se mu è uguale alla D si ha una situazione di equilibrio (steady state)

Si può continuare ad immettere nutrienti ( aumento D con aumento di mu) fino a che in un sistema

si ha mu = mu max; a questo punto il sistema intero crolla.

Quando mu = mu max si va incontro alla D critica (diluizione critica); in questo stato le cellule non

riescono più a compensare i nutrienti immessi e il chemostato andrà incontro a “wash out”, ossia il

crollo della concentrazione batterica nel fermentatore.

FERMENTAZIONI: PRODOTTI DELL’ANAEROBIOSI

LA FERMENTAZIONE ALCOLICA

I microrganismi coinvolti più frequentemente in questo tipo di fermentazione sono Saccaromyces

cerevisiae e Zymomonas mobilis.

La fermentazione alcolica è una fermentazione tradizionale ad uso alimentare o di produzione

industriale di alcoli e di biofuels a base di alcoli.

I microrganismi sopra citati sono rispettivamente un lievito (un fungo facente parte del gruppo degli

ascomiceti; questi possiedono delle spore meiotiche contenute in strutture dette asco) e un batterio

Gram negativo.

Questi due microrganismi sono stati intensamente studiati in quanto sono degli specialisti

metabolici per la produzione di alcoli.

In natura questi microrganismi si localizzano ad esempio sulla superficie degli acini d’uva (per

quanto riguarda Saccaromyces) e sulle canne da zucchero (per quanto riguarda Zymomonas).

I sumeri producevano la birra mentre gli egiziani il vino

Ad oggi il lievito viene usato per la produzione industriale di alcool, per le bevande alcoliche

(birra,vino,liquori) e per la biomassa (utilizzata poi nella panificazione, estratto di lievito,vitamine).

L’etanolo viene prodotto anche come solvente per l’industria chimica e come precursore di altri

compoisti chimici importanti per polimeri

In paesi come il Brasile e Stati Uniti, l’etanolo di origine fermentativa (bioetanolo) viene usato

come sostitutivo o additivo della benzina.

Un microrganismo ideale per la produzione di etanolo deve avere le seguenti caratteristiche:

-utilizzare un ampia gamma di fonti di carbonio

-utilizzare fonti a basso costo e di facile riproducibilità

-produrre etanolo con alte rese e alte produttività

-tollerare alte concentrazioni di etanolo

-tollerare le pressioni osmotiche causate dall’alta concentrazione di substrato iniziale

-crescere a temperature relativamente elevate per ridurre il rischio di contaminazioni e per facilitare

il recupero del prodotto

-flocculare facilmente per semplificare le operazioni di separazione della biomassa

La tassonomia e gli attinomiceti

La tassonomia è la disciplina della classificazione

Abitualmente si impiega il termine per desi manca

Nei batteri vi sono 15 phyla; ogni phylum è suddiviso in un centinaio di generi

Esistono più metodi per la classificazione tassonomica dei microrganismi:

-morfologia microscopia e della colonia su piastra

-test metabolici

-analisi chimica della parete e della membrana

-metodi molecolari come l’analisi della sequenza 16 (18) S dell’RNA e l’ibridazione DNA / DNA

Nei metodi classici di caratterizzazione si osservano le seguenti caratteristiche:

-caratteri morfologici

-caratteri morfologici e fisiologici

-caratteri ecologici

-analisi genetica

nei metodi molecolari invece si osservano le seguenti caratteristiche:

-confronto delle proteine

-confronto degli acidi grassi

-composizione in basi degli acidi nucleici

-ibridazione degli acidi nucleici

-sequenziamento degli acidi nucleici

Gli attinomiceti (ordine Actinomycetales)

Sono Gram positivi che spesso formano un micelio filamentoso e spore (non tutti; dipende anche

dalle condizioni ambientali)

Sono microrganismi prettamente aerobi

Possiedono un alto contenuto di G+C (60-78 %)

Producono più del 70% degli antibiotici noti

Gli attinomiceti formano colonie morfologicamente molto diversificate tra loro, di vari pigmenti;

Dal punto di vista microscopico si ha la formazione di spore di svariata forma (a spirale, a

uncino…..)

Inizialmente sono stati classificati come funghi data la presenza di ife, molto simili a quelle fungine;

tuttavia dopo ulteriori analisi sono stati classificati come batteri

Alcuni actinomiceti sono patogeni

Il microrganismo modello degli attinomiceti è lo Streptomyces coelicolor

Il ciclo vitale di uno streptomicete è molto complesso;

Una singola spora libera germina e colonizza il substrato;

Si ha la formazione di un micelio di substrato, seguito dalla formazione del micelio aereo;

Al termine si ha la divisione in setti e la successiva sporulazione la quale, una volta matura, viene

rilasciata

Essa poi è in grado di riniziare il ciclo

Il metabolita primario è una molecola fondamentale per il microrganismo; un metabolita primario

può essere un derivato del metabolismo oppure una sostanza che serve direttamente al

microrganismo; i metaboliti primari sono prodotti durante la fase di crescita

Il metabolita secondario è una molecola prodotta durante la fase stazionaria; esso serve per

proteggere la sua nicchia ecologica da eventuali microrganismi competitori; esso quindi serve come

protezione nei confronti di altri microrganismi

I vari antibiotici sono metaboliti secondari

I metaboliti seconda