Appunti completi di biochimica

Biochimica

Prof.ssa Luigia Pazzagli

Laboratorio

3 giorni, 2 gruppi

Prima esercitazione

Uso di micropipette, dosaggio delle proteine, teoria 31/11 + 6/8 nov

Seconda esercitazione

Dosaggio di enzimi e metaboliti, teoria 5/11 + 13/15 novembre

Terza esercitazione

Elettroforesi e cromatografia, teoria 12/11 + 20/22 novembre

Appelli

3-4 tra gennaio e febbraio, aprile

Testi consigliati

• “Biochimica” di Jeremy Berg, Zanichelli
• “I principi di biochimica di Lehninger”, Zanichelli

Esami

Pre-esame scritto, scrivere alcune formule di importanti molecole biologiche o composti coinvolti nelle principali vie metaboliche, dura 15-20 minuti. 4 domande, stesso giorno dell’orale; risultati comunicati subito e poi esame orale.

Per moodle

2019-BioChim

Cosa studia la biochimica?

Basi di citologia e chimica organica

• Livello 1: unità monomeriche (nucleotidi, amminoacidi, zuccheri)
• Livello 2: macromolecole (DNA, proteina, cellulosa)
• Livello 3: complessi sopramolecolari (cromatina, membrana plasmatica, parete cellulare)
• Livello 4: cellula e i suoi organelli

Unità di misura

Micron - nanometri - Armstrong - Dalton (massa atomica delle molecole, quindi peso molecolare)

Le macromolecole biologiche

1. Amminoacidi —> sequenza amminoacidica —> proteina
2. Basi azotate (adenina, citosina, guanina, timina) —> DNA
3. Fosfolipidi, con testa idrofilica e code idrofobiche —> membrana plasmatica
4. Glucosio —> glicerolo

Alcuni richiami di chimica organica

Stereochimica, isomeria, legami e geometria. Amminoacidi -> gruppo amminico e gruppo carbossilico, composti chirali con C centrale come centro chirale, composti della serie D e L (nostro organismo ha scelto la serie L). Lipidi: catena alchilica idrofobica. Gruppo aldeidico COH nel glucosio. Gruppo chetonico CO (doppio legame) nel fruttosio. Legami tra due composti esempio: legame anidrinico (tra due acidi) vs legame estere (tra residuo alcolico e acido) -> ATP ha due legame anidrinici e un legame estere. Geometria tetraedrica Legame singolo libero di ruotare Legame doppio con restrizioni di rotazione.

Bioenergia delle reazioni

Reazioni endoergoniche e esoergoniche: ΔG = variazione di energia libera. Temperatura e pH costanti nella biochimica (condizioni standard del corpo umano). DNA = acido desossiribonucleico. ATP —> adenosina trifosfato = carburante dell’organismo, fornisce energia libera rendendo reazioni irreversibili -> reversibili; Formata da 3 gruppi fosfato + adenina (base azotata) + zucchero ribosio. ATP può scindersi (ΔG < 0, cioè -31 kg/mol, avviene liberazione di energia) in ADP + gruppo fosfato P (ortofosfato).

Legami chimici

Legame tra gruppo alcolico e gruppo acido —> legame estere, si libera H₂O, resta solo O. La rottura del legame estere non libera energia. Legame tra due acidi —> legame anidrinico, se si aggiunge un altro gruppo fosfato a sinistra. Produciamo ATP partendo dalle reazioni cataboliche di molecole complesse (prodotti finali: molecole più semplici e ATP).

L'importanza dei legami deboli

• Proteine speciali: gli enzimi
• Il legame a idrogeno
• Interazioni idrofobiche e forze di Van der Waals (elettrostatiche)
• Esempio: interazioni deboli che governano il contatto tra enzima e il suo substrato —> molecole di H₂O che formano legami con gruppi OH dello zucchero, solubile; quando avviene l’interazione substrato-enzima, l’acqua viene espulsa e il complesso enzima-substrato è stabilizzato dalla formazione di legami a idrogeno, interazioni ioniche e idrofobiche.

Costante di dissociazione acida Ka

Acido lattico: pKa= 3,5 cioè con pH < 3,5 lo troviamo nella forma COOH con pH > 3,5 lo troviamo nella forma dissociata COO^-; nell’organismo (pH 7) quindi è sempre dissociata.

Molecola anfipatica

Presenta parte idrofilica e parte idrofobica, esempio: fosfolipidi della membrana cellulare. Acidi grassi idrofobici (code). Testa polare idrofilica per permettere interazioni con componenti acquosi.

