Appunti completi del corso "Chimica Analitica Strumentale"

STATISTICA

Esempio: analisi di Piombo in acqua di rubinetto che dà come risultato 52 µg/L, sapendo che per legge la

concentrazione massima consentita è 50 µg/L, il campione ha una concentrazione che eccede il limite di legge?

Se questi sono gli unici dati che si hanno, non si può rispondere a questa domanda perché l’incertezza di misura

non è stata dichiarata, il dato deve essere quindi sempre affiancato dall’incertezza per sapere con quale pre-

cisione è stato misurato, se incertezza molto piccola allora il campione eccede il limite di legge, ma se l’incer-

tezza è superiore a 2 allora il campione ha una concentrazione che non eccede il limite di legge.

rappresenta l’intervallo entro il quale ci si aspetta che vadano a cadere, con una certa probabilità,

L’incertezza l’incertezza di misura, altrimenti il dato non ha

misure replicate del campione. È molto importante riportare

significato, perché non si sa dire quanto è realistico e affidabile quel valore.

Quando si mette a punto un metodo analitico, si devono stabilire quali sono le figure di merito del protocollo

analitico, cioè le caratteristiche del metodo quali: precisione, accuratezza, sensibilità, limite di rivelabilità e di

quantificazione, intervallo di lavoro, selettività e robustezza.

• La robustezza identifica la capacità di un metodo di riuscire ad avere dati finali che non vengono influenzati

dalla complessità della matrice. Un metodo è robusto se riesce a lavorare in modo preciso e accurato con

matrici diverse tra loro mentre è poco robusto se una piccola variazione della concentrazione della matrice

ha un effetto rilevante in termini di accuratezza e precisione, ad esempio i metodi UV-visibili perché la

per diminuirne la complessità prima di eseguire l’analisi. Quindi

matrice deve essere fortemente trattate

è la capacità di riuscire a lavorare con matrici molto differenti.

• L’accuratezza è la differenza tra il valore vero e la media dei valori ottenuti dopo un certo numero di repli-

cati, se tutti i dati sistematicamente sono superiori al valore vero si ha una media più alta. Un metodo

analitico è tanto più accurato quanto più la differenza tra valore medio e media dei replicati è bassa. Un

metodo è poco accurato quando x medio è molto distante dal valore vero.

• La precisione è la dispersione dei dati sulla curva. Un metodo è tanto più preciso quanto i dati replicati

sono poco dispersi sull’asse delle x.

ERRORI

Ha senso parlare di probabilità quando un certo valore di replicato cade in un intervallo di differenti valori. In

riportata sull’asse

un grafico, la curva continua rappresenta la densità di probabilità, delle y, quindi per calco-

lare la probabilità si deve integrare la curva nell’intervallo preso.

Ogni volta che si fa una misura sperimentale si avranno degli errori nella misura che non ci permetteranno mai

di ottenere valori uguali agli standard certificati, dovuti a errore umano o strumentale, questi errori sono de-

errori casuali che agiscono in modo random sulle analisi. Essi influenzano la larghezza della distribuzione

finiti

dei dati, alcuni valori saranno minori o maggiori di x medio. Un metodo, quindi, è tanto più preciso quanto più

gli errori casuali sono contenuti. Gli errori sistematici, invece, sono errori che agiscono sempre in una direzione

bias, ci sono casi in cui

determinati spesso da un interferente. La presenza di errore sistematico viene definito

si può decidere di risolvere il problema operando in modo corretto e in altri in cui non è possibile avere una

soluzione (ad esempio analisi del COD, determinazione cloruri, sempre in difetto, dato che il bias non è

eliminabile si può correggere matematicamente applicando un fattore correttivo).

di fare una retta di calibrazione in unità di assorbanza sull’asse

Esempio: si suppone

delle y e sull’asse delle x la concentrazione. Si determini la concentrazione dei

l’assorbanza sfruttando l’equazione della

fosfati in acqua distillata misurando e

retta per determinare la concnetrazione. Se invece si analizza un campione in acqua

di mare (35g/L NaCl), l’analisi all’UV-visibile fornisce una calibrazione diversa dalla

precedente. Quindi per una matrice diversa si dovrà usare una retta di calibrazione

da cui si ricava il valore esatto della concentrazione, se si usa la stessa retta di quella dell’acqua

differente

distillata la concentrazione rilevata è scorretta e si ha errore sistematico, quindi una accuratezza minore.

