Microbiologia applicata - Appunti completi ed esempi di esercizi

TRASFORMAZIONE BATTERICA

Trasformazione mediata da DNA, è possibile trasformare con DNA lineare o circolare:

• Lineare: alcuni batteri sono in grado di assumere frammenti di DNA nell'ambiente. Il DNA viene importato nella cellula batterica come singola elica e il DNA entrato può essere integrato stabilmente nel genoma della cellula o non essere incorporato e quindi degradato. I nucleotidi sono usati in processi di trascrizione, quindi o trasformazione stabile o trasformazione che non ha avuto successo.
• DNA plasmidico circolare: il DNA plasmidico viene attivamente trasportato all'interno della cellula batterica e qui o il plasmide replica in modo autonomo (trasformazione stabile) oppure, se il plasmide non è in grado di replicarsi, lo perdiamo e quindi la trasformazione non ha avuto successo.

Organismo in cui è stata evidenziata per la prima volta il trasferimento orizzontale è Streptococcus pneumoniae, agente eziologico della polmonite batterica.

La competenza può riguardare tutte le cellule di una coltura o solo alcune e inoltre la competenza può essere indotta da uno specifico peptide detto fattore di competenza. Tra gli organismi naturalmente trasformabili abbiamo Haemophilus e Neisseria tra i Gramnegativi, Streptococcus e Bacillus nei positivi. Tra negativi e positivi la trasformazione è differente perché servono strutture diverse: nei positivi il DNA deve passare solo la membrana plasmatica. Una volta passata, ci sono recettori che legano il DNA e delle DNAsi che, se il DNA è troppo grosso, lo frammentano. Poi, proteine operano il meccanismo di trasporto: solo un'elica del doppio filamento entra nella cellula batterica, l'altra viene degradata, quindi il DNA per poter funzionare deve essere a doppia elica. Nei negativi, il DNA deve passare anche la membrana esterna. Qui ci sono recettori che fanno passare e eventualmente tagliano. Entra a doppia elica nel periplasma in strutture dette trasformasomi.

Viene importato nel citoplasma a singola elica e l'altra elica viene degradata, i nucleotidi ottenuti dalla degradazione sono importati da meccanismi specifici per acquisire comunque materiale che può essere utile per la crescita dei batteri.

Nei negativi abbiamo competenza costitutiva o inducibile, il DNA deve essere sempre a doppia elica, ma in molte specie c'è una caratteristica necessaria in più: il DNA deve contenere specifiche sequenze per poter essere trasformato (sequenze DUS), la sequenza di queste DUS è specie specifica, quindi sono specie più selettive sul DNA da importare. Queste sequenze sono presenti circa un centinaio di volte nel DNA di una specie.

Significato biologico della trasformazione naturale: variabilità genetica, ma usato anche come meccanismo che aiuta nella riparazione di danni al DNA, può essere anche utile come meccanismo per acquisire nutrienti perché viene acquisito DNA degradato riutilizzato.

Attraverso questo avviene trasferimento di materiale genetico. Come ci si è resi conto di questo meccanismo? Negli anni '40, due scienziati usavano due diversi ceppi di escherichia coli con auxotrofie diverse (uno A per metionina e biotina, uno B per treonina, leucina e tiamina). Quando si mescolavano i due ceppi erano in grado di trovare ceppi diventati prototrofi (non necessitano di fattori di crescita). Il ceppo A viene fatto crescere in terreno permissivo e seminato su terreno minimo, sul terreno minimo non cresce nessuna colonia, così come se prendiamo il ceppo B e lo seminiamo su terreno minimo, non cresce nessuna colonia. Invece se mescoliamo i due ceppi e li seminiamo su terreno minimo, anche se con frequenza bassa, è possibile ottenere colonie prototrofe che quindi hanno recuperato tutte le auxotrofie e non necessitano di fattori di crescita. La comparsa di queste colonie prototrofe non può essere dovuta a mutazione spontanea perché la frequenza

La frequenza di mutazione di ritorno al fenotipo selvatico per due diversi marcatori è molto bassa. L'esperimento di Ledberg e Tatum ha dimostrato che mescolando questi due ceppi si ottengono degli 'exconiuganti' o 'ricombinanti' prototrofi. Hanno dedotto quindi che non si tratta di trasformazione perché hanno dimostrato che è necessario il contatto fisico tra i due centri. Inoltre, hanno scoperto che, come negli eucarioti, la coniugazione avviene tra microorganismi con polarità sessuale diversa (donatore e ricevente del materiale genetico, questo in realtà avviene anche nella trasformazione dove abbiamo una cellula che funge da ricevente e una da donatore). Hanno dimostrato che non si tratta di trasformazione e che serve il contatto fisico facendo un esperimento in cui i due ceppi sono separati da una membrana che consente il passaggio di metaboliti e terreno tra i due ceppi, ma non consente il contatto fisico tra i batteri. In questo caso, seminando i due ceppi non si ottengono ricombinanti.

Invece dimostrano che il trasferimento è polarizzato (donatore e ricevente) lo dimostrano con ceppo donatore sensibile all'antibiotico streptomicina e auxotrofo per 3 marcatori, ricevente resistente a streptomicina e auxotrofo per 2 marcatori, seleziono (la sensibilità all'antibiotico, quindi i marcatori di quello sensibile posso vedere se si trasferiscono o no, se seleziono la resistenza vedo invece i marcatori di quella) per il ceppo ricevente come detto e metto streptomicina, ho ricombinanti prototrofi, se invece uso il resistente come donatore allora non ho ricombinanti. Un batterio donatore può trasmettere con alta frequenza ad un batterio ricevente la capacità di fungere da donatore, viene trasmesso il fattore di fertilità F che viene definito come un elemento infettivo, è un plasmide e i batteri che lo hanno sono batteri che sono definiti F+ e possono funzionare da donatori, invece che funzionano da riceventi non hanno il fattore F.

La cellula donatrice trasferisce il suo materiale genetico alla cellula ricevente. Un altro plasmide coniugativo è il plasmide R, che contiene una serie di marcatori per la resistenza agli antibiotici (resistenza alla streptomicina, sulfamidico, tetraciclina, ecc.), consentendo il trasferimento di resistenza a 4 antibiotici diversi al batterio ricevente. I plasmidi sono i principali responsabili della trasmissione della resistenza agli antibiotici.

La presenza del plasmide F fa sì che la cellula donatrice abbia l'informazione per sintetizzare il pilus sessuale, che entra in contatto con la cellula ricevente. Successivamente, il pilus si ritrae e depolimerizza, permettendo alle due cellule di attaccarsi tramite questa struttura proteica.

A questo punto, si forma un poro di comunicazione tra le due cellule donatrice e ricevente. Una volta formato il poro, la struttura si stabilizza e le cellule aderiscono strettamente, permettendo l'inizio del trasferimento.