Appunti completi esame di Biologia generale e cellulare

ESPERIMENTO DI MESELSON E STAHL

Confermano la teoria della replicazione semiconservativa.- Una difficoltà era marcare e distinguere i filamenti: il DNA è costituito da nucleotidi, basi azotate. Le basi azotate contengono azoto. La14 15forma più comune di azoto è N con 7 protoni e 7 neutroni. N è detto “azoto pesante”, siccome possiede 8 neutroni. Il trucco dell’azotoleggero-pesante consente di avere a disposizione un mezzo per distinguere le molecole di DNA. Nel DNA di partenza è presente l’azoto solosotto forma di azoto pesante, mentre il DNA neosintetizzato presenta solo azoto leggero.

Il secondo problema era avere a disposizione un sistema biologico che riesca a replicare il DNA in modo rapido, e che consenta di estrarretale DNA in quantità sufficienti e con facilità. Si scelse Escherichia coli, cellule batteriche di facile coltivazione in laboratorio. Si replicano ogni 20 minuti. Escherichia coli si

Per lungo tempo, il DNA stesso si separerà in due bande corrispondenti al DNA pesante e leggero, in base al fatto che possiedono due densità differenti. Si fanno crescere per molte generazioni cellule con marcatura metabolica, successivamente viene preso un quantitativo minimo noto di cellule che viene inoculato in un terreno libero, in cui è presente solo N, hanno così tempo di replicarsi una sola volta (20 minuti). Dopo la prima replicazione viene estratto il DNA, si osserva quindi un'unica banda (strato diviso dalla centrifuga), ma si sarebbe potuta osservare allo stesso modo un'unica banda con la replicazione dispersiva. A questo punto viene ripetuto lo stesso esperimento, ma aspettando quaranta minuti, si ha quindi una doppia replicazione. Nell'ipotesi semiconservativa si sarebbero viste due bande, mentre nell'ipotesi dispersiva sarebbe apparsa una sola banda. Vengono individuate due bande.

CROMOSOMA BATTERICO

In un cromosoma batterico

c'è una sola origine di replicazione, la replicazione del DNA si propaga in entrambe le direzioni. Si parla di replicazione teta perché si formano struttura intermedie che hanno la forma della lettera greca teta.

ORIGINI DELLA REPLICAZIONE NEGLI EUCARIOTI

Negli eucarioti esistono più origini di replicazione (precoci e tardive) dette repliconi. La replicazione negli eucarioti procede più lentamente che nei procarioti. Nella doppia elica deve aprirsi una forcella replicativa, la doppia elica deve quindi aprirsi e i legami idrogeno devono essere rotti, la forcella replicativa ampliandosi crea una bolla di replicazione. Esistono specifiche proteine che riconoscono specifiche sequenze del DNA (origine di replicazione), circondate da sequenze consenso, a cui legarsi per rompere i legami, queste proteine creano complessi proteici. La replicazione avviene sia verso destra sia verso sinistra. I filamenti si dividono in:

• filamento ritardato: procede con

discontinuità- filamento anticipato: procede con continuità (stessa direzione complessiva dellareplicazione)

Ci sono vari enzimi necessari alla replicazione:

• topoisomerasi: allentano la torsione del DNA a valle della forcella di replicazione, infatti“srotolandosi” la doppia elica porta ad un accumulo di torsione. Introducono rotturetransitorie in uno o due filamenti, permettono così un giro di 360°, in seguitoricompongono il legame fosfodiesterico.
• SSBP: proteine che si legano al DNA per schermare i possibili legami a idrogeno fra i filamenti, permettono così che la doppia elica rimangaaperta
• elicasi: rompe i legami a idrogeno tra le basi (dopo gli enzimi iniziali). Consuma ATP.
• primasi: agisce prima della polimerasi, crea un innesco di RNA complementare al DNA.
• DNA polimerasi: prende il posto della primasi, aggiunge un nucleotide al frammento di RNA, si ha quindi un frammento polinucleotidicomisto.
• DNA ligasi: sintetizza il legame

La sintesi del DNA inizia con la formazione di corti primer di RNA, sintetizzati dalla primasi. Dopo che si è formato un primer di RNA, la sintesi di DNA può procedere e la DNA polimerasi può aggiungere, uno dopo l'altro, i deossinucleotidi all'estremità 3' del primer. La DNA polimerasi catalizza l'allungamento dei filamenti di DNA, utilizzando come substrati i desossinucleotidi trifosfati derivati dalle quattro basi presenti nel DNA. Quando uno di questi substrati è incorporato nel filamento di DNA in formazione, i suoi due gruppi fosfato terminali vengono rilasciati liberando grande energia. Per il filamento anticipato è necessario un solo primer di RNA al momento della formazione di una forcella di replicazione. Il filamento ritardato è sintetizzato come una serie di frammenti di Okazaki discontinui, ciascuno dei quali deve essere iniziato a

partire da un diverso primer di RNA. La sintesi inizia sul frammento anticipato → la DNA polimerasi procede tranquillamente poichè si muove nella direzione complessiva della replicazione. Il processo è identico anche sul frammento ritardato, la regione di DNA aperta deve essere abbastanza grande per permettere la sintesi di un frammento di Okazaki. Il primo frammento sintetizzato è il più lontano dalla forcella. Nei vari frammenti di Okazaki sono presenti i frammenti di RNA sintetizzati dalla primasi, vengono rimossi dalla DNA polimerasi II che sintetizza il secondo frammento. In E. coli i primer di RNA sono rimossi dall’attività esonucleasica 3’ → 5’ insita nella DNA polimerasi I, che contemporaneamente, per riempire l’intervallo che si è creato, sintetizza il DNA nella normale direzione 5’ → 3’. La DNA ligasi sintetizza il legame fosfodiesterico tra i nucleotidi vicini non legati (idrolizza ATP).

Procarioti possiedono cinque tipi di DNA polimerasi:

• DNA polimerasi III: l'enzima principale per la replicazione, con attività polimerasica 5' → 3' ed esonucleasica 3' → 5'. È attiva sia nella sintesi del filamento guida, sia in quella dei frammenti di Okazaki. Velocità di polimerizzazione di circa 250-1000 nucleotidi/secondo.
• DNA polimerasi I: coinvolta nella riparazione del DNA e nella rimozione degli inneschi dei frammenti di Okazaki. Possiede attività polimerasica 5' → 3' ed attività esonucleasica sia in direzione 5' → 3', sia in direzione 3' → 5'. La velocità di polimerizzazione è di circa 14-20 nucleotidi/secondo.
• DNA polimerasi II: indotta da danni al DNA per riparazione incline all'errore (error-prone). Ha attività polimerasica 5' → 3' ed esonucleasica 3' → 5'. Velocità di polimerizzazione di circa 40

nucleotidi/secondo.- DNA polimerasi IV e DNA polimerasi V: coinvolte nella riparