Appunti del corso di biotecnologie delle fermentazioni

Appunti biotecnologie delle fermentazioni

Introduzione

I microbi giocano un ruolo importante (e a volte fondamentale) in un’infinità di processi che riguardano la produzione di beni o servizi utili per la società e per l’economia. Citazione di Waksman: non c’è campo di interesse umano dove i microbi non giochino un ruolo importante e spesso dominante.

Campi di utilizzo

• Industria
• Agricoltura
• Detergenti
• Produzione di farmaci (es. antibiotici o proteine ad uso terapeutico come l’insulina)
• Biotecnologie: applicazione di sistemi e di conoscenze biologiche per la risoluzione di problemi di vario genere in diversi campi.

I primi agenti biotecnologici sono i microbi. Le fermentazioni sono note fin dai tempi antichi; le civiltà più antiche (sumeri, egizi, antichi romani) producevano bevande alcoliche, aceto, formaggi, yogurt, pane, e altri prodotti alimentari. Tuttavia, erano sconosciuti i fenomeni con cui avvenivano questi processi; non si sapeva che dietro a tutto c’erano i microrganismi. Solo alla fine dell’800 tutto ciò divenne noto; ciò grazie a Pasteur che capì che dietro a questa infinità di processi ci sono microrganismi che attuano specifici processi.

Contributo di Pasteur

Pasteur ebbe enormi difficoltà a dimostrare che le fermentazioni erano dovute ai microrganismi e non a reazioni sequenziali “puramente” chimiche (non mediate da organismi viventi). Pasteur alla fine convinse gli altri scienziati mediante esperimenti a temperature diverse; da questi si notò che si ebbe la produzione di alcoli solo a temperature compatibili con la crescita microbica. La scoperta di Pasteur fu resa possibile dalla scoperta da parte di un certo Van Leuvenoek delle lenti per osservare i microbi. Questa scoperta rese possibile l’osservazione di cellule microbiche (lui descrisse i lieviti).

Rivoluzione industriale e fermentazioni

In questo periodo iniziò anche la rivoluzione industriale; questo è fondamentale in quanto tutti i processi fermentativi ormai noti possono essere applicati su scala industriale. In questo periodo storico avvenne anche la prima guerra mondiale; i processi diventano fondamentali per la produzione di composti chimici destinati come solventi nella produzione di esplosivi e nella produzione pesante in generale (acido lattico, citrico, acetone, etanolo, butanolo, glicerolo…). In tutti questi processi si ha la conversione delle biomasse in eccesso (scarti di altre produzioni) in prodotti chimici utili. Questi processi possono essere anche delle utili risposte nei confronti dei problemi ambientali come l’eccesso di rifiuti e la sostituzione di processi altamente inquinanti con processi eco-friendly.

Scoperta della penicillina

Prima della seconda guerra mondiale (1928) venne scoperta la penicillina. La penicillina divenne fondamentale durante la seconda guerra mondiale per curare le infezioni dei soldati. L’asse anglo-americano ebbe la possibilità di curare i propri soldati con questo antibiotico, i tedeschi non ebbero questa possibilità. La scoperta della penicillina segnò l’inizio della produzione di prodotti di fermentazione a scopo medico. La penicillina venne somministrata a pazienti senza sapere la formula molecolare di quest’ultima; solo in un secondo momento quest’ultima venne identificata. Da allora vennero scoperti un sacco di antibiotici, producibili mediante processi industriali su larga scala.

Produzione di altri farmaci

Oltre agli antibiotici, i batteri possono produrre anche altre tipologie di farmaci come antitumorali, proteine terapeutiche (insulina, prodotta da E.coli ricombinante in fermentatori a coltura sommersa dalla Genentech (questa fu la prima azienda biotech a essere quotata alla borsa americana); l’insulina in precedenza veniva estratta dal pancreas di bovini e suini; tuttavia, questa è molecolarmente differente e poteva causare allergie, inoltre varie patologie bovine e suine potevano influire sulla qualità dell’insulina stessa e potevano causare varie infezioni ai pazienti, questa procedura era inoltre costosa e con bassa resa. La produzione di insulina via microbica ha permesso di superare questi inconvenienti; ad oggi l’insulina prodotta ha alcune modifiche a livello genico che l’hanno resa più stabile in ambiente ematico), vaccini e anticorpi, prodotti per l’agricoltura (es. avermectina, utilizzata come vermicida in agricoltura e come medicinale in casi di river blindness, una patologia presente soprattutto nei villaggi africani localizzati sulle rive dei fiumi; gli scopritori che hanno caratterizzato l’avermectina hanno vinto il premio Nobel). La produzione di questi prodotti ebbe il boom negli anni '70-'80 grazie anche alle scoperte nel campo delle tecnologie del DNA ricombinante.