→

Errore grossolano errori che statisticamente non vengono considerati, sono causati dalla inaccuratezza

dell’operatore (calcoli o manualità).

Se gli errori random agiscono in direzione imprevedibile sia in eccesso che in difetto, quello

che si ottiene è una distribuzione descritta in termini di densità di probabilità da una gaus-

siana, cioè una curva continua che non ammette come soluzione un integrale definito, ma

L’integrale

deve essere calcolato numericamente cioè per elementi finiti. calcolato numeri-

è la sommatoria delle aree per un determinato numero ∆x lim(∆x) →

camente con 0, la

soluzione dell’integrale è migliore quando intervallo ∆x è piccolo. In assenza di errore sistematico, si confonde

la funzione continua con il sistema discreto ottenuto da n replicati al quale si può calcolare un valore medio,

curva normale di distribuzione, perché è quello

determinando la deviazione standard. La gaussiana è definita

che accade nel caso in cui gli errori sistematici agiscono in difetto o in eccesso. Non tutti gli strumenti produ-

cono una curva normale di distribuzione, perché per n replicati si usano diversi strumenti si possono ottenere

curve simili alla gaussiana oppure curve distorte, in base a come agiscono gli errori causali.

Sigma è la deviazione standard calcolata su una curva continua, è circa S quando si ha un numero sufficiente-

mente elevato di replicati (>20) e il valore è affidabile. Se è <20 allora si determina S, cioè la stima di sigma.

Come valutare numericamente la PRECISIONE e ACCURATEZZA di un metodo

Si sfrutta la curva normale di distribuzione, perché basta fare n analisi replicate di un qualsiasi campione (non

per forza standard) e si calcola la deviazione standard determinando il livello di confidenza. Se uno strumento

o un protocollo analitico distribuisce i replicati secondo una curva normale di distribuzione è noto che l’inte-

e +σ vale 68.2% che è l’area sottesa dalla gaussiana, se tra e +2σ vale 95% e se

grale trovato tra -σ -2σ tra -3σ

e +3σ vale 99%. In termini di probabilità queste percentuali significano che se si esegue un altro replicato si

e +σ, il 95% tra e +2σ e il 99% tra e +3σ.

avrà il 68.2% che il suo valore sia tra -σ -2σ -3σ Z score è un valore

mette davanti a sigma per stabilire il livello di copertura, cioè l’area della gaussiana di inte-

frazionario che si

resse, Z è tabulato e si può scegliere il suo valore in base all’area.

La curva normale di distribuzione permette di determinare il valore di accuratezza ma solo se si hanno standard

certificati. Bisogna vedere se la media delle analisi replicate coincide con il valore noto e determinare quanto

si discosta dal valore vero. La deviazione standard si riferisce al livello di probabilità che ha il singolo replicato

di cadere in un certo intervallo, perciò il valore di deviazione standard si applica solo al valore del singolo

replicato, quindi è una misura della precisione da applicare al singolo. Se si eseguono n analisi e si fa la media,

ci si deve aspettare che la precisione che si assegna alla media è migliore della precisione che si assegna al

√

singolo, quindi la media è più affidabile del singolo cioè è più precisa, di quanto? di che rappresenta il

numero di replicati eseguiti. Quando N è grande la deviazione tende ad essere molto piccola, quindi la preci-

sione può essere migliorata aumentando il numero di replicati, ma ovviamente c’è un limite pratico.

= = ̅ ±

Deviazione standard della media: è molto più precisa della media di un singolo replicato.

̅ √ √

Legge di propagazione degli errori

√

Da dove arriva ?

