Appunti microbiologia applicata

Microbiologia generale

Concetto di sterilità

Colonia: insieme di microbi (batteri o lieviti) originata da una singola unità.

Come ottengo colonie singole su una piastra Petri? Inoculo coltura mista o pura (in entrambi i casi ottengo una colonia singola se applico il giusto metodo); infatti, si parte sempre da miscele per poi poter arrivare a singoli ceppi. La singola colonia ottenuta serve per poi ottenere una coltura pura.

Come isolo un singolo ceppo microbico? Coltivo i microrganismi (la mia miscela) e faccio in modo che crescano generando delle colonie singole su piastre Petri, unica via che ho per isolare un ceppo microbico, coltivarlo e ottenere poi una coltura pura.

I terreni di coltura, i contenitori e gli strumenti utilizzati in microbiologia devono essere sterili per evitare che micro non presenti nel campione da analizzare siano invece presenti negli strumenti o terreni utilizzati (sennò non distinguo i micro del campione da quelli contaminanti). È necessario mantenere anche la sterilità, attuando ad esempio pratiche corrette di apertura e chiusura dei contenitori in ambienti anch’essi sterili.

Sterilità: assenza di forme biologiche viventi, comprese le endospore di Bacillus e Clostridium (le spore sono forme termo resistenti per la presenza di Sali di dipicolinato di calcio al suo interno). Le spore di Bacillus e Clostridium vengono utilizzate come sistemi di verifica e controllo del funzionamento efficace di un processo di sterilizzazione ovvero, inoculo spore di uno specifico microorganismo termoresistente e verifico la sua presenza dopo il trattamento termico, poiché termometro, manometro e barometro possono non essere tarati correttamente. Solo in questo modo ho una verifica sicura e oggettiva.

Sterilizzazione: distruzione di qualsiasi organismo vivente presente sul materiale. Si utilizzano i microrganismi e non temperatura, pressione, ecc., per verificare la sterilità perché nanometro, barometro e altri strumenti per la misura di questi parametri possono essere non correttamente tarati.

La sterilità nel laboratorio di microbiologia deve essere assoluta (non si parla di sterilità commerciale come nel caso delle conserve alimentari, in cui si ha un dato numero di riduzioni decimali della popolazione di un microrganismo o delle sue spore) perché deve garantire la totale assenza di microrganismi sui terreni, in quanto se io voglio studiare un singolo individuo, quest’ultimo deve poter crescere senza altri tipi di microrganismi (non posso studiarne il metabolismo se l’individuo che studio non è da solo).

Lo strumento più efficace è il calore (ma anche i raggi gamma solo per superfici e contenitori), perché esso si diffonde in tutto l’alimento e si denaturano le proteine (ci sono proteine termostabili ma nessuna resiste ad un processo di sterilizzazione). Una volta denaturate le proteine, esse non hanno più azione catalitica e di conseguenza la cellula muore per assenza di attività metabolica. La denaturazione proteica è inoltre irreversibile.

Autoclave

Strumento che sterilizza attraverso il vapore sotto pressione (calore umido, che ha maggiore conducibilità termica di quello secco). Esso è una pentola a pressione, dotata di sistemi di controllo per pressione, temperatura e tempi, che contiene nella sua porzione inferiore una determinata quantità di acqua distillata e un serpentino sul fondo che scalda l’acqua, creando così vapore. L’acqua deve essere distillata per evitare che elevate concentrazioni di sale si depositino e creino quindi danni al serpentino (la formazione calcare infatti diminuisce la capacità di conduzione termica da parte del serpentino). Il vapore formato riempie il volume dell’autoclave. Ogni autoclave è dotata di due valvole, una in basso e una in alto. Il vapore piano piano satura la camera dell’autoclave ed esce poi dalla valvola inferiore; a questo punto si chiude questa valvola così esso è costretto a salire in tutta la parte superiore dell’autoclave. A questo punto il vapore inizia a fuoriuscire anche dalla valvola superiore e perciò si chiude anche questa. L’ambiente si satura ulteriormente e la pressione aumenta fino al valore impostato dal nanometro. Quando l’aumento di pressione viene raggiunto, una terza valvola viene aperta per evitare che la pressione aumenti troppo. A questo punto può partire il ciclo di sterilizzazione (ciclo che è una combinazione di tempi e temperature, es. sovrapressione di 1 atm = 121°C per 15 minuti). È necessario regolare la sovrapressione per ottenere la temperatura che si desidera o viceversa, regolare la T per ottenere la sovrapressione desiderata (temperatura e pressione, infatti, seguono le stesse leggi). Una sovrapressione di 3/4 di atmosfera corrisponde a 116°C e una sovrapressione di mezza atmosfera corrisponde a 111°C.