La produzione della birra e del vino

La birra viene prodotta dal malto tramite fermentazione alcolica mediata da lieviti; il malto in realtà non è altro che orzo germinato secco. Nei semi di orzo è contenuto amido. La fermentazione non può essere condotta sull’orzo ma sul malto. Il lievito non sa degradare e utilizzare i polisaccaridi ma impiega degli zuccheri semplici come disaccaridi e monosaccaridi. Durante la germinazione si ha la produzione di amilasi che degradano l’amido producendo zuccheri semplici; così facendo gli zuccheri semplici sono impiegabili dal lievito.

Anche nella produzione del vino bisogna porre a contatto il lievito con gli zuccheri semplici; il lievito vive naturalmente sugli acini d’uva; dopo aver pestato gli acini si ha il contatto diretto del lievito con gli zuccheri semplici contenuti negli acini ed è quindi possibile la fermentazione alcolica.

La produzione del pane

Il pane viene prodotto grazie alla fermentazione operata dai lieviti; la farina impastata con acqua e lievito, con eventuale aggiunta di zucchero per far partire la fermentazione, fornisce l’amido per i lieviti. La CO₂ prodotta resta imprigionata nell’impasto, ciò causa il rigonfiamento e conferisce al pane la sua caratteristica sofficità. I lieviti per la panificazione appartengono alla specie Saccharomyces cerevisiae e derivano storicamente dai ceppi utilizzati in birreria. Attualmente il lievito viene prodotto in modo industriale per soddisfare le accresciute esigenze di panificazione.

Produzione dei derivati del latte

La produzione dei derivati del latte si basa sull’utilizzo dei batteri lattici; nella produzione dei formaggi intervengono due passaggi fondamentali: la coagulazione delle proteine del latte e la successiva maturazione per i formaggi semistagionati e stagionati. La coagulazione avviene grazie a un enzima, la rennina, estratto dallo stomaco dei vitelli. Ad oggi la rennina è prodotta in cellule microbiche modificate mediante tecnologie del DNA ricombinante. Questo enzima coagula il latte dando origine alla cagliata. La cagliata è poi sottoposta a maturazione in centinaia di modi differenti; ciò consente di ottenere formaggi differenti.

Alla fine del XIX secolo le fermentazioni non producono più solo composti ad uso alimentare ma producono etanolo, acido acetico, butanolo... Questi processi di fermentazione microbica erano condotti in sistemi non isolati; i prodotti di fermentazione assicuravano un certo grado di sterilità, permettendo eventuali contaminazioni microbiche esterne. I cibi fermentati quindi si conservano più a lungo; ciò è dovuto proprio alla presenza di prodotti di fermentazione con un certo grado di batteriostaticità. In questi casi quindi non si prestava troppa attenzione alle condizioni di sterilità. Caso contrario nel caso in cui il prodotto debba essere impiegato in campo medico; in questo caso le condizioni devono essere sterili.

La produzione di acido citrico

Alla fine dell’800 questo acido veniva estratto dai limoni e dai bergamotti; questi processi di estrazione erano costosi. Negli Stati Uniti un ricercatore si rese conto che l’acido citrico si poteva produrre da un fungo, a costi minori e rese maggiori. Dal 1930 la produzione di acido citrico avviene per fermentazione in coltura axenica mediata da una miscela di Aspergillus e Penicillium in coltura sommersa. L’acido citrico è impiegato in ambito alimentare come conservante, in cosmesi e nell’industria cosmetica (è antiossidante).

La produzione di penicillina

All’inizio la produzione su larga scala di penicillina avveniva in bottiglie piatte contenenti il terreno agarizzato e il Penicillium. Tuttavia, anche in questo modo le quantità erano insufficienti (problema del supply) in quanto i trattamenti con penicillina dovevano essere continui, per almeno una settimana. Per questo fecero un accordo di produzione con gli americani che avevano già scoperto il concetto di coltura sommersa (applicata nella produzione di acido citrico). Gli americani quindi applicarono la tecnica della coltura sommersa alla produzione della penicillina. Da allora la maggior parte dei processi di fermentazione avviene in reattori a coltura sommersa in classical stirred tank reactor e in condizioni di assoluta sterilità.

