Appunti di Biologia molecolare

IPOTESI DEL VACILLAMENTO

Il codice genetico comprende 61 codoni di senso, diversi fra loro, quindi ci dovrebbero essere 61 tRNA con 61 anticodoni diversi. Ma i tRNA possono riconoscere codoni diversi che codificano per lo stesso aminoacido. La base in 5’ dell'anticodone può appaiarsi in modo meno specifico con la terza base del codone. È stata avanzata l'ipotesi del vacillamento, per cui terza base del codone. L'inosina deriva dalla deaminazione ossidativa dell'adenina. La sua presenza nell'anticodone in 5' del tRNA permette una maggiore flessibilità di interazione con la terza base del codone (A, U, C). UN’AMINOACIL-tRNA SINTETASI PER OGNI AA E GRUPPO DI tRNA ISOACCETTORI L'enzima lega 3 substrati: aminoacido, tRNA, ATP. Il legame tra il tRNA e l'aminoacido è un legame estereo tra il gruppo carbossilico -COOH dell'aminoacido e il gruppo -OH in 2’ o in 3' dell'adenosina terminale. Il legame estereo tra aminoacido.

E il tRNA è ad alta energia, energia che viene usata per la formazione del legame peptidico a più bassa energia durante la sintesi proteica. L'amminoacido attacca prima il fosfato in α dell'ATP diventando un AMMINOACIDO ADENILATO. Interviene poi il tRNA che attacca il carbonile dell'amminoacido liberando AMP e formando l'AMMINOACIL-tRNA.

Tutti i tRNA sono trascritti come precursori più grandi, i pre-tRNA. I pre-tRNA possono avere da 1 a 7 tRNA diversi. Nella maturazione dei pre-tRNA intervengono:

• la RNasi P: taglia all'estremità 5' del tRNA. È un complesso non covalente tra una molecola di RNA di 377nt con una proteina di 20KDa. L'attività catalitica è svolta dalla componente RNA e non dalla proteina. Esempio di Ribozima
• la RNasi D: taglia i nucleotidi in più all'estremità 3'. Si ferma quando raggiunge la tripletta CCA. Altri enzimi modificano le basi e gli zuccheri.

Nel caso in cui viene perduta l'estremità 3'-CCA interviene la NUCLEOTIDIL-CCA TRASFERASI. DECODIFICAZIONE DEL CODICE GENETICO: SINTESI DI POLIRIBONUCLEOTIDI SINTETICI I poliribonucleotidi sintetici possono essere sintetizzati in vitro mediante un enzima, la polinucleotide fosforilasi. La reazione catalizzata è la seguente: La reazione può procedere in entrambe le direzioni ma, alle concentrazioni fisiologiche, è favorita la fosforolisi dell'RNA anucleotidil-difosfato. Al contrario, alle alte concentrazioni di nucleotidil-difosfato, è favorita la sintesi del RNA. La composizione in basi dell'RNA sintetizzato dipende dal o dagli NDP utilizzati, e dal loro rapporto. Utilizzando ADP + UDP, si ottiene un copolimero misto di A e U, con sequenza casuale, e con frequenze delle singole basi determinate dalla concentrazione relativa dei reagenti. Con gli esperimenti fatti con ogni combinazione di basi, sono stati identificati 61 codoni per i

rispettivi amminoacidi specifici. Trecodoni sono di terminazione della traduzione. Alcuni amminoacidi sono codificati da più di un codone: ecco perché il codice genetico è definito degenerato.

