Appunti completi di Tissue Engineering

Capitolo 1. Fondamenti di biomateriali e ingegneria tissutale

La storia dell’uso dei biomateriali è molto antica, e i primi esempi dell’utilizzo di questi risalgono (soprattutto nel campo dei denti) a migliaia di anni fa. In particolare, per rimpiazzare denti distrutti dalle carie, o da traumi, si usavano i materiali disponibili dell’epoca che non subivano biodegradazione e che resistevano agli ambienti aggressivi della bocca.

Come sappiamo, infatti, gli ambienti corporei sono degli ambienti estremamente aggressivi (visti da una prospettiva ingegneristica), caratterizzati da una variabilità molto elevata, basti confrontare lo stomaco con la pleura polmonare oppure con il sangue. Variano moltissimo infatti il pH, i flussi, le condizioni fluidodinamiche, concentrazioni ioniche ecc.

Quello che ha determinato l’avvento dei biomateriali è stata la nascita delle plastiche (nonché dei polimeri) che mettono a disposizione una gamma quasi infinita di nuovi materiali, e per lo più hanno basso costo e possono essere forgiati nei modi più diversi. Le prime protesi vascolari, per es., sono state realizzate nel polimero che compone i paracaduti, che risultò biocompatibile e facile da suturare.

Nel campo biomedico quelli che stanno sulla frontiera sono i chirurghi, perché sono i primi uomini che vedono, affrontano, e risolvono “il problema”. Essi hanno il compito di salvare vite, con tutti i mezzi soprattutto in caso di emergenze, anche sperimentando tecniche e materiali nuovi mai utilizzati.

Allora definiamo la “driving force” la forza spingente che risolve i problemi e che è incarnata dai chirurghi. I chirurghi hanno quindi dei problemi da risolvere, e perciò intorno agli anni 40’-50’ (anni di guerra) sperimentano su moltissime persone nuovi medicinali e nuove tecniche. Basti pensare che prima di quegli anni non esisteva l’antibiotico.

I chirurghi iniziano a chiedere aiuto agli ingegneri, perché sanno progettare, conoscono le proprietà meccaniche, rapporto proprietà-struttura, e verifica misure sperimentali ecc. Questi sono gli anni 60’-80’ in cui nascono i primordi dell’ingegneria biomedica e dei biomateriali.

Gli ingegneri hanno iniziato a capire che le conoscenze ingegneristiche non bastavano; infatti non bastava più conoscere il modulo di Young dell’osso trabecolare senza sapere come esso si riforma e si deposita idrossiapatite. Allora vennero chiamati in causa i biologi che forniscono conoscenze biologiche.

Panoramica storica

Verso la fine dell’800’ vennero usate le tecniche chirurgiche asettiche con whiskey e alcol, poiché uno dei principali motivi di morte era la setticemia.

Verso gli anni 40’ nascono i materiali plastici, acrilici (per sostituire la cornea).

Tra gli anni 60’-70’ trapianto di cuore.

Anni 2000 si usano i nanomateriali.

Esempi di dispositivi medici sono impianti mammari, cuori artificiali, giunti d’anca, valvole cardiache (anche meccaniche), e lenti intraoculari.

Tutti questi materiali danno diversi problemi come: infiammazioni, trombi, durata, sporcamento, movimenti, lubrificazioni e molti altri. Una protesi d’anca, per esempio, può esistere in moltissime configurazioni che dipendono dalla forma e dall’accoppiamento.

I materiali usati sono polimerici, metallici e ceramici. Lo stelo è tipicamente metallico, il giunto acetabolare (che va a contatto con l’articolazione) è fatto da due componenti; la cupola in materiale polimerico rivestito da materiale ceramico.

I motivi di questi accoppiamenti sono:

• Proprietà meccaniche (trazione e compressione) per lo stelo in metallo (acciaio inox, titanio ecc. che hanno elevate resistenze alla corrosione, elevate proprietà meccaniche, e elevata osteointegrabilità dovuta alla rugosità superficiale, ottenuta dalla sabbiatura).
• Bassi coefficienti di attrito (materiali polimerici).
• Elevata resistenza a compressione e basso attrito (materiali ceramici).

Tutte queste proprietà sono comunque legate alle tecniche di lavorazione atte alla produzione di questi materiali che poi andranno ad interagire con il corpo ed i vari tessuti.

