Appunti completi di Biologia Molecolare

Introduzione e struttura del DNA

La biologia molecolare studia i fenomeni biologici a livello molecolare. È possibile definirla anche come la scienza che studia la struttura dei geni e le loro funzioni a livello molecolare.

Differenze tra procarioti ed eucarioti

• I procarioti sono molto piccoli (1-2 μm), gli eucarioti più grandi (circa 10 μm);
• Gli eucarioti presentano un nucleo che contiene il DNA. Nei procarioti il DNA non è racchiuso in un nucleo ma presenta una sua disposizione;
• Gli eucarioti presentano i vari organelli, mentre i procarioti no.

1 μm = 10^-6 m 1 nm = 10^-9 m

Il DNA presenta una dimensione pari a 2 nm.

I viventi sono suddivisi in Archea, Batteri ed Eucarioti. Il tutto è stato analizzato attraverso lo studio del DNA delle varie specie. Gli archea, nonostante siano molto simili ai batteri, in realtà a livello della sequenza genetica sono più simili agli eucarioti.

La replicazione del DNA è semiconservativa, ovvero le due molecole figlie che ne derivano sono costituite da un filamento parentale e uno di nuova sintesi. Per dimostrare ciò utilizzarono l’isotopo pesante dell’azoto. Fanno crescere dei batteri in dei terreni che presentano i due diversi isotopi per diverse generazioni. Ovviamente i due batteri nel loro DNA presenteranno i due diversi isotopi. Prendendo i 2 DNA e frazionandolo notano che i due batteri presentano i due diversi isotopi. Quando sostituiscono i terreni di coltura, lasciano eseguire ai batteri un solo ciclo di replicazione e li inseriscono nella centrifuga, notano la presenza di una banda intermedia. Quando invece, con lo stesso processo, facendo eseguire al batterio due cicli di replicazione noteremo che...

La DNApolimerasi è un oloenzima, enzima costituito da più subunità. La DNApolimerasi opera in direzione 5’ 3’ perché opera sempre in prossimità della forcella di replicazione. È per questo motivo che sul filamento in cui deve lavorare in direzione opposta si formano i frammenti di Okazaki, in maniera che il DNA venga replicato nella direzione opposta senza che l’enzima si distanzi troppo dalla forcella di replicazione.

In alcuni virus, detti retrovirus, il codice genetico è conservato in RNA che viene convertito durante il ciclo di replicazione in DNA attraverso una trascrittasi inversa.

I cromosomi sono la forma di compattazione massima della cromatina, formata da istoni e DNA. Questa struttura è necessaria per un’organizzazione ordinata del DNA all’interno del nucleo. Inoltre, la cromatina ha funzioni regolative, ovvero può decidere se avverrà o meno la trascrizione di determinati geni. Questo avviene aumentando o diluendo il grado di compattamento della cromatina.

Legami forti e deboli

Le proteine e gli acidi nucleici sono macromolecole polimeriche, i cui monomeri sono uniti da legami covalenti (forti), che difficilmente si formano e si rompono spontaneamente a temperature fisiologiche, e dai quali dipende la struttura primaria di queste macromolecole.

Le funzioni di queste macromolecole dipendono non solo dalla loro struttura primaria, ma anche e soprattutto dall'assunzione di una struttura di ordine superiore (folding), che a sua volta dipende dalla formazione di legami deboli. Strutture come:

• α-eliche e β-foglietti delle proteine;
• La doppia elica del DNA o dell'RNA.

Sempre da legami deboli dipende la funzione delle macromolecole, come ad esempio le interazioni enzima-substrato o le interazioni DNA-proteine, nonché fattori di trascrizione.

La differenza tra legame covalente e ionico, sta nel fatto che nel primo caso si ha una condivisione degli elettroni, nel secondo vi è un “furto” dell’elettrone. La forza di un legame viene misurata in specifiche unità di misura.

Le reazioni cellulari, per poter avvenire, hanno bisogno di un’energia di attivazione. Questa è data dagli enzimi, che permettono di abbassare l’energia di attivazione, in maniera tale da farla avvenire più rapidamente e a condizioni fisiologiche, ovvero senza fare alzare la temperatura cellulare.

L'ATP è il principale composto che contiene legami ad alta energia ed è anche capace di trasferire l'energia di questi legami su altre molecole attivandole, dette precursori attivati. È capace di trasferire:

• Fosfato-γ rilasciando ADP;
• Pirofosfato rilasciando l'AMP;
• AMP rilasciando il pirofosfato (attivazione di un AA, quindi sintesi della catena polipeptidica).

