Microbiologia applicata - Appunti completi ed esempi di esercizi

Microbiologia applicata

CdL in chimica e tecnologia farmaceutiche, anno scolastico 2022-2023, prof. Alessandra Polissi

Lezione 1

La cellula

La cellula è l'unità fondamentale in cui è organizzata la materia vivente. Le cellule possono essere:

• Eucariotiche (animali e vegetali), complesse e con nucleo, i vegetali hanno anche parete vegetale
• Procariotiche

Cellule eucariotiche sono di organismi pluricellulari (animali, piante), anche di organismi unicellulari (protozoi, funghi, alghe, muffe). Le differenze tra procarioti ed eucarioti sono il nucleo e l'organizzazione del materiale genetico, la divisione cellulare, la parete cellulare (nei vegetali e nei procarioti, ma diversa). I procarioti mancano di mitocondri, cloroplasti, Golgi, reticolo endoplasmatico, ma non mancano le loro funzioni, sono localizzate in altre strutture. Diversi anche apparati per replicazione, trascrizione e traduzione, perché ci sono inibitori specifici di questi processi nei procarioti (antibiotici) e non negli eucarioti.

Procarioti

I procarioti sono divisi in: batteri (Bacteria) e archei (Archea), quindi non derivano da progenitore comune (non sono un gruppo filologicamente omogeneo).

Schema: la radice dell'albero è antenato comune, poi linea che porta a eucarioti moderni pluri o unicellulari, altra linea da origine a procarioti (tutti unicellulari) con linea dei batteri e degli archea. Gli archea sono distanti dai batteri perché sono un gruppo che evolve dalla linea evolutiva che ha dato origine agli eucarioti. Gli archea hanno avuto periodo di coevoluzione comune con gli eucarioti.

Bacteria vs Archea

I batteri sono il gruppo più numeroso (più specie note), i batteri includono i procarioti più importanti dal punto di vista medico (non conosciamo archea patogeni, ci sono antibiotici che inibiscono processi nei batteri, ma non lo fanno negli archea), i batteri hanno poche specie che vivono in ambienti estremi (gli archea vivono in habitat estremi in termini di pressione, temperatura), nessuna specie nota di batteri produce metano (gli archea sì), i batteri includono tutte le specie batteriche che fanno fotosintesi, importanti dettagli molecolari differenti (composizione membrana plasmatica e parete, apparato trascrizionale e traduzionale).

Microbiologia

La microbiologia è lo studio di organismi microscopici, procarioti e eucarioti, oltre che ai virus, che però non sono cellule, non sono viventi, ma devono infettare un'altra cellula per riprodursi.

Ruota attorno a due temi: scienza di base con obiettivo di comprendere i fenomeni della vita (prima scoperti nei procarioti e poi negli eucarioti), scienza applicata perché le nozioni di base che ricaviamo possono essere adattate alle necessità dell'uomo.

Quindi comprendere il funzionamento dei microrganismi patogeni e inventare strategie terapeutiche e poiché ci sono microrganismi benefici possiamo sfruttarli a nostro vantaggio o imparare a difenderci da essi.

Dimensioni medie di cellula batterica bastoncellare: lunghezza da 1 a 5 micron, larghezza circa 1 micron. Ce ne sono di molto piccoli (virus batterici "batteriofagi") o più grandi (lievito, Streptococco) o molto grandi (fino a 1 cm: Tiomargarita namibiensis, il nome è genere e specie).

La microbiologia consapevole nasce dopo l'invenzione del microscopio ottico. L'invenzione del microscopio ottico è dovuta a un mercante di stoffe, van Leeuwenhuck che doveva capire perché alcune stoffe erano danneggiate, si accorge che sui tessuti erano presenti piccoli individui chiamati animacules "piccoli animali", numerosissimi e molto diversi tra loro, non visibili ad occhio nudo.

Teoria della generazione spontanea

C'era teoria della generazione spontanea delle forme viventi, superata grazie a Redi, Spallanzani e definitivamente Pasteur. Diceva che organismi viventi possono generare da materiale organico, poiché ad esempio se lasciamo cibo all'aria questo va incontro a putrefazione e se guardiamo al microscopio è pieno di batteri o larve e germi, per questo si pensava ci fosse generazione spontanea: Redi mostra che le larve nascono dalla carne solo quando le mosche lasciano uova, più difficile dimostrarla per i procarioti: Pasteur lo fece con le fiasche a collo di cigno.

Prende liquido organico non sterile nella fiasca, con la fiamma allunga il collo della fiasca, sterilizza per bollitura (elimina qualsiasi tipo di forma vivente), con il collo aria e polvere che contengono microorganismi non riescono a risalire quindi il materiale resta sterile, se invece mettiamo liquido sterilizzato a contatto, in breve tempo si sviluppano microorganismi nel liquido che diventa torbido (la torbidità di un liquido può essere usata per seguire la crescita di una popolazione microbica).