Un altro esempio di dispositivo sono le valvole cardiache che possono essere meccaniche o naturali (porcine).

Tra le valvole meccaniche più conosciute ci sono quelle rivestite con carbonio pirolitico (dovuto a trattamento di pirolisi) che ha diverse proprietà come quella di rendere la valvola non trombogenica. Le valvole estratte dei maiali invece sono utilizzate perché come organismo quello dei maiali è il più simile al nostro (in termini di dimensione degli organi).

Come ultimi esempi vediamo l’impianto dentale creato in titanio, strutture di supporto intervertebrali e strutture di fissaggio.

Il punto dolente nonché punto di partenza è la carenza di pezzi di ricambio, cioè se guardiamo i costi (in termini di procedure) delle operazioni implicate a sostituzioni di parti anatomiche intorno agli anni 90’, si può notare che i numeri sono elevatissimi, circa 400 mld di dollari. Ai giorni nostri il valore è aumentato di circa 10 volte. I pezzi di ricambio sono necessari quando effettuo un trapianto.

Meccanismi di trapianto

Il meccanismo di trapianto può essere:

• Autogeno: il pezzo di ricambio proviene dal nostro stesso corpo. Il vantaggio è sicuramente l’assenza di risposte immunitarie, ma ho anche il problema legato alla limitazione dei sistemi utilizzabili, cioè non tutte le operazioni sono possibili. Per esempio se si tratta di un vaso sanguigno il problema non si pone, perché utilizzo alcune nostre vene e arterie senza alcun problema, oppure se serve tessuto osseo per la rigenerazione lo recupero dalla cresta iliaca, ma se per esempio devo effettuare un trapianto di cuore, pancreas o fegato non ho fonti autogene da cui attingere.
• Allogenico: il vero e proprio trapianto in cui un paziente riceve un organo da un donatore. Il grande difetto è il donatore il quale può donare tessuti in vita, ma per alcuni organi soltanto quando è clinicamente deceduto. Le complicazioni variano naturalmente anche da organo ad organo che deve essere donato. Il trapianto più difficile è quello dei polmoni; i polmoni sono strutture vuote, che collassano quando l’organismo smette di respirare, per cui deve esistere un protocollo sanitario (oltre alla biocompatibilità donatore-accettore) che mi assicuri una buona conservazione di essi entro 3 ore (tempo minimo della conservazione in iperventilazione, che mi consente di mantenere gonfi i polmoni), per questo motivo i costi sono elevatissimi. Il secondo problema è legato alla risposta immunologica domata dagli immunosoppressori.
• Xenogenico: utilizzare parti anatomiche animali come quelle del maiale. Qui la risposta immunologica è molto più elevata rispetto al caso precedente. Anche i costi sono elevati perché le valvole, per esempio, devono essere sottoposte a trattamenti chimici, che servono a togliere una serie di marker sulla superficie e che vengono riconosciuti estranei dal nostro sistema immunitario.

Biomateriale

Come classificazione dei materiali abbiamo:

Materiali ingegneristici

Il materiale che crea l’uomo come per esempio il metallo, la ceramica, i compositi, le plastiche.

Materiali naturali

Cioè i materiali che troviamo già in natura, per esempio l’osso, il legno, la gomma ecc. che possono avere anche buone caratteristiche meccaniche.

Materiali biomimetici

Sono i materiali naturali che utilizziamo in ambito ingegneristico. Quindi studio e capisco come funzionano i materiali biologici e li utilizzo per applicazioni ingegneristiche.

Biomateriali

I materiali ingegneristici che imitano i materiali presenti in natura. Utilizzo il materiale tradizionale per ricreare strutture biologiche (per esempio l’osso) e riprodurre tutti gli aspetti meccanici, tribologici, di biocompatibilità ecc. (naturalmente studiando prima tutti gli aspetti legati alla biologia e alle caratteristiche del materiale naturale, che deve riprodurre il materiale ingegneristico).

Affrontiamo adesso i biomateriali e focalizziamoci sul loro significato.

Le definizioni di biomateriale possono essere molteplici e “differenti”; nel senso che possiamo trovare una definizione completa in ogni dettaglio e invece un’altra un po’ meno specifica.

• Un materiale sintetico, naturale o modificato che ha la funzione di essere in contatto e interagire con il sistema biologico (che possono essere anche sistemi in vitro).
• Un materiale sintetico, generalmente plastica, utilizzato per impianti in un corpo vivente (trapianti) per riparare parti danneggiate o soggette a patologie.