Un'altra caratteristica dei legami chimici è la libertà di rotazione. Legami covalenti possono andare incontro a libera rotazione soltanto se sono legami singoli (ciò non è permesso da legami covalenti doppi o parzialmente doppi), il che permette configurazioni alternative. È anche da ricordare che non tutte le configurazioni alternative sono in genere permesse, ma soltanto quelle stabili, cioè quelle in cui le posizioni dei residui laterali non destabilizzano la struttura.

La struttura primaria, i legami peptidici tra i vari residui amminoacidici, è alla base della formazione delle strutture di ordine superiore delle proteine. La rappresentazione schematica di un qualunque amminoacido mette in evidenza i gruppi funzionali e i residui laterali (R); le dimensioni, la forma e la natura chimica degli specifici residui laterali caratterizzano le specifiche capacità di legame di ogni singolo residuo amminoacidico. La natura dipolare del legame peptidico (un doppio legame parziale) determina la sua conformazione planare.

Soltanto il legame che lega il C-α, quello legato con il residuo R, con il C carbonilico e con l'N possono andare incontro a libera rotazione. Il che comporta la possibilità di formare legami ad idrogeno tra l'O del gruppo carbonilico e l'idrogeno del gruppo NH del residuo amminoacidico successivo o precedente, mediando la formazione di α-eliche o di foglietti β, sia paralleli che antiparalleli. Queste organizzazioni pongono i residui R, che sporgono dalle α-eliche o dai foglietti β, nelle condizioni di poter fare delle interazioni tra loro in base alle loro diverse caratteristiche chimico-fisiche, mediando l'assunzione di una struttura terziaria (ponti salini, legami di van der Waals, ponti idrogeno, legami idrofobici) o quaternaria (ponti disolfuro).

Nello stesso modo, per quanto riguarda gli acidi nucleici, i legami forti, legami fosfodiesterici, determinano la struttura primaria. I legami ad H tra le basi dei due filamenti determinano la struttura a doppio filamento. I legami elettrostatici, idrofobici, di van der Waals stabilizzano la struttura della doppia elica del DNA in cui i vari appaiamenti di basi sono impilati l'uno sull'altro. Inoltre alla base delle interazioni tra gli acidi nucleici (DNA ed RNA) e le proteine ci sono legami deboli, legami elettrostatici e legami H.

Ribosio e desossiribosio

Nel nucleotide è presente uno zucchero, che può essere o ribosio o desossiribosio, a seconda che nel carbonio 2' ci sia, rispettivamente, un gruppo ossidrile o meno. Il ribosio è, prima di tutto, un carboidrato, ed in particolare un pentoso ed un aldoso, perché possiede un gruppo aldeidico CHO. Sappiamo che possono esistere due configurazioni negli zuccheri:

• Configurazione D: se, nella proiezione di Fisher, l'OH è legato allo stereocentro più lontano dal carbonile si trova a DX;
• Configurazione L: se, nella proiezione di Fisher, l'OH è legato allo stereocentro più lontano dal carbonile si trova a SX.

Lo stereocentro è il carbonio chirale, ovvero lega quattro gruppi differenti. Il nostro è un D-ribosio, in cui l'OH, legato allo stereocentro più lontano si trova a DX. Ovviamente, la medesima regola vale per il desossiribosio.

Ricordiamo anche che il ribosio nel DNA non si trova lineare, ma è in configurazione ciclica; ciò è possibile perché tali monosaccaridi hanno sia un gruppo aldeidico che uno alcolico, e quindi possono formare un emiacetale ciclico per condensazione molecolare.

Il ribosio, in struttura circolare, è un furanosio, una molecola ciclica composta da 5 atomi, 4 di carbonio e uno di ossigeno. Nella ciclizzazione intermolecolare dello zucchero, il carbonio C1', carbonilico, diventa uno stereocentro e prende il nome di carbonio anomerico. Vi sono, infatti, due stereoisomeri della struttura del ribosio:

• α: nel quale l'ossidrile legato a C1' è in cis con gli altri gruppi ossidrilici, ma in trans rispetto al carbonio C5';
• β: quando l'ossidrile legato al C1' è in trans con tutti gli altri ossidrili e in cis con il carbonio C5'.