Carboidrati e glicobiologia

Monosaccardi: aldosi e chetosi

Chimica strutturale degli zuccheri. Enantiomeri della gliceraldeide. Enantiomeri della gliceraldeide D- L- (configurazione intorno al centro chirale più lontano dal gruppo carbonilico). Glucosio e galattosio sono epimeri. Epimero: ha gli stessi gruppi funzionali, cambia solo la posizione. Isomero: hanno gruppi e legami diversi. Se differiscono solo nella configurazione intorno a un C sono epimeri.

Forme aperte e forme chiuse

Approssimazioni delle forme reali. Glucosio. I monosaccaridi sono legati ad alcool e ammine mediante legami glicosidici. Il legame glicosidico si riferisce al fosforilato dall’ATP legame covalente che unisce il gruppo emiacetalico di uno zucchero con un atomo, di solito nucleofilo, di un'altra molecola. Di solito l'atomo è di ossigeno, azoto o zolfo: i legami corrispondenti sono detti O-glicosidici, N-glicosidici e S-glicosidici. La molecola che ne deriva è invece detta glicoside.

Disaccaridi

• Maltosio: glucosio + glucosio, legame glicosidico α 1,4 (può essere α o β a seconda se è sopra o sotto)
• Lattosio: galattosio + glucosio, legame β 1,4
• Saccarosio: fruttosio + glucosio, legame α 1,4

Polisaccaridi

Glicogeno e amido: due omopolisaccaridi di riserva. Amido —> residui di glucosio in fila, legami alfa 1,4, filamento lineare. L'amido è composto da due polimeri: amilosio (che ne costituisce circa il 20%), amilopectina (circa l’80%). Conformazione a sedia e struttura a spirale. Il glicogeno è il nostro carboidrato endogeno di riserva. Amido è lineare, glicogeno è ramificato. Glicogeno —> residui di glucosio in fila, filamento lineare ramificato nei legami glicosilici alfa 1,6. Catena principale con legami alfa 1,4, ramificazione con legami alfa 1,6.

Cellulosa e chitina

Polisaccaridi con ruoli strutturali. La cellulosa è un carboidrato formato da circa 7000 monomeri di glucosio. È molto simile all'amilosio ma la differenza fondamentale risiede nel tipo di legame. Nell'amido il legame è di tipo α(1→4) mentre nella cellulosa è di tipo β(1→4). Cellulosa: D-glucosio con legami β 1,4. Fibra insolubile. Polisaccaride con monomeri di glucosio con legami in posizione beta che lo rende indigeribile (come amido ma amido ha legami alfa 1,4).

Chitina

La chitina è il derivato degli amminozuccheri più importante. È un polisaccaride costituito da unità di 2-acetammido-2-desossiglucosio unite con legami β-1,4 in maniera analoga a quella riscontrata nella cellulosa. Le estese catene di chitina sono generalmente aggregate in lamine e unite da legami a idrogeno; le varie modalità di aggregazione di tali lamine determinano le tre forme cristalline note della chitina. La chitina è insolubile in acqua, negli acidi diluiti e negli alcali. Può essere parzialmente diacetilata; il prodotto corrispondente (chitosano) trova varie applicazioni in fotografia e nell'industria tessile.

Eteropolisaccaridi

Polisaccaridi modificati

Glicosaminoglicani, formati da unità disaccaridiche che si ripetono; formano la matrice extracellulare. Ha gruppi che possono essere idratati. Acido ialuronico: legame glicosilico (eliminazione di H₂O da due gruppi alcolici) avviene tra posizione 1 e 3 quindi beta 1,3. Non si può scindere, funzione strutturale.

Altri polisaccaridi strutturali

Proteoglicani: proteine + zuccheri. Gli zuccheri sono importanti anche perché si uniscono alle proteine formando complessi particolari, utili al riconoscimento cellulare. Glicoproteine: oligosaccaridi legati covalentemente a proteine di superficie. Sono riconosciuti dalle lectine. La parte saccaridica è minore di quella proteica, sono legati a Ser o Asn. Sono sia extracellulari (es. mucine con legami O-glicosidici), che di membrana (glicoforina A della membrana eritrocitaria), che citoplasmatiche (IgG, immunoglobuline, ormoni come l’FH, LH, TSH e l’eritropoietina- EPO-); i gruppi sanguigni AB0 sono determinati da diverse glicosilazioni di antigeni (proteine) della membrana eritrocitaria. Con l’azoto: N glicoproteine. Con l’ossigeno: O glicoproteine.