Più alta è la temperatura, minore è il tempo necessario a far avvenire la sterilizzazione (116°C = 20 minuti e 111°C = 30 minuti). Il calore umido è più efficace di quello secco ovvero, se secco devo aumentare la Temperatura e diminuire i tempi.

Questi parametri si applicano in funzione del materiale da sterilizzare. Quando la matrice dei terreni colturali che utilizziamo diventa più complessa, quindi più ricca di proteine e zuccheri, bisogna lavorare in condizioni di sterilizzazione più blande, in cui si diminuisce la temperatura e si aumentano i tempi (per evitare che si formino reazioni di imbrunimento o di Maillard che possono ad esempio sottrarre fonti nutrizionali necessarie alla crescita microbica). Pressioni e temperature maggiori vengono applicate per limitare il danno ai composti organici (imbrunimento e caramellizzazione).

Vi sono poi elementi di terreno colturale che devono essere sterilizzati a parte, utilizzando strategie diverse: esempio zuccheri, antibiotici e vitamine non possono essere sterilizzati con calore (termosensibili) quindi si usa la filtrazione (passaggio all’interno di un filtro dotato di pori con diametro più piccolo di quello della cellula, ovvero di circa 0,22-0,45 µm). Una volta sterilizzati, questi possono essere aggiunti alla formulazione.

Ovviamente tutti gli ambienti in cui lavoro e gli strumenti utilizzati devono garantire la sterilità.

Leggi di sterilizzazione

Prima legge di Bigelow

Questa comprende un valore che valuta la termoresistenza di un microrganismo ovvero, il valore D.

Tempo di riduzione decimale (D): tempo necessario per inattivare il 90% (ridurre quindi di 10 volte) la popolazione microbica, ad una data di temperatura. Si ha una riduzione logaritmica. 6 → 10⁶ log UFC \ ml = quindi un passaggio da 6 log a 5 log rappresenta una riduzione decimale.

Per costruire le rette di sterilizzazione, preparo a campione aliquote diverse di microrganismi in sospensione. Un’aliquota la pongo ad una certa T1, la seconda a T2 e la terza a T3. Ogni tot. tempo faccio un prelievo e, dopo diluizione e piastramento, effettuo la conta dei microrganismi che sono rimasti vivi e avrò una riduzione di vitalità differente.

Il D si calcola quindi in modo sperimentale, ricavandolo dalle rette di inattivazione. Se varia la condizione in cui si è calcolato il D (es soluzione salina vs latte) non posso riutilizzarlo: devo necessariamente calcolarlo nuovamente. La matrice alimentare ha anche effetto di protezione nei confronti della termosensibilità del microrganismo ovvero, se cambio matrice, il tempo di riduzione decimale cambia.

Il tempo di riduzione decimale può quindi determinare la sensibilità termica di una specie o di un ceppo di una determinata specie. La sensibilità termica può variare infatti anche tra ceppi della stessa specie. es. ceppi di Streptococcus thermophilus che producono esopolisaccaridi possono avere resistenza ai trattamenti, quindi la loro riduzione decimale nella stessa matrice può essere differente.

Sulla base di D posso stabilire qual è il miglior tipo di trattamento termico (pastorizzazione o sterilizzazione) per ottenere un dato numero di riduzioni decimali di un microorganismo. Per la pastorizzazione del latte si considera come microorganismo target L. monocytogenes.

Seconda legge di Bigelow

Mette in relazione i tempi di riduzione decimale (D) con la temperatura. Dal primo esperimento che consente di tracciare le rette, ottengo dei valori di D in funzione della temperatura utilizzata. Se poi metto questi valori D, considerando il numero di micro al tempo iniziale e finale e il tempo di trattamento, ottengo anche un secondo grafico che rappresenta il logaritmo di D in funzione della temperatura utilizzata, generando così un valore z (z=aumento di T che devo realizzare per avere una riduzione del valore di D, di un fattore 10).