La produzione di enzimi industriali

Nel 1894 si ebbe la produzione del primo enzima a livello industriale; si trattava di un’amilasi, utilizzata inizialmente in ambito farmaceutico per problemi di intolleranza e digestione. Nel 1915 si iniziò a utilizzare le proteasi nel campo dell’industria dei detergenti; queste proteasi sono utilizzate tutt’ora. Nel 1965 iniziò la produzione industriale di rennina (è una proteasi acida) mentre nel 1967 iniziò la produzione della glucosio isomerasi per la produzione di fruttosio a partire dal glucosio; questo enzima è utilizzato soprattutto nell’industria dei succhi di frutta dato che il fruttosio ha un maggior potere dolcificante.

Dimensioni dei reattori

Esistono reattori per i casi studio; essi sono caratterizzati dal piccolo volume. Esistono anche reattori su scala pilota che garantiscono un maggior volume operativo. Questi reattori sono importanti per quanto riguarda lo scaling up del processo ossia passare da uno studio di laboratorio a una produzione industriale; per questo passaggio sono necessari quindi bioreattori di differenti volumi via via sempre maggiori. Ogni prodotto ha un suo volume operativo ideale.

Tecnologie del DNA ricombinante

Con l’introduzione delle tecnologie del DNA ricombinante si rivoluzionò il settore delle biotecnologie delle fermentazioni; queste metodiche permisero di scoprire nuovi prodotti (proteine ricombinanti) e di aumentare la produzione dei prodotti già noti (mediante l’ottimizzazione dei processi di produzione). La prima proteina ricombinante approvata fu l’insulina nel 1982; di seguito vennero approvati moltissimi prodotti quali l’ormone umano della crescita, l’alfa interferone, l’eritropoietina (stimola la produzione di eritrociti, usato come doping nello sport).

Riassunto e classificazione delle biotecnologie

Per riassumere: le biotecnologie hanno un impatto significativo in vari settori produttivi e vengono divise per colore:

• Biotech rosse: legate alla produzione di prodotti impiegati in farmaceutica.
• Biotech verdi: legate alla produzione di prodotti impiegati in agricoltura (piante transgeniche, produzione di biopesticidi…).
• Biotech bianche: legate alla produzione di prodotti impiegati in ambito industriale; impiegate per sviluppare processi eco-friendly e con rese maggiori (ad esempio sostituendo processi chimici tradizionali con processi biotech più ecosostenibili e meno costosi).
• Biotech bianche II: legate al settore energetico per la produzione di biofuels e biogas.

Definizione di fermentazione

Definizione fermentazione: inizialmente data da Pasteur, riguarda esclusivamente i processi anaerobici. In realtà molti prodotti delle biotech classiche sono prodotti mediante processi aerobi. In termini biochimici una fermentazione è un processo in cui le ossidoriduzioni scaricano elettroni su un intermedio metabolico (e non sull’ossigeno come accade nella respirazione cellulare). Tuttavia, molte fermentazioni hanno come accettore finale l’ossigeno, quindi questa definizione è fuorviante. Dalla produzione della penicillina in poi, il termine fermentazione si riferisce a processi microbici su larga scala eseguiti in un bioreattore sia in condizioni aerobiche che in condizioni anaerobiche.

Classificazione dei processi fermentativi

In base alla tipologia del prodotto si possono classificare i vari processi:

• Processi in cui il prodotto è la biomassa stessa del microrganismo (produzione del lievito per la panificazione, il quale sarà venduto a panetti per i panifici o produzione di batteri lattici nelle produzioni casearie).
• Processi in cui il prodotto di interesse è prodotto dalla cellula microbica in condizioni ideali per la produzione della molecola di interesse (produzione di etanolo, antibiotici).
• Bioconversioni in cui la cellula microbica fa da catalizzatore, facilitando la conversione di un substrato in una molecola di interesse (es. reazioni di idrossilazione su steroidi, queste reazioni sono stereo e regio specifiche ovvero introducono gruppi funzionali in determinate posizioni).

Per tutti questi processi servono dei “microrganismi industriali”. In natura vi sono degli specialisti metabolici in grado di generare determinati prodotti con rese modeste e in coltura su larga scala. Questi specialisti metabolici sono in seguito mutati e manipolati geneticamente in modo da ottenere un rilevante aumento di produzione (vengono trasformati in cell factory). Ad oggi, non vi sono processi industriali in cui si utilizzano ceppi batterici wild type. Questi microrganismi sono poi conservati in collezioni pubbliche e private; le collezioni private contengono mutanti ad alte rese industriali e sono gelosamente protetti da aziende.