Entrambe sono corrette.

Requisiti dei biomateriali

Un biomateriale per essere definito tale deve essere:

• Inerte o specificamente interattivo: i primi biomateriali ad essere utilizzati, nella fattispecie ceramici e il titanio, vennero utilizzati perché generavano una risposta immunitaria molto bassa. La parola inerte, non derivante dall’ambito biologico/medico, deriva dall’ambito chimico e vuole dire che non viene attaccato da alcun agente chimico (come il PTFE). In realtà l’inerzia da un punto di vista biologico non esiste, cioè non c’è nessun materiale, o corpo estraneo che messo a stretto contatto con il corpo, con tessuti o organi ecc. non generi un minimo di risposta immunitaria. Questa risposta può essere dalla più blanda; l’infiammazione che risulta locale, la quale non è seguita da null’altra risposta sistemica (quella immunitaria). Per cui il paradigma dell’esistenza di un materiale completamente inerte è stato smontato dalle conoscenze mediche. Quindi per questi materiali si mira sempre di più alla realizzazione di quelli che vengono chiamati targable(?), cioè materiali che facciano ciò che vogliamo facciano in uno specifico ambito. Per esempio uno scaffold che contenga all’interno una serie di molecole segnale che lo orientino verso un certo tipo di risposta.

  Un esempio potrebbe essere una protesi ossea che contenga un qualcosa che essendo riconosciuta dal tessuto osseo promuova la crescita di quelle cellule specifiche che si differenziano e diventano osteoblasti, che rilasciano matrice ecc., l’importante è che le cellule immunitarie o quelle di uno specifico tessuto riconoscano quelle molecole segnale. Questo vuol dire specificamente interattivo.

• Biocompatibile: (vedremo dopo cosa voglia dire).
• Stabile meccanicamente e chimicamente oppure biodegradabile: esistono materiali protesici progettati per restare all’interno del corpo per moltissimo tempo, si direbbe tutta la vita anche se in realtà non è mai così, oppure materiali progettati per essere impiantati, e successivamente degradare per poi scomparire del tutto.
• Lavorabile: posso avere il materiale migliore sul mercato, ma se è difficile da lavorare o è molto costoso cerco un’alternativa migliore. I materiali polimerici per esempio sono molto facili da lavorare ma soprattutto hanno un basso costo, rispetto ai metalli che devono subire moltissime più lavorazioni per ottenere il pezzo finito. In realtà in ambito biomedico non si guardano mai i costi delle lavorazioni delle materie prime (che sono quasi sempre totalmente irrilevanti perché il pezzo finito costa molto di più di tutti i processi di lavorazione).
• Non trombogenico: se il biomateriale (protesi vascolari ecc.) è a contatto con il sangue non deve causare trombi.
• Sterilizzabile: il biomateriale deve potere essere sterilizzato attraverso differenti procedure come raggi gamma, pressione e temperatura, gas al plasma, ossido di etilene e vapore ecc. I raggi gamma sono quelli più utilizzati in molti ambiti non solo il biomedico, e per sterilizzare alcuni polimeri bisogna fare attenzione alla loro capacità di resistere a tali raggi, in quanto potrebbero variare alcune proprietà come il PM ecc. Anche la temperatura potrebbe far variare le proprietà dei polimeri, perché in genere la temperatura è al di sopra della Tg.

Biocompatibilità

La biocompatibilità è un requisito fondamentale. Essa si definisce quando un materiale:

• Non è tossico = non produce nessun prodotto che risulti essere tossico, per esempio come monomero non reagito per i polimeri, o come ioni rilasciati dai metalli. Il non essere citotossico deve essere sia sulla superficie né nel bulk, perché può succedere che per effetto delle interazioni con il corpo umano il materiale si bioeroda e quindi se è il bulk ad essere tossico e non la superficie si arriverà ad un punto in cui la tossicità si manifesta comunque e avrò una risposta di non biocompatibilità ritardata (anche mesi).
• Non causa risposta infiammatoria “cronica” = la risposta infiammatoria acuta c’è sempre, dopo di che essa può svanire o diventare cronica.
• Non deve promuovere allergie.