Per determinare il livello di precisione che possiede la media di N replicati, cioè per capire se c’è un problema

di accuratezza bisogna analizzare N replicati di uno standard a concentrazione nota. Dopo aver stabilito il va-

lore medio e l’impatto dell’errore causale attraverso la stima dell’errore causale che si può allargare o restrin-

gere in funzione di Z, si confronta il valore medio con il valore vero. Se il valore vero ricade all’interno di ̅ ±

allora non c’è uno scostamento significativo tra il

per un valore di confidenza stabilito (95% quindi Z=2),

√ se non c’è un problema di accuratezza, l’ipotesi è nulla cioè non

valore vero e la media degli N replicati. Quindi

c’è un bias (=errore sistematico). Se c’è un problema di accuratezza allora l’ipotesi non è verificata e la diffe-

renza tra valore medio e valore vero è significativa.

Il valore medio è tanto più preciso quanto è alto il numero di replicati, quindi si può avere una precisione

La gaussiana si ristringe all’aumentare

estremamente piccola, perciò il dato può essere infinitamente preciso. di provare l’esistenza di un bias, se

di N. Se il valore vero cade nella gaussiana allora non sono stato in grado

invece N è molto grande, la campana si stringe perché la deviazione è molto piccola e quindi la presenza di

bias può essere provata, in quanto il valore vero è fuori dalla gaussiana (il valore medio può cambiare).

Test t di student

Test statistico per verificare se il valore medio di una distribuzione si discosta significativamente dal valore

medio quando si ha N<20, quindi si ha solo una stima di sigma, cioè s. Ideato da Steve Gossep e calcolato con

Z ma dipende sia dall’intervallo di confidenza che dal numero di

̅ ± con t che ha lo stesso significato di

√

replicati usati per determinare la deviazione standard, quindi si considera come gradi di libertà N-1 perché 1

è perso per determinare la media. Quando N tende a infinito si ha che t è 1.960 come il livello di confidenza

che si ha per Z al 95%. Se il valore medio è significativamente superiore o minore della media si ha campana a

una coda, inoltre si possono avere anche curve asimmetriche.

METODO DI CALIBRAZIONE

Metodi univariati dove un segnale è correlato a una concentrazione, quindi correlazione diretta ed esplicita

tra segnale e concentrazione. Si possono classificare in 3 categorie in base al campo di applicazione:

• →

Curva di calibrazione (calibrazioni esterne) preparazione di standard a concentrazione nota e si leggono

allo strumento il segnale corrispondente alla concentrazione, ottenendo in un grafico la curva da cui si

estrapola graficamente la concentrazione del campione incognito oppure si può ricavare matematica-

mente conoscendo l’equazione della retta e R 2 . Se la retta non parte da zero, ad assorbanze molto basse

e non ha senso, quindi l’approssimazione lineare è sbagliata e lo si

si ottengono concentrazioni negative

nota attraverso il grafico dei residui (per ogni valore di x dello standard si considera la differenza tra il dato

sperimentale e quello ottenuto dalla retta, quindi esprime il discostamento dall’andamento lineare). Se la

retta parte da zero, il grafico dei residui ha valori molto piccoli compresi in un intervallo molto basso vicino

a 0. Nel caso di curve, queste vengono scomposte in diversi tratti in cui si usa una calibrazione lineare.

Metodi dei minimi quadrati: sono noti con assoluta precisione i valori delle concentrazioni (asse x) e incerti

i valori di y che è la misura sperimentale, quindi cerca la migliore retta che minimizzi la distanza di tutti i

valori di y nei confronti della retta stessa.

Problema principale: l’andamento rettilineo lineare non è infinito.

Situazione tipica che si presenta con una calibrazione strumentale per cui

si ha un range dinamico che è la parte di risposta di correlazione lineare tra

segnale e concentrazione. A un certo punto il segnale non è più lineare ad

esempio il detector è arrivato alla sua massima capacità di conteggio o il

rumore strumentale inizia a essere rivelante, questo è il comportamento

che si osserva nella maggior parte dei casi e viene descritto da una polinomiale di secondo grado. In alcuni

casi ci potrebbero essere curve di taratura con due range distinti che sono descritti da due approssimazioni

lineari, cioè la la curva viene destritta da due rette.