IL CODICE SI È EVOLUTO PER MINIMIZZARE L'EFFETTO DELLE MUTAZIONI

• Se la I° e II° base è una G o C, la 3° posizione può cambiare e codificare lo stesso amminoacido
• Se la I° e II° base è una A o U, la 3° posizione può fare differenza

L'appaiamento forte G/C fa tollerare la 3° posizione:

1. Mutazioni in prima posizione sono spesso silenti e codificano per lo stesso amminoacido; oppure sono neutre e danno luogo a cambio con amminoacidi simili e quindi senza grosse alterazioni nella funzione della proteina
2. Codoni con la pirimidina in 2° posizione codificano per amminoacidi idrofobici
3. Codoni con la purina in 2° posizione codificano per amminoacidi polari

Transizioni in questa posizione generano codoni per

aminoacidi simili

3. Transizione in 3° posizione genera codoni quasi sempre dello stesso aminoacido

Trasversione in 3° posizione genera codoni solo il 50% volte con un cambio dell'aminoacido

TRANSIZIONE = sostituzione di purina con purina e pirimidina con pirimidina

TRANSVERSIONE = sostituzione di purina con pirimidina e viceversa

tRNA INIZIATORE

• Nei batteri il codone di inizio può essere AUG O GUG
• La metionina rappresenta il 1° aminoacido di tutte le proteine anche se in alcune può essere rimossa.
• I tRNA che caricano la metionina sono 2: il tRNAmet e il tRNAfmet
• Il N-formil-metionil-tRNA (tRNA fmet) rappresenta il tRNA iniziatore, possiede il gruppo NH2 bloccato e il suo anticodone 3'-UAC-5' può interagire con i due codoni 5'-AUG-3' a e 5'-GUG-3'.
• Il tRNAmet riconosce solo il codone AUG (interno alla sequenza codificante), mentre il codone GUG (interno alla sequenza codificante) è riconosciuto dal

tRNA_val.Il tRNA_fmet è sintetizzato aggiungendo il gruppo formile, ricavato dal formil-tetraidrofolato, a un tRNA_met già sintetizzato.

DIFFERENZE TRA tRNA_met e tRNA_fmetNegli eucarioti AUG è il codone di inizio ma è possibile ci siano codoni diinizio alternativi.Ci sono poi due tRNA per la metionina, uno per l'inizio della traduzione euno per l'allungamento della catena polipeptidica. In entrambi però nonc'è la FORMILAZIONE.Nei mitocondri il codone di inizio può essere sia AUG che AUA. Il tRNAiniziatore è il formil-metionil-tRNA (come nei procarioti).IL CODICE MITOCONDRIALE SI DISCOSTA DI POCO DA QUELLO UNIVERSALEAGG è un codone di stop, anziché per ArgininaAUA è un codone di inizio per la metionina e non per IsoleucinaUGA è un codone per il triptofano e non un codone di stopNei mitocondri di altri eucarioti le differenze possono essere altre.

REAZIONIIL RIBOSOMA PROCARIOTICOSono organelli sub-cellulari,

sedi della sintesi proteica. Sono costituiti da due subunità: piccola (minore) e grande (maggiore). Sono costituiti da complessi di RNA ribosomiale associato a proteine. S = Svedberg = unità di misura del coefficiente di sedimentazione rpS = ribosomal protein SMALL → subunità minore rpL = ribosomal protein LARGE → subunità maggiore È stata determinata la sequenza dell'rRNA e della maggior parte delle proteine. Funzioni rRNA: - Interagire con mRNA e con gli adattatori tRNA. - Ruolo strutturale: le proteine si legano a siti specifici dell'rRNA secondo un ordine specifico. - Il ribosoma ha diversi centri attivi, ognuno costituito da un gruppo di proteine ribosomiali. IL RIBOSOMA EUCARIOTICO STRUTTURA DEL RIBOSOMA Il modello della struttura è stato ottenuto mediante studi di cristallografia a raggi X associata a tecniche di marcatura delle singole proteine e formazione di legami crociati tra proteine tra di loro e con l'rRNA. L'aspetto

importante è che I'RNA costituisce la maggior parte del ribosoma, e funge da impalcatura portante per le proteine associate prevalentemente sulla superficie esterna dell'rRNA.