Lectine

• Proteine (glicoproteine) che legano i carboidrati.
• La complessità e la diversità delle catene glicosidiche fa sì che i carboidrati siano molecole in grado di portare molte informazioni (codice saccaridico).
• Alcuni esempi: selectine (mediano il riconoscimento e l’adesione cellula-cellula come il movimento dei neutrofili da sangue ai tessuti durante un’infiammazione; sono coinvolte nell’artrite reumatoide, psoriasi, rigetto ai trapianti); emoagglutinina (lectina del virus dell’influenza, essenziale per la penetrazione nelle cellule ospiti, riconosce residui di acido sialico legati a galattosio).
• Le lectine dell’Herpes simplex interagiscono con l’eparan solfato della cellula ospite.
• La lectina dell’Helicobacter pilori interagisce con glicoproteine dell’epitelio gastrico.
• Le lectine della tossina del colera e della pertosse interagiscono con fosfolipidi e acido sialico, rispettivamente, delle cellule ospiti.
• Lectine intracellulari situate sul ER aiutano il folding proteico permettendo l’interazione con la disolfuro isomerasi.

Lipidi

—> Di riserva, strutturali, come segnali. Lipidi di riserva: acidi grassi e trigliceridi. Sia omega 3 che omega 6: sono presenti insaturazioni (legami doppi). Fa diminuire l’infiammazione. Fa aumentare l’infiammazione.

Acidi grassi

Gli acidi grassi si impacchettano in aggregati stabili. Circolano nel sangue veicolati dall’albumina. Trigliceridi: esteri (legame tra funzione grassa dell’acido grasso e acida del glicerolo = alcool, con liberazione di una molecola d’acqua) di acidi grassi con il glicerolo con attaccati gli acidi grassi. Vengono immagazzinati negli adipociti da cui sono liberati per effetto di una lipasi (ormone sensibile). Costituiscono una formidabile forma di energia sia perché gli atomi di C dei grassi sono più ridotti di quelli degli zuccheri, sia perché sono idrofobici, non idratati (non devono portare un peso extra di energia). Il glicogeno può fornire energia per 1 giorno, i grassi per 1 mese! Sono una delle forme principali dei lipidi. Atomo di carbonio è nella sua forma più ridotta. Si libera più energia per arrivare alla sua ossidazione finale CO₂.

Lipidi di membrana

Fosfolipidi: sono molecole strutturali, componenti delle membrane biologiche. Sono esteri del glicerolo, hanno una testa polare formata da un gruppo fosforico e da un alcool e una coda idrofobica costituita da due acidi grassi (glicerosfingolipidi: lo scheletro è quello del glicerolo). Sfingolipidi: lo scheletro è sfingosina a cui è legato un acido grasso e uno zucchero o fosfatidil colina. Hanno funzioni strutturali e portano segnali all’interno della cellula.

Sfingolipidi

A differenza dei fosfolipidi, testa polare e code idrofobiche ok, ma non c’è glicerolo. Glicerofosfolipide: hanno acidi grassi legati tramite legame estere: i plasmalogeni (di cui sono ricche le membrane del tessuto cardiaco e le membrane di alcuni batteri) e il fattore che attiva le piastrine che viene rilasciato dai leucociti basofili e stimola l’aggregazione piastrinica e la secrezione di serotonina da parte delle piastrine stesse. Gangliosidi: sono sfingolipidi complessi che hanno teste polari formate da oligosaccaridi complessi che terminano con un residuo di acido N-acetil-neuraminico (acido sialico), sono abbondanti sulla superficie esterna delle cellule e sembrano coinvolti nella differenziazione di cellule tumorali. Aiutano per la formazione del coagulo, sono lipidi importanti per i segnali.

Lipidi come segnali

Colesterolo e ormoni steroidei. Colesterolo: dentro la membrana nucleare. Funzione strutturale importante, regola la fluidità della membrana. Dal colesterolo derivano gli ormoni steroidei, vitamina D (con la luce solare). Fosfatidil-inositolo e derivati della sfingosina. Sulla faccia interna delle membrane cellulari il fosfatidil-inositolo 4,5-BP in risposta a stimoli ormonali che attivano una lipasi si scinde in IP₃ (inositolo 3P) e diacilglicerolo. L’IP₃ induce aumento di Ca²⁺ intracellulare e attivazione delle chinasi, enzimi che fosforilano altre proteine intracellulari portando un’informazione dall’esterno all’interno della cellula. Eicosanoidi: prostaglandine, trombossani, leucotrieni. Derivano tutti dall’acido arachidonico. Segnale che induce l’infiammazione. Inibitore.