Puckering del ribosio

L’anello furanosico del ribosio non esiste come struttura perfettamente planare. Non è un pentagono come lo si usa disegnare secondo le proiezioni di Haworth (struttura emiacetalica), ma possiede una struttura tridimensionale, in cui i quattro elementi dell’anello (i vertici del pentagono) giacciono sullo stesso piano e un quinto membro dell’anello fuori dal piano, diviso in due emispazi opposti, chiamati emispazio α (eso/exo-space) ed emispazio β (endo-face). Questa conformazione viene chiamata a busta in quanto la sua struttura ricorda la forma di una busta aperta con la lingua sollevata, ed è la più frequente in soluzione. La conformazione alternativa è quella a sedia (vedi dopo nel twist).

Nell’unità di ribosio della maggior parte delle biomolecole in genere sono gli atomi di carbonio C2’ o C3’ ad assumere questa conformazione essendo fuori dal piano, cioè nello stesso emispazio dove si trova l’atomo di carbonio C5’ (configurazione C-endo) oppure nell’emispazio opposto (conformazione C-eso), mentre C1’, C4’ e l’atomo di ossigeno O giacciono sullo stesso piano (sono coplanari). Anche la nomenclatura sin/anti viene spesso usata. Tutto questo viene chiamato puckering dello zucchero.

La presenza di un gruppo OH in posizione 2′ del ribosio presente nella molecola di RNA forza il ribosio nella conformazione C3′-endo, a differenza della C2′-endo tipica del deossiribosio, generando così due molecole differenti tra loro.

Le configurazioni a twist del DNA

I twist del DNA sono delle conformazioni che vediamo nel ribosio e nel desossiribosio, in cui a cambiare la planarità sono contemporaneamente due atomi, C2' e C3'. Entrambe sono due conformazioni a sedia. Nelle doppie eliche, dove lo zucchero non è propriamente libero di muoversi, esso trova la conformazione più stabile possibile. Tra le conformazioni che si ritrovano più spesso nel DNA, identifichiamo la C2' eso-C3' endo e la C2' endo-C3' eso. Nel ribosio la conformazione C2' endo-C3' eso viene impedita perché l'OH è rivolta dallo stesso lato della base azotata e ciò porta ad una repulsione che rende impossibile tale conformazione.

Nella conformazione a twist sono presenti:

• Tre atomi coplanari C4', O4' e C1', che individuano il piano;
• Il carbonio C5' che individua lo spazio endo.

Sebbene in uno zucchero è più presente la conformazione a busta, nel DNA e nell'RNA la conformazione più frequente dello zucchero pentoso è quella a twist, perché lo zucchero è legato al fosfato e alla base e si trova in una catena polinucleotidica: tale contesto rende più stabile la conformazione a twist. Nel caso del DNA, il twist favorito sarà C2' endo-C3' eso, data l'assenza dell'ossidrile in posizione 2; nell'RNA, invece, per evitare l'ingombro sterico tra l'ossidrile in posizione 2 e la base azotata, quello più favorito è il C2' eso-C3' endo.

Infine bisogna dire che i nucleotidi in generale possono andare incontro a interconversioni per quanto riguarda il puckering, però quando si trovano all'interno di una catena polinucleotidica le costrizioni aumentano si hanno meno interconversioni tra i puckering e si va verso delle strutture twist obbligate.

Esistono anche delle specifiche preferenze di puckering per il nucleotide in soluzione perché essendo le basi azotate diverse come composizione e come sostituenti atomici, ci sono differenze di stabilità; per cui le pirimidine, ad esempio, mostrano una preferenza, ove possibile, per una conformazione C2' endo. Queste sono però regole generali per il nucleotide libero in soluzione. Mentre le purine sono più stabili con la conformazione C2' eso/ C3' endo.

Legami di rotazione

L'acido desossiribonucleico (DNA) viene chiamato così in quanto:

• Acido perché il gruppo fosfato deriva concettualmente dall'acido fosforico;
• Desossi-ribo, perché è un ribosio dove manca un OH sul carbonio 2';
• Nucleico, perché si trova nel nucleo.

Per capire la struttura del DNA dobbiamo fare la differenza tra tre parametri fondamentali:

• Distanza di legame R;
• Angolo di legame θ (teta): indica la rotazione di un gruppo rispetto ad un solo legame;
• Angolo torsionale φ (phi): rappresenta la rotazione attorno ad un legame centrale e coinvolge quattro atomi in sequenza.