TRE SITI PER I tRNA

Per i tRNA ci sono tre siti:

• II sito PEPTIDILICO (P), che porta il peptidil-tRNA con la catena peptidica in allungamento
• Il sito AMINOACILICO (o Accettore) (A), che lega l'aminoacil-tRNA in ingresso
• II sito di USCITA (Exit) (E), da cui fuoriesce il tRNA scarico

Entrambe le due subunità del ribosoma concorrono a formare i siti P e A.

Nei due siti P e A i tRNA sono orientati con la L rovesciata, ossia con l'anticodone rivolto verso la subunità piccola e il gambo accettore verso la subunità grande, in particolare nel sito della peptidil-transferasi (sito dove si vengono a formare i legami peptidici).

FASI DELLA SINTESI PROTEICA

La sintesi proteica è un processo suddiviso in FASI. Richiede l'intervento di diversi componenti, tra cui il ribosoma,

gli aminoacil-tRNA, l'mRNA e vari fattori proteici. La sintesi proteica procede con una direzione ben specifica, dal terminale amminico a quello carbossilico (NH2 → COOH). Nella sintesi proteica si distinguono tre fasi: - Fase di Inizio: è la fase lenta della sintesi proteica e precede la formazione del primo legame peptidico. In questa fase si assemblano le due subunità del ribosoma, lo stampo e il tRNA iniziatore. - Fase di Allungamento: comprende tutte le reazioni che vanno dal primo all'ultimo legame peptidico. - Fase di Terminazione: in cui la catena polipeptidica viene rilasciata dal ribosoma e il ribosoma si dissocia dall'mRNA stampo. INIZIO DELLA TRADUZIONE NEI PROCARIOTI Nella fase di inizio, sono coinvolti tre fattori di inizio della sintesi proteica: IF1, IF2 e IF3. Inizialmente, la subunità minore del ribosoma si associa ai due fattori IF1 e IF3, con IF3 fattore di anti-associazione, in quanto mantiene le due subunità ribosomali.

dissociate fra loro. Successivamente al complesso si assemblano l'mRNA e un complesso ternario formato da IF2, GTP e il tRNA iniziatore (formil-metionil-tRNA). Si forma così il COMPLESSO DI INIZIO 30S. Il fattore IF2 è una GTPasi, in grado di idrolizzare il GTP. Il GTP viene idrolizzato a GDP e Pi, permettendo al tRNA iniziatore di prendere posto nel sito P in cui è presente il codone AUG dell'mRNA, e il rilascio di tutti e tre i fattori. Infine si associa la subunità maggiore 50S, per formare il ribosoma completo 70S.

INIZIO DELLA TRADUZIONE NEGLI EUCARIOTI

Negli eucarioti, ci sono tre fattori di inizio della sintesi proteica assimilabili a quelli procariotici: eIF1, eIF2 e eIF3, alcuni di essi formati da più subunità proteiche. Tutti interagiscono con la subunità minore 40S. eIF3 è il fattore di anti-associazione, mentre eIF2 forma il complesso ternario con GTP e con il Met-tRNA iniziatore. Altri fattori sono coinvolti:

• eIF4

è un complesso di proteine con la funzione di riconoscere il CAP e richiamare la subunità minore 40S. Ha attività elicasica, in grado di svolgere le strutture secondarie dell’mRNA.

eIF5 ha attività GTPasica, collocando il complesso ternario nel sito P parziale della subunità 40S del ribosoma, formando il complesso di pre-inizio 43S.

Dopo il complesso 43S si associa ora all’mRNA in corrispondenza del cappuccio grazie anche al fattore eIF4. Inizia quindi la scansione dell’mRNA fino al codone AUG, nella quale viene consumato ATP (SCANNING MODEL).

Infine, la subunità maggiore 60S si associa al complesso di pre-inizio, tutti i fattori vengono rimossi, e si forma il complesso finale di 80S.

FASE DELL’ALLUNGAMENTO NEI PROCARIOTI

Nella fase di allungamento sono coinvolti i fattori di allungamento, EF-Tu, EF-Ts e EF-G.