Pasteur e la fermentazione

Pasteur capisce anche che la fermentazione (trasformazione zucchero in alcol) non è un processo chimico ma biologico mediato da microorganismi (Egizi e Romani bevevano vino e birra, processo di riscaldamento che si pensava trasformasse chimicamente lo zucchero in alcol), Pasteur chiamato in azienda vinicola e si accorse che c'era microrganismo contaminante, trasformava lo zucchero non in alcol ma acido lattico rendendo il vino acido, con riscaldamento il contaminante moriva (pastorizzazione, usata oggi per produzione di latte o succhi di frutta).

Pasteur studia anche causa di malattie infettive, alcune causate da microorganismi, studi affiancati da Koch. Inoltre Pasteur si accorge che microorganismi "attenuati" (ridotta patogenicità) possono essere usati per vaccinare (indurre risposta immunitaria nell'ospite, favorendo produzione di difese specifiche contro quel microorganismo).

Koch e i suoi studi

Koch premio Nobel per la medicina nel 1905, isola l'agente responsabile della tubercolosi, sviluppa tecniche di coltivazione dei microorganismi e il concetto di coltura pura (originata da un solo tipo di batterio, altrimenti non possiamo fare studi che associano caratteristiche a un particolare tipo di batterio).

Formula i postulati di Koch, che per la prima volta razionalizzano il nesso causa effetto tra un microorganismo e una determinata malattia, se sono rispettati i 4 postulati, quell'agente patogeno è responsabile di quella malattia (presente in tutti i casi e assente nei sani, deve essere isolato e posto in coltura generando una popolazione cellulare omogenea che se inoculata deve far comparire la malattia nel soggetto sano e se reisolato troviamo ancora il patogeno).

Altri scienziati

Altri 2 scienziati (Winogradsky e Beijerinck) comprendono ruolo dei microorganismi nell'ambiente, responsabili di cambiamenti climatici, fondamentali nei cicli biogeochimici, sono in comunità di microorganismi e possono interagire con essi e introducono il concetto di simbiosi. Studiano i microorganismi nell'ambiente che non causano malattie. Uno sviluppa terreni di arricchimento con cui vengono isolati i batteri azoto fissatori. L'altro isola i batteri autotrofi e chemiolitotrofi.

I microorganismi sono stati fondamentali per passare dalla biologia di base a quella molecolare: Griffith scopre la trasformazione, grazie a cui si capisce che il DNA è materiale ereditario. Molti ricercatori lavorano su Escherichia Coli, scoprendo struttura di DNA, RNA e proteine.

Nel 1929 Flemming produce il primo antibiotico come prodotto di un microorganismo (penicillina). Si scopre la possibilità di mutanti batterici (i batteri rispondono alle stesse regole di genetica e Darwinismo degli eucarioti).

Nasce nel 1944 la biologia molecolare perché introduciamo materiale genetico estraneo in un organismo batterico, nasce poi l'ingegneria genetica nel 1973 tramite gli enzimi di restrizione con cui si può tagliare il DNA in alcune porzioni specifiche. Nel 1978 si esegue il sequenziamento completo di un batteriofago, nel 1985 si scopre la PCR con cui si può amplificare qualsiasi sequenza di DNA con alte temperature.

Nel 1995 nasce l'era genomica: diventano automatiche le tecniche di sequenziamento, si sequenzia il genoma di un organismo e viene assemblato. Dal 2000 siamo nell'era post genomica, con analisi trascrittometriche e proteomiche per descrivere fenomeni biologici.

Forme e dimensioni dei batteri

La maggior parte dei batteri ha dimensioni tra 1 e 2 micron. Possono avere forme diverse: cocchi (tondeggianti), bastoncelli, spirilli (virgola), spirochete (ondulati e rigidi perché all'interno ci sono filamenti come un primitivo esoscheletro), prostecati (hanno prolungamenti "prosteche" che consentono ai batteri di aderire alle superfici solide), filamenti (cellule separate le une dalle altre ma si sviluppano a nastro), ife.

Molti batteri hanno forma tondeggiante o bastoncellare, non si riconoscono sulla base della forma. I batteri possono trovarsi isolati o in aggregati multicellulari: colonie, miceli o biofilm. L'aggregazione in colonie si osserva quando si coltivano in laboratorio e si seminano su un terreno solido, cresce e forma una colonia, con la colonia si vedono facilmente.

