Appunti delle lezioni di Biotecnologie - Fermentazioni industriali

PRODUZIONE DI ACIDI ORGANICI

Gli acidi organici possono derivare dal metabolismo aerobio o anaerobio. Da quello aerobio si generano come intermedi del ciclo di krebs, non sono solitamente accumulati nell'acoltura. Dal metabolismo anaerobio, gli acidi saltano fuori a partire dall'acido piruvico. Non sono intermedi ma, prodotti finali solitamente spontaneamente accumulati.

Resa di conversione è rapporto tra quanti grammi di prodotto ottengo/grammi di substrato che utilizzo. La resa è un numero puro che va da 1 a 0. Più la resa si avvicina allo 0 e più ottengo quasi niente prodotto.

ACIDO LATTICO (domanda di esame su acido organico)

L'acido lattico è stato uno dei primi acidi organici, è stato messo a punto un processo biotecnologico a scala industriale. Le prime produzioni sono del 1950. Può essere prodotto in forma D, L, DL. Può essere prodotto per via chimica con reazioni in sequenza, ma con questo metodo si ottiene la forma

racemica DL che va poi separata; invece, i microrganismi producono la forma pura in quanto steroselettivi.

Trova impiego acidulante in diversi settori ma, in questi utili anni, si ha una forte spinta verso la produzione di un polimero biodegradabile e come ammonio lattato nell'alimentazione animale.

Il gruppo microbioco che produce acido lattico ovviamente è quello dei batteri lattici, ma se dobbiamo produrre esclusivamente l'acido lattico, tra tutti i tipi di batteri lattici scegliamo gli omofermentanti che producono solo acido lattico.

Bisogna guardare il biochimiso: l'acido l'attico deriva dalla glicolisi che fanno i batteri lattici. Si parte dal glucosio, passano per la glicolisi e arrivano all'acido piruvico (produzione di 2 ATP e NADH). Il NADH deve tornare a NAD+ e quindi gli idrogeni vengono spostati dal NADH alla molecola di piruvato e si ottiene così il lattato.

Da una mole di glucosio ottengo 2 moli di acido lattico.

La resa è molto alta.

Arriva fino al 95% (se metto 100g di glucosio ottengo anche 92-95g di acido lattico). I microrganismi devono percorrere molte volte la glicolisi per crescere, in questo modo ottengo tanto acido lattico e poca biomassa perché la resa energetica di questa via è molto bassa (solo 2 ATP).

Dal punto di vista industriale: conosciamo 2 microorganismi fermentanti famosi (lactobacillus e streptococco), malactobacillus è più resistente perché inizia il suo lavoro più tardi e dura più tempo. Questo fa sì che possa produrre più acido lattico e resiste di più all'abbassamento del pH.

A livello industriale prepariamo un terreno colturale molto ricco, come fonte di carbonio si usa glucosio (150g/l); l'inoculo è il 3-5% di una coltura; lavoriamo a 40-45°C (termofili); teniamo il pH tra 5,5-6 (impostiamo un setpoint di pH nel reattore: quando si produce acido il pH scende e quando arriva al setpoint si attiva un controllo di pH in

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modo da non farlo scendere oltre questi valori).In queste condizioni ottiene acido lattico con una resa di fermentazione di 135g/l), quindi di conversione 0,9-0,95.

Correzione di acidità: tamponamento con CaCO3 (carbonato di calcio, calcare) che è una polvere insolubilea ph neutro, mentre è solubile a ph acido. Si può aggiungere carbonato fino a quando il ph non si abbassa, quando la polvere si solubilizza va a tamponare l'acidità e si ottiene il lattato di calcio. Se il procedimento è giusto, a fine processo la polvere scompare e il carbonato di calcio è completamente solubilizzato.

Essendo polvere non si può aggiungere nel fermentatore, ma va mescolata nel terreno. Un'alternativa è aggiungere ammoniaca che è liquida e va aggiunta in base alla risposta del fermentatore, quando il ph scende si attiva una valvola che fa entrare goccia a goccia idrato di ammonio e si va a formare ammonio lattato. Generalmente il

può sapere perché vi è il segreto biotecnologico. Si utilizzino due ceppi: Aspergillus niger e Yarrowia lipolytica

Il biochimismo: per accumulare il citrato bisogna bloccare l'enzima aconitasi che lo trasforma nel metabolita successivo. Ma se blocco totalmente l'enzima, il ciclo di krebs si blocca e il micro non cresce più. Bisogna quindi limitare l'enzima ma non bloccarlo totalmente. Bisogna mediare tra la produzione del micro e il suo consumo.