Il DNA, come l'RNA, è formato da dei monomeri, chiamati nucleotidi, i quali sono uniti in lunghe catene non ramificate che permettono il passaggio dell'informazione genetica. Ogni nucleotide è costituito da:

• 2'-Deossiribosio (DNA) o ribosio (RNA): entrambi pentosi. Il nome 2'-deossiribosio indica che questo particolare zucchero è un derivato del ribosio in cui il gruppo idrossilico (-OH) legato al C2' del ribosio è stato sostituito da un idrogeno (-H);
• Una base azotata: cioè pirimidine (citosina, timina o uracile, quest'ultimo nell'RNA al posto della timina) o purine (adenina o guanina). La base è legata al C1’ dello zucchero attraverso un legame β-N-glicosidico con l’N1 delle pirimidine o l’N9 delle purine;
• Un gruppo fosfato: comprende una, due o tre unità fosfato legate al C5' dello zucchero. I fosfati sono denominati α, β e γ, con l'α-fosfato direttamente legato allo zucchero. Nel caso in cui il gruppo fosfato non sia presente, la molecola viene definita nucleoside.

Le basi azotate sono molecole aromatiche caratterizzate da particolari orbitali (6 orbitali p che si estendono al di sopra e al di sotto dell’anello) che si fondono tra di loro formando un anello al di sopra e al di sotto, garantendo alle basi di potersi impilare l’una sopra l’altra, dato che queste “nuvole elettroniche” permettono una certa interazione fra loro. Si dividono in purine e pirimidine.

Purine: presentano 2 anelli aromatici fusi tra loro, uno a 5 termini e uno a 6, che presentano 2 azoti nell'anello a 6 termini in posizione 1 e 3 e altri 2 nell’anello a 5 termini nelle posizioni 7 e 9, in cui vi è il legame β-glicosidico con lo zucchero. Le purine hanno 2 caratteristiche:

• L'adenina presenta un gruppo amminico (-NH₂) sul carbonio C6’;
• La guanina presenta un gruppo carbonilico in posizione 6 e un gruppo amminico sul C2’.

Le purine si attaccano allo zucchero con un legame β-glicosidico tra il carbonio C1' dello zucchero e l'azoto N9 della base.

Pirimidine: presentano un anello aromatico a 6 termini, in cui nella posizione 1 e 3 vi sono due azoti al posto del carbonio. Ogni pirimidina ha delle caratteristiche fondamentali:

• L’uracile presenta due gruppi carbonilici in posizione 2 e 4;
• La timina è uguale all’uracile, salvo che nel carbonio 5 presenta un gruppo metilico molto idrofobico;
• La citosina al posto del carbonile in posizione 4 presenta un gruppo amminico NH₂.

Le pirimidine si attaccano allo zucchero con un legame β-glicosidico tra il carbonio C1' dello zucchero e l'azoto N1 della base.

Le basi azotate presentano tautomeria, cioè la possibilità che gli idrogeni non assumano una posizione univoca, ma risuonino fra alcune posizioni chiave. Ad esempio, la citosina ha un gruppo amminico in posizione 4 che presenta una forma tautomerica in cui l’idrogeno del gruppo NH₂ si sposta sull’azoto in posizione 3, diventando un gruppo imminico NH (tautomeria immino-amminica). La tautomeria fa cambiare la natura atomica del gruppo, facendo diventare il gruppo NH, donatore di legami a idrogeno, mentre nella forma NH₂ diventa accettore di legami a idrogeno. Un’altra tautomeria importante è quella cheto-enolica, in cui il gruppo C=O diventa un gruppo C-OH ricevendo un idrogeno, ad esempio, come succede nella guanina.

Un nucleotide, quindi, è formato da:

• Uno o più gruppi fosfati (max 3);
• Uno zucchero (ribosio o desossiribosio);
• Una base azotata.

Il gruppo fosfato si lega per condensazione in posizione 5’ dello zucchero, mentre la base si lega in posizione 1’ (legame β-glicosidico, perché la base azotata si trova in posizione cis rispetto al carbonio 5’), eliminando una molecola d’acqua per ogni legame. Vi sono anche i nucleosidi, i quali non hanno i gruppi fosfati.

I legami nei nucleosidi trifosfati sono tra gruppi fosfati dei legami fosfoanidridici, mentre il legame fosfato-zucchero è un legame esterico.

Nel DNA vi sono due conformazioni più stabili dei nucleotidi, cioè la conformazione C2’ endo e la conformazione C3’ endo: se il C2’ sale in endo, il C3’ scende leggermente in eso, o viceversa, formando una conformazione non perfettamente a busta, ma a sedia. Questa piccola deviazione cambia il posizionamento degli atomi legati ai carboni, permettendo alla molecola di avere degli ingombri più stabili. Nell’RNA è più favor... (Il testo si interrompe qui)