Caratteristiche dei microrganismi industriali

Un microrganismo industriale deve avere le seguenti caratteristiche:

• Essere dotato del metabolismo desiderato, ossia deve essere in grado di produrre il prodotto voluto.
• Facilmente coltivabile in terreni poco costosi e su larga scala.
• Devono possedere alte rese di produzione.
• Essere geneticamente manipolabili.
• Non deve essere patogeno (questo punto non sempre è rispettabile, ad esempio nella produzione di insulina da E.coli; alcuni ceppi di E.coli sono patogeni).

Caratteristiche dei microrganismi

I microrganismi sono organismi le cui dimensioni sono sotto il potere di risoluzione dell’occhio umano. I microrganismi possono essere eucarioti (alghe, protozoi e funghi), procarioti (batteri e archea) e acellulari (virus). Alghe e archea sono importanti nella produzione di sostanze come idrogeno e metano. La biomassa sulla terra è costituita per il 60% da biomassa microbica tuttavia solo l’1% delle specie microbiche è identificato e coltivato, il resto è inesplorato; ciò a causa del fatto che moltissimi microrganismi non sono coltivabili in condizioni facilmente ottenibili in laboratorio e perciò non sono facilmente identificabili. Questo problema è risolto mediante le nuove tecniche di metagenomica. Il 99% dei microrganismi non coltivabili è una possibile fonte di geni, enzimi e prodotti utilizzabili in innovativi processi biotecnologici. I microbi sono particolarmente interessanti nelle biotecnologie in quanto l’evoluzione li ha fatti adattare a una varietà enorme di condizioni ambientali diverse, con differenti meccanismi metabolici che gli permettono un veloce e facile adattamento in condizioni di temperatura, di pH, di salinità e di pressione proibitorie per altri organismi.

Tipologie di prodotti

Le varie tipologie di prodotti:

• Biomassa
• Prodotti del metabolismo anaerobio (metanolo, acido lattico, acetone e butanolo)
• Prodotti da ossidazione incompleta (aceto)
• Metaboliti primari (amminoacidi, acidi grassi, nucleosidi)
• Metaboliti secondari (antibiotici, insetticidi, antitumorali)
• Enzimi e proteine in generale
• Vaccini polisaccaridi

Tutti questi prodotti hanno un business di miliardi di dollari all’anno!

I vari modelli metabolici

I vari modelli metabolici differiscono per:

• Dove viene ricavata energia
• Dove viene ricavato il carbonio
• Dove vengono scaricati gli elettroni

I due modelli metabolici principali sono quelli di piante e animali; le prime sono fotoautotrofe mentre i secondi sono chemioeterotrofi. Chemio: prendono energia da composti organici pre-esistenti (mediante catabolismo di fonti organiche). Etero: ricavano gli scheletri carboniosi da molecole organiche dopo un catabolismo ossidativo. Nel metabolismo chemioeterotrofo gli elettroni vengono scaricati o sull’ossigeno o sul piruvato (con produzione di acido lattico); questo può essere quindi o respiratorio o fermentativo. Foto: prendono energia dalla luce solare. Auto: ricavano gli scheletri carboniosi da molecole inorganiche quali la CO₂. I microrganismi, al contrario del “mondo macroscopico” possono combinare le varie tipologie metaboliche; esistono quindi:

• Chemioeterotrofi
• Chemioautotrofi
• Fotoeterotrofi
• Fotoautotrofi

La maggior parte dei microrganismi industriali sono chemioeterotrofi con meccanismo aerobio o anaerobio.

Alcuni concetti utili nelle fermentazioni industriali

Processo di upstream: tutte le operazioni riguardanti il biologico (crescita e produzione del prodotto). Processo di downstream: tutte le operazioni riguardanti il recupero del prodotto; comprende varie metodiche e protocolli prettamente chimici. Il confine tra i due è detto harvest. La composizione del terreno dipende ovviamente dalle esigenze metaboliche del microrganismo. I processi fermentativi sono svolti in coltura liquida; le colture solide sono svolte solo inizialmente per riconoscere, isolare e coltivare in coltura pura il microrganismo (produzione di colture pure).

La fermentazione base

I microrganismi maggiormente utili dal punto di vista delle fermentazioni industriali sono i chemioeterotrofi microbici. Questi microrganismi sono caratterizzati dal fatto che possono essere aerobi (nel caso in cui l’accettore finale di elettroni è l’ossigeno) o anaerobi (nel caso in cui l’accettore finale di elettroni è un intermedio metabolico). Oltre ad essere aerobi obbligati e anaerobi obbligati, i microrganismi possono essere microaerofili.