Quindi, per ridurre di 10 volte D, devo aumentare di 10 volte la temperatura. Z indica la resistenza relativa ad un microrganismo alle diverse temperature di un trattamento. Importante quando devo stabilire temperature di pastorizzazione o sterilizzazione di alimenti complessi, di cui devo garantire l’assenza di microrganismi patogeni. Una nuova matrice o una nuova formulazione alimentare richiede la costruzione di questi grafici prima che si possa scegliere il trattamento termico adeguato.

Questo tipo di esperimenti richiedono un certo impegno dal punto di vista lavorativo: bisogna lavorare con alimenti contaminati da microrganismi patogeni. Quindi, mentre D rappresenta la resistenza termica di un microorganismo quando esposto a una precisa temperatura, Z indica la resistenza relativa di un microorganismo a differenti temperature di trattamento (mi permette di capire come modulare un trattamento termico per ottenere la distruzione microbica desiderata). Z e D vengono calcolati per qualsiasi alimento che deve subire un trattamento termico.

Lavorare in sterilità in laboratorio

Si lavora con becco Bunsen per sterilizzare i contenitori utilizzati per inoculare terreni o per spostare una biomassa. La fiamma crea ambiente sterile al suo interno.

Il Becco Bunsen è un fornelletto a metano dotato di una valvola di apertura e chiusura di gas, di un pulsante azzurro che è sistema di sicurezza. Esso poi controlla una termocopia che viene scaldata dalla fiamma e che mantiene il flusso di gas, una volta rilasciato il pulsante. Quando si lavora al Becco Bunsen si lavora quindi vicino ad una fiamma. Questa fiamma può essere riducente (colore giallo, instabile e si ha oscillazione a seguito di aria) oppure ossidante (alla base del becco dove esce il gas, c’è un’apertura, aperta o chiusa, e se è aperta l’aria può fluire all’interno e miscelarsi al metano, mentre se è chiusa il metallo esce puro; la miscela con l’ossigeno rende la fiamma diversa, di colore blu/azzurra al centro e trasparente ai lati). Le due fiamme differiscono per stabilità e per sterilità (fiamma ossidante garantisce un ambiente di lavoro sterile più ampio rispetto a quella riducente). Se ci allontaniamo bisogna usare fiamma gialla (perché visibile) mentre se lavoriamo quella ossidante.

Terreni di coltura

Preparazione

Il terreno di coltura si prepara ponendo acqua e nutrienti in delle beute. Si aggiunge quindi la corretta % di agar agar solo se bisogna effettuare un piastramento su piastre Petri (se vogliamo terreni liquidi non lo aggiungiamo). L’agar è un polimero vegetale che si scioglie scaldando il terreno a cento gradi. Tutti i trasferimenti in contenitori sterili si fanno lavorando intorno a un becco Bunsen.

Una volta che le piastre sono preparate, il piastramento per ottenere colonie singole può essere fatto per:

• Piastramento superficiale o spatolamento: il campione, sempre in sterilità, viene depositato con una pipetta, sulla superficie ormai solida del terreno agarizzato. Dopo utilizzo una spatola (strumento a L sterile), per distribuire la gocciolina di sospensione microbica in modo omogeneo su tutta la superficie della piastra. La parte liquida di questa sospensione viene assorbita dal terreno gelificato (non si ha formazione film ma assorbimento) ovvero, l’acqua viene assorbita e le cellule vengono trattenute in superficie. Il volume erogato sulla piastra Petri dalla pipetta deve essere di 0,1 ml o meno (perché piastra di circa 10 cm) per far sì che la parte liquida venga assorbita dal terreno di coltura. Contando le colonie e sapendo il volume iniziale e le diluizioni effettuate è possibile risalire alla concentrazione in UFC della sospensione utilizzata. A questo punto la piastra viene chiusa, capovolta e sottoposta a incubazione. Capovolgo le piastre perché altrimenti, essendo esse sottoposte ad una data temperatura per circa 24/48 ore, si ha evaporazione dell’acqua e formazione della condensa, che potrebbe ricadere sul terreno, formando un film liquido in superficie in cui si formeranno le cellule in modo omogeneo (colonie non più ben definite ma un “brodino” di cellule). Quindi capovolgendo, l’umidità esce dai bordi (non si ha chiusura ermetica, il coperchio è semplicemente appoggiato).
• Piastramento per inglobamento: usato per microrganismi più sensibili all’O₂. Il campione viene depositato con una pipetta all’interno di una piastra Petri vuota e sterile (fino a 1 ml perché non devo assorbirlo ma viene già inglobato) e dopodiché, il terreno agarizzato ancora liquido (circa a 40°C per non danneggiare i microrganismi) viene versato e mescolato con il campione, per renderlo omogeneo. Dopo l’incubazione si vedono colonie microbiche sia sulla superficie del terreno agarizzato che incluse nel terreno stesso (soprattutto se i microrganismi sono sensibili all’ossigeno).
• Piastramento per striscio superficiale: piastra con terreno divisa idealmente in 3 o 4 quadranti. Con l’ansa (asta di metallo che termina con un filo metallico che termina con un anellino) prelevo microrganismi cresciuti sulle piastre. Le colonie formate le utilizzo per isolamento in coltura pura. Movimento a zig zag fino a riempire tutto il quadrante: ciò permette di pulire la mia ansa e di distribuire tutti i microrganismi sul terreno. Devo garantire che tutte le cellule che ho raccolto vengano deposte sulle superficie del terreno. Stessa roba a zig zag sul secondo quadrante, ecc. Questo ripetere di strisci, partendo da un’unica volta in cui ho toccato la colonia, consente una diluizione delle cellule. Le colonie formate sono talmente vicine l’una all’altra che hanno formato una linea. Con questo metodo ottengo colonie singole separate/singole, a partire da una coltura pura. Nei metodi precedenti deposito su una piastra o inoculo nel terreno volumi noti, da sospensioni di diluizione decimale, quindi sono tecniche affiancate ad un metodo di conta. Questo invece, indipendentemente dalla conta, consente comunque di ottenere colonie singole ma non c’è volume/concentrazione iniziale.