• dell’analita

→

Metodo aggiunte standard usato in alternativa alla calibrazione esterna. Il segnale non si

legge su una retta di calibrazione ma su una retta generata dallo stesso analita a cui si aggiungono aliquote

crescenti. Si usa quando la matrice è complessa e non riproducibile. La concentrazione è ottenuta per y=0

Sull’asse delle x bisogna mettere la concentrazione aggiunta all’analita. Bisogna

ma cambiata di segno.

stare attenti a come si programmane le aggiunte. Un errore nella stima della pendenza si ha quando

vengono fatte aggiunte troppo piccole rispetto al valore previsto, inoltre se l’errore causale è costante per

tutte le concentrazioni allora si possono fare aggiunte anche molto elevate per migliorare la determina-

zione della pendenza. Non si può usare con una curva di calibrazione quadratica perché una curva di cali-

brazione deve avere punti in 3 zone distinte e nel caso del metodo delle aggiunte non si hanno (tutti i punti

al di sotto della concentrazione 0 non ci sono), le 3 zone sono: parte terminale sx, parte centrale e parte

terminale dx, sono fondamentali per modellare la curvatura se mancano punti in questa zona allora la

curva non è descritta correttamente e ci sarà una forte incertezza nella definizione del grado di curvatura.

Metodo che determina una concentrazione in una zona di estrapolazione partendo dalla retta di calibra-

zione, considerando tutti quei segnali che cadono nella regione di interpolazione, perché attraverso gli

standard si è studiato come si comporta il protocollo analitico. Oltre al massimo osservato ho una regione

di estrapolazione in cui assumo che quel punto si comporti come nella zona di interpolazione ma potreb-

bero esserci errori in quanto dopo quel massimo la retta potrebbe curvarsi.

Problemi: pone q uguale a 0 e potrebbe non esserlo a causa della soluzione se non è perfettamente limpida

oppure le cuvette sono sporche mentre il secondo problema è dovuto alla presenza di interferenti fa sì

che il segnale non sale a concentrazioni basse quindi si ha intercetta negativa, gli interferenti infatti reci-

Carico lavoro eccessivo per l’operatore.

dono il segnale in un determinato intervallo.

• →

Standard interno si aggiunge al campione una quantità di una sostanza differente da quella da deter-

minare e analizzare contemporaneamente il segnale che viene fornito dall’analita e dalla sostanza ag-

giunta. Si usa con alcuni metodi strumentali che hanno una risposta che varia da campione a campione

per diversi motivi e di conseguenza fare una retta di calibrazione esterna da cui ricavare la concentrazione

dell’analita è un problema in quanto potrebbero esserci dei fattori che influenzano la risposta ed è difficile

avere una precisa determinazione. La presenza dello standard interno che ha uguale comportamento

dell’analita si può capire la variabilità del metodo.

Esempio: iniezioni cromatografiche svolte manualmente porta a un errore casuale per ogni campione.

Quando la concentrazione di analita e di standard interno è lo stesso e viene iniettato si hanno due valori

di aree (segnale*tempo) diverse perché sostanze diverse danno risposte diverse al detector dello stru-

=

mento. Si calcola fattore di risposta (o correzione) . Se le concentrazioni di analita e di

=

standard interno sono diverse allora sì deve normalizzare la risposta e si calcola il fattore di risposta è

l’impreci-

∙ . Il metodo dello standard interno compensa pienamente

sione nell’iniezione all’interno di un sistema cromatografico.

SELETTIVITA’ = + +

→

Un metodo è tanto più selettivo nei confronti dell’analita rispetto alla specie interferente quanto più m >m .

A B

Il coefficiente di selettività è il rapporto tra le due sensibilità, cioè tra i due coefficienti angolari del metodo e

= /

più è basso più è selettivo il metodo. con m che è la pendenza della curva di calibrazione:

,

• = 0 → il metodo è selettivo

,

• < 0 → i segni di m e m sono discordi cioè la presenza di B causa una diminuzione del segnale ge-

, A B

nerato e quindi l&rsqu