Nucleotidi

Le basi azotate si sintetizzano a partire dagli amminoacidi. Trovare la logica nelle formule! Stesso scheletro di base, sostituenti diversi. Il legame a idrogeno si forma ad esempio tra il gruppo carbonilico della guanina e il gruppo azotato della citosina.

Deossiribonucleotide

C’è lo zucchero deossiribosio. Ribonucleotide: (manca ossigeno nella posizione 2) la base azotata si unisce con ribosio e gruppo fosfato. Mattoncino del DNA e non solo.

Assorbimento della luce

Le basi azotate sono formate da tanti doppi legami alternati: hanno la capacità di assorbire la luce. I nucleotidi trasportano energia chimica nella cellula. L’idrolisi del legame estere libera circa 14 kJ/mole mentre l’idrolisi di uno dei due legami fosfoanidridici libera circa 30 kJ/mole. ATP: ribonucleotide, adenosina trifosfato (3 gruppi fosfato legati con legami diversi!). Ultimo atomo di fosfato: fosfato in posizione gamma poi posizione beta e poi alfa.

Stabilità del legame estere

Estere è più stabile dell’anidride quindi libera meno energia quando si rompe per idrolisi. I nucleotidi adenilici fanno parte di molti cofattori enzimatici. Coenzima A da vitamina B5. NAD deriva da B3. FAD deriva da B2. Parte in bianco della molecola = parte reattiva, vitamina. Gruppo fosfato in questi casi: ruolo strutturale.

Molecole regolatrici

Alcuni nucleotidi agiscono da molecole regolatrici. In seguito all’interazione di recettori con i loro effettori (ormoni, segnali di crescita ecc... definiti primi messaggeri), all’interno della cellula si producono secondi messaggeri che inviano il segnale ad altre molecole al fine di indurre l’adattamento alla nuova situazione. L’adenosina 3’,5’- monofosfato ciclico (AMP ciclico, si trova nelle vie di segnalazione della glicemia, livello di glucosio nel sangue) svolge funzioni in tutte le cellule ad eccezione di quelle vegetali. Ruoli analoghi sono svolti anche dal GMP ciclico.

Amminoacidi

C (alfa) è SEMPRE un centro chirale TRANNE nella GLICERINA (ha H come gruppo R) quindi che tutti i sostituenti diversi (molecole otticamente attive). Gruppo carbossilico. Le forme D e L sono una classi di stereoisomeri detti diastereoisomeri (nelle proteine ci sono solo forme L). Gli AA vengono classificati in base alla natura del gruppo R. Funzione strutturale (monomeri delle proteine anche globulari che funzionano da enzimi quindi funzione metabolica) e funzione metabolica, compongono le proteine presenti nella nostra dieta, forniscono energia (stessa quantità dei carboidrati). Abbiamo 20 amminoacidi con caratteristiche peculiari.

Modalità di dissociazione degli amminoacidi

Forma zwitterionica: gruppo amminico protonato e gruppo carbossilico è carico negativamente (a pH 7, forma di base).

Classificazione degli amminoacidi

• Alifatici non polari (catena laterale idrofobica): Ala, Val, Leu, Ile, Gly, Met, Pro
• Aromatici (gruppo aromatico nella catena laterale): Tyr, Phe, Trp
• Polari non carichi (catena laterale polare idrofilica): Ser, Thr, Cys, Asn, Gln (cistina)
• Basici: Arg, Lys, His
• Acidi: Asp, Glu

Modo di rappresentazione degli AA per la scrittura dei legami peptidici

Glicina e Alanina. La Gly è l’unico AA privo di centri chirali. Funzione metabolica: porta all’interno della cellula gruppi carboniosi per la metilazione. Funzione strutturale: dentro catena polipeptidica, la piccola catena laterale permette a questo AA una alta mobilità e si trova facilmente nei β-turn. La sua mobilità è destabilizzante per le strutture secondarie. Nella catena polipeptidica crea uno “spazio vuoto” che permette l’alloggiamento di altre strutture ad esempio all’acido miristico e serve a fornire siti di riconoscimento tra le varie cellule. Può essere un sito di miristilazione quando si trova in posizione N-terminale. Gly e Pro si trovano spesso nei siti antigenici che si identificano spesso con β-turn esposti.

Serina e Treonina

(Thr ha un gruppo CH₃ in più rispetto alla Ser). Ser e Thr con il loro gruppo idrofilico partecipano alla formazione di legami a idrogeno con l’acqua sia quando sono presenti sulla superficie esterna (legami con l’acqua di idratazione che rendono la proteina solubile in acqua) sia quando si trovano all’interno della struttura. La Ser spesso è presente nel sito attivo degli enzimi.