Per sterilizzare la spatola, la immetto in etanolo e brucio etanolo alla fiamma del becco Bunsen.

Descrizione colonie coltivate

Dalla semina di una comunità microbica il risultato è una complessità di colonie di forma, colore e dimensione diversa. Questo è un indice del tipo di microorganismi presenti nel campione. Tuttavia, le cellule che crescono nel terreno non sono tutte quelle presenti nel campione:

• Produzione da parte di alcune cellule di composti (soprattutto acidi organici) che impediscono la crescita di altre. Inoltre, le cellule possono produrre molecole ad attività antimicrobica (antibiotici) che inibiscono la crescita di altre cellule (così è stata scoperta la penicillina);
• Se ho terreno di coltura con componenti che alcuni micro non sanno utilizzare, è ovvio che non crescono (composizione del terreno);
• Disponibilità di ossigeno;
• Concentrazione e disponibilità di Sali;
• Temperatura: se ad esempio incubo le piastre a 25°C, i termofili non crescono.

Ciò che vedo sulla piastra è circa l’1% del campione analizzato. Questo problema è dato soprattutto da microrganismi di cui non conosco soprattutto le esigenze colturali. Qualsiasi terreno, per quanto attentamente ed efficientemente preparato, è selettivo, quindi ci sarà sempre una parte della popolazione che non riesco a coltivare. I microrganismi non si identificano infatti tramite coltivazione, ma tramite tecniche diverse che analizzano il DNA.

Per descrivere le diverse colonie, le devo isolare. Come si descrivono le colonie:

• Spessore: piatte, leggermente sopra elevate, convesse, molto convesse (cupoliforme) e umbonato. Prendo la piastra e vedo in sezione come la colonia si eleva in superficie;
• Margine: regolare, ondulato, lobato, eroso, filamentoso e increspato;
• Colore;
• Dimensione;
• Superficie.

Descritta la forma della colonia, non posso comunque identificarne la specie o il genere nella stragrande maggioranza dei casi, per esempio i batteri lattici hanno colonie molto simili tra le varie specie. L’eccezione si ha quando il terreno è così selettivo da differenziare specie correlate e specie affini. Tuttavia, l’isolamento in coltura pura e la descrizione morfologica delle colonie non ha rilevanza tassonomica.

Esempio: Bacillus mycoides è un bastoncino gram positivo, sporigeno, termoresistente. Le sue colonie hanno morfologia molto particolare (ricciolini che ruotano in un senso orario o antiorario) e invadono moltissimo la superficie della piastra (cresce molto velocemente). Cresce in anaerobiosi. Questo è uno dei pochi casi di correlazione diretta tra la morfologia della colonia e la specie. Come si sviluppa una colonia di questo Bacillus? La cellula iniziale, che ha l’aspetto di un bastoncino, si divide e si allunga. Si genera un filamento più lungo in cui si vedono i setti di separazione tra una cellula e l’altra. I filamenti diventano via via molto lunghi.