Il biofilm è un altro tipo di aggregato multicellulare, non tipico di tutti i batteri, ma ristretto solo a un piccolo gruppo, ha importanti ripercussioni dal punto di vista medico: sono meno facilmente aggredibili dagli antibiotici: il biofilm è formato da esopolisaccaridi secreti che racchiudono i batteri proteggendoli dalle condizioni avverse, tra cui gli antibiotici. Il biofilm è adesivo, i batteri aderiscono quindi a superfici biotiche (uomo) o abiotiche. Es: la Legionella cresce formando biofilm in ambienti caldi e umidi come le tubature, sono ambienti difficili da eradicare, provoca malattie respiratorie come polmoniti soprattutto in individui immunodepressi.

Oppure i batteri crescono formando particolari aggregati caratteristici di poche cellule che ci fanno identificare il batterio, es: diplococchi, formati da aggregati di due cellule; anche le sarcine. La morfologia del batterio ci dice poco, vanno analizzate proprietà fisiologiche e morfologiche crescendolo in coltura pura.

Esempi di batteri

• Brucella abortus, Gram negativo, patogeno, infetta il bestiame provocando aborti.
• Anabaena, filamentoso, in grado di fissare l'azoto in cellule specializzate dette eterocisti, il metabolismo fotosintetico avviene in cellule normali e nelle eterocisti la fissazione dell'azoto.
• Enterococcus faecium, è un commensale (occupa una serie di distretti corporei in cui vive in equilibrio con noi, abitano con noi e ci aiutano in una serie di funzioni), in alcune condizioni diventa patogeno opportunista, cioè batterio che diventa patogeno solo in alcune condizioni (es: cambiare distretto oppure trae vantaggio da momentanee defiance di distretti normalmente sterili).
• Staphylococcus aureus, patogeno, causa infezioni in diversi distretti corporei e in alcuni individui fa parte della normale flora batterica del distretto naso faringeo, se cambia localizzazione diventa patogeno. Quando è seminato in piastra forma colonie con aspetto dorato perché produce pigmento durante la crescita.
• Streptococcus pyogenes, causa faringiti e tonsilliti tipicamente nei bambini, in alcuni casi infezioni della pelle.
• Bacillus cereus, Gram positivo, vive nel suolo innocuo e può diventare pericoloso nel caso di cibi contaminati mal preparati.
• Bacillus anthracis, forma spore (forma di differenziamento cellulare che dà resistenza), è serio batterio patogeno perché produce tossine provocando l'antrace, malattia polmonare spesso letale, è stato usato come agente di bioterrorismo (mandate spore in buste e inalate).
• Bradyrhizobium, innocuo e utile, simbionti delle piante, fissano azoto producendo ammoniaca.
• Clostridium tetani, agente eziologico del tetano, infetta le ferite producendo una neurotossina che causa paralisi.
• Lactobacillus, specie benefiche per l'uomo, sono usati nell'industria alimentare per produrre derivati del latte creando fermentazioni che usano gli zuccheri del latte.
• Clostridium botulinum, agente eziologico che causa botulismo, produce tossina botulinica che causa paralisi (nel tetano blocca il muscolo mantenendolo contratto, nel botulismo la paralisi è flaccida: non si contrae più il muscolo).
• Corynebacterium diphteriae, causa difterite eliminata con più vaccinazione su vasta scala.

Meccanismi di scambio genico

La coniugazione è un meccanismo con cui i batteri si scambiano materiale genico, tramite il pilus sessuale. Il trasferimento è unidirezionale, dal donatore al ricevente.

I flagelli sono strutture proteiche che consentono il movimento. Le fimbrie sono usate dal batterio per aderire a superfici biotiche.

Vibrio cholerae, uno dei pochi casi in cui la forma ci dice qualcosa, agente eziologico del colera, la sintomatologia è dovuta alla produzione della tossina colerica, è letale se non curata per disidratazione.

Lezione 2

Procarioti: batteria e archea

Abbiamo 2 gruppi di procarioti (Bacteria e Archea), con cellula procariotica, con profonde differenze che dipendono dal fatto che si sono evoluti in modo indipendente.

Composizione chimica

Dal punto di vista strutturale la cellula è semplice: non ha organelli né compartimentazione, ma citoplasma con materiale genetico in una struttura detta nucleoide. La parte più complessa è la struttura di rivestimento.

Elementi più abbondanti: carbonio, ossigeno, idrogeno, azoto, fosforo e zolfo, principali costituenti o costituenti di composti organici. L'azoto costituente di aa e enzimi, fosforo di acidi nucleici, zolfo di alcuni aa e coenzimi.

Elementi meno abbondanti: potassio, magnesio, calcio, ferro e altri costituenti in tracce che sono cofattori e costituenti di enzimi e coenzimi, è importante che essi siano forniti nel terreno di coltura.