Si usa una fonte di carbonio prontamente assimilabile che è il melasso (residuo del processo di produzione del saccarosio).

Bisogna però, controllare i livelli di manganese e zinco perché l'aconitasi ha bisogno di questi metalli per essere attiva. Se limitiamo questa concentrazione, l'enzima lavora male.

Quando blocchiamo una via metabolica e accumuliamo un intermedio, questo eccesso si ripercuote all'inizio e della via metabolica; il citrato se accumulato tende

L'allestimento di colture in vassoi, all'interno viene inserito un terreno colturale liquido che contiene sempre una fonte di carbonio e di azoto e acqua. Bisogna avere circa 160g per ogni litro di melasso, viene tutto caricato a inizio fermentazione perché altrimenti è difficile aggiungere ingredienti al vassoio. Si aggiunge anche Mn in bassa concentrazione (0,005-0,5 mg/L). Il pH iniziale di 6,5 favorisce la germinazione poi scende a 1,5.

I vassoi vengono inseriti in camere uno sopra l'altro dove viene immesso il vapore e si ha sterilizzazione a temperature superiori ai 100°C. Quando poi abbassiamo la temperatura a 30°C nella camera iniettiamo uno spray di spore di aspergillus niger che poi tendono a depositarsi sopra al vassoio. Arrivano sul terreno colturale e lo colonizzano.

Possiamo distinguere la trofofase nella quale si sviluppa il micro e l'idrofase quando si produce l'acido. Il processo può durare da 5 a 20.

giorni.L'acido si accumula nella parte liquida che sarebbe il punto della coltura più a contatto con l'ossigeno.La resa di conversione è il rapporto tra il prodotto formato/substrato utilizzato e qui è 0,7-0,8 (70-80%).Nei vasoi la resa di fermentazione si misura in Kg/m^2 ed è intorno a 1,2-1,5.A fine processo, i vassoi che sono paralleli al terreno, si inclinano da un lato e tutta la parte liquida percolada un lato e viene recuperata. A volte però dell'acido citrico rimane intrappolato nella parte del miceliosottostante, quindi con una canna di acqua si lava il micelio, si strizza e si recupera il resto dell'acido citrico.Il processo di superficie è condotto anche in coltura solida li impianti che utilizzano questi tipi di coltura sonocomunque piccoli.Coltura sommersa in fermentatorià la coltura è comunque liquida ma è sommersa in fermentatore ed èagitata e aerata.È un metodo

più comodo perche: 11- Valutazione parametri di processo: in coltura in vassoio non possiamo modificare i parametri del terreno. Perché produrre acido citrico? L’acido trova impiego in moltissimi settori come quello alimentare dove ha funzione di: acidulante; antiossidante (stabilizzante di colore/sapore/aroma); inibisce alcuni microorganismi; correttore ph; riduttore dolcezza. Si usa nel settore farmaceutico e tecnico. Si parte dal terreno colturale sterilizzato, la precoltura arriva allo stadio di produzione, scarichiamo il fermentatore e bisogna separare la biomassa, si scarta il micelio e si lavora sulla parte liquida.

Yarowia lipolitica è un lievito con una forma un po’ strana e quando cresce rende il terreno colturale torbido. Viene utilizzata perché è capace di produrre acido a partire da paraffine (ingredienti composti solo da carbonio e idrogeno). Il processo infatti è allestito in coltura sommersa, impiegando n-paraffine. Queste paraffine

Sono un residuo della preparazione del petrolio. Quando il costo delle paraffine è minore rispetto a quello dei residui agroalimentari, si utilizzano le paraffine. Il terreno colturale prevede la presenza di questi alcani a 100g/L. Il pH varia da 5 a 5,6 e l'incoculo è del 10% v/v. Le paraffine vengono degradate a due a due, si tagliano le due unità di acetile che diventano acetil coA ed entrano nel ciclo di Krebs. L'acido citrico presenta anche ossigeno, ma in questo substrato non c'è, quindi il microorganismo deve recuperarlo dall'aereazione. Pertanto, le paraffine vengono definite substrati ridotti e per produrre acido citrico è necessario recuperare queste molecole di ossigeno. La coltura viene svolta in modalità batch, semicontinua o continua in 5-6 giorni. La resa di fermentazione è di 130-140g/L, grazie all'ossigeno incorporato nella molecola. Yarrowia non trasforma solo l'acido citrico, ma la metà del prodotto può essere acido.