La biocompatibilità quindi ha a che fare con una interazione con il sito dove viene inserito il biomateriale (cioè dalla cellula all’organo), perché la citotossicità (derivante dalla cellula) può essere molto differente da una tossicità scaturita da un organo. In ogni caso non dobbiamo avere la più bassa tossicità dalla scala cellulare a quella dell’organo, tenuto conto anche del fatto che le caratteristiche dei singoli tessuti tra loro possono essere molto differenti.

Bisogna tenere conto anche di tutti i fenomeni su aspetti meccanici, chimici, farmacologici ecc. che entrano in gioco quando impiantiamo il biomateriale.

Un esempio può essere la corrosione (rilascio di ioni e o perdita del peso molecolare) oppure aspetti del tutto biologici come la formazione di un film proteico (come la fibrina per un vaso sanguigno che è il primo passo per la riparazione). L’encapsulation è uno dei fenomeni negativi in cui il sistema immunitario, per espellerlo, avvolge da una capsula fibrotica il materiale. La formazione di trombi. La calcificazione è la deposizione di calcio dove non dovrebbe essercene. Rilascio di sostanze tossiche. L’infragilimento in cui un materiale che aveva delle certe caratteristiche meccaniche tende a rompersi. La lisi cellulare indotta da prodotti di degradazione e per finire la reazione sistemica. Oltre agli aspetti meccanici e chimici quindi si analizzano anche gli aspetti farmacologici (quando vengono rilasciate piccole molecole nell’organismo).

La biocompatibilità dipende da diversi fattori:

• Dal tipo di materiale.
• Dallo stato di carico = se gli sforzi sono statici, dinamici o ciclici. L’interazione del materiale (sia superficie che bulk) con il tessuto cambia fortemente se il tessuto è sottoposto a determinati carichi.
• Durata del dispositivo immaginata = per esempio una protesi d’anca dura 20-15 anni; se ho dei fenomeni che limitano le proprietà del device essi devono esprimersi solo dopo il tempo immaginato per la durata di quel dispositivo.
• Interazioni con altri materiali.

Il biomateriale naturalmente si degrada secondo diverse modalità come corrosione, dissoluzione, modificazioni chimiche, swelling (rigonfiamento), leaching (rilascio sostanze per attrito); alle quali resiste attraverso alcune proprietà come resistenza a frattura ecc.

Parlare di biocompatibilità vuol dire allora immaginare che un ingegnere, che progetta un dispositivo medico, non tiene conto soltanto delle condizioni attuali ma soprattutto della variabile tempo, che anzi qui è molto rilevante. Un ingegnere biomedico quindi progetta un dispositivo conoscendo cosa succede “oggi” e cosa succederà nel tempo.

Questo nella tissue eng. è un concetto molto esaltato, perché i materiali progettati sono pensati per biodegradarsi e quindi la cinetica di biodegradazione deve essere molto accurata (progetto il materiale per le sue proprietà di oggi, e proietto nel tempo la sua variazione delle proprietà, che naturalmente andranno a cambiare).

Nella scienza dei biomateriali allora è molto importante sia la performance analysis, che si basa sulle proprietà meccaniche, ma anche altri elementi come biocompatibilità, e tossicologia, passando dal test fondamentale di tossicità a cose più complicate. Assieme alla biocompatibilità esiste un problema legato all’insorgere di patologie il cui effetto potrebbe essere amplificato dall’uso di queste nuove tecnologie mediche (come per esempio la crescita di masse tumorali come nei o altri casi non visibili).

L’ingegneria dei tessuti ha come principale obbiettivo quello di ricreare pezzi di ricambio, a partire dalle cellule del proprio organismo. Andando sempre incontro a problemi etici e anche biologici come l’accrescersi di masse tumorali.

La scienza dei biomateriali

Fisici, ingegneri, dentisti, chirurghi, veterinari (sperimentazione su animali) sperimentano sempre nuovi materiali per rispondere sempre a tutti i problemi legati ai corrispettivi ambiti. I biomateriali sono posizionabili in diversi livelli.

A livello industriale si lavora molto sulle proprietà e su processi di approvazione che verificano le caratteristiche del materiale e poi del dispositivo (per esempio la FDA). Il livello governativo lavora sui regolamenti di approvazione. L’ultimo livello è quello clinico ospedaliero che analizza il device nel suo utilizzo.

Analizziamo l’immagine sovrastante. Essa esprime la probabilità di fallimento di una protesi d’anca in funzione del tempo. Utilizziamo proprio la protesi d’anca perché abbiamo dati a lungotermin