Macromolecole e strutture cellulari

Questi elementi vanno a costituire macromolecole: proteine, lipidi... ma anche lipopolisaccaridi che si trovano solo nei batteri Gram negativi. Partendo da composti chimici come forme di energia e da fonti di carbonio diverse si può ottenere energia metabolica e metaboliti che permettono di sintetizzare macromolecole che vanno a formare le strutture cellulari.

La cellula contiene proteine al 55%, acidi nucleici al 23%, lipidi e lipopolisaccaridi all'11%, poi polisaccaridi.

Involucro cellulare

L'involucro comprende la membrana citoplasmatica (oltre alla parete), con doppio strato fosfolipidico, detto anche modello a mosaico fluido: le proteine immerse sono in grado di muoversi, la composizione è simile a quella eucariotica, ci sono associate proteine che conferiscono particolari proprietà.

Le proteine integrali di membrana sono immerse nella membrana e la struttura tipicamente immersa è una struttura ad alfa elica, più alfa eliche attraversano il doppio strato, sono proteine canale. Poi proteine che attraversano una sola volta sempre con alfa elica (sempre integrali di membrana). Ci sono poi le proteine periferiche che si associano al foglietto interno della membrana in modo diverso: o direttamente oppure associate prendendo contatto con altre proteine integrali di membrana.

Le lipoproteine possiedono modificazione lipidica che avviene post traduzionalmente, viene aggiunta un'ancora lipidica che le ancora al foglietto esterno della membrana. Gli opanoidi sono simili agli steroidi (colesterolo). I fosfolipidi sono simili a quelli eucariotici: glicerolo fosfato con aggiunti residui (-R) che generano i fosfolipidi, es: fosfatidiletanolammina. Gli acidi grassi possono essere saturi o insaturi, l'insaturazione cambia la fluidità della membrana.

Nelle membrane eucariotiche ci sono anche steroli che rendono la membrana più rigida, nei batteri solo opanoidi con la stessa funzione.

Differenze tra batteri e archea

Negli archea il legame che unisce glicerolo alla porzione idrocarburica è un etere e non un estere. Inoltre le catene idrocarburiche nei lipidi degli archea sono ramificate e non lineari. Il legame etereo è più solido e resistente ad alte temperature e la ramificazione influenza la fluidità del doppio strato: gli archea vivono in ambienti estremi e ciò consente di adattarsi ad essi (elevate temperature).

Altra differenza riguarda la chiralità del glicerolo: negli archea il gruppo fosfato è legato al carbonio 1 e nei batteri al carbonio 3, quindi i gliceroli sono chirali. Negli archea le catene idrocarburiche dei lipidi sono catene isopreniche date dalla polimerizzazione dell'isoprene, questo conferisce maggiore resistenza.

Quindi batteri legame estere tra due acidi grassi e un glicerolo, archea legame etere tra due catene isopreniche e un glicerolo formando i dieteri o 4 catene isopreniche e due gliceroli, tetraeteri di diglicerolo, in alcuni archea si ha ciò, creando un monostrato fosfolipidico che dà maggiore stabilità.

Funzioni della membrana plasmatica

La membrana plasmatica isola dall'ambiente extracellulare, è semipermeabile, controlla gli scambi con permeabilità selettiva. Tipiche solo dei batteri sono funzioni di: accumulare energia chimica ed elettrica (forza protonmotrice), questa energia può essere utilizzata per alcune funzioni, trasforma energia elettrica, chimica o luminosa in forza protonmotrice (respirazione, fotosintesi), trasforma la forza protonmotrice in energia chimica sotto forma di ATP e cinetica per i flagelli, percepisce variazioni ambientali e trasmette segnali ai sistemi metabolici, chemiotattici e genetici, secerne prodotti cellulari ed è la sede della biosintesi di costituenti delle membrane extracitoplasmatiche.

Sulla membrana plasmatica avvengono processi di produzione e trasformazione dell'energia chimica con la catena del trasporto degli elettroni, negli eucarioti ciò avviene nelle membrane interne dei mitocondri. Gli elettroni presi da NADH coenzima e potere riducente vanno nella catena di trasporto degli elettroni, usati per creare gradiente e pompe ATPasiche pompano protoni e producono ATP, gli elettroni al NADH arrivano da donatori di elettroni.

Sulla membrana avvengono anche processi di cattura e trasformazione dell'energia luminosa in energia chimica, si strappano elettroni dall'acqua, vanno a fare potere riducente in NADH, catena di trasporto, pompe e ATP, negli eucarioti avvengono nelle membrane interne dei cloroplasti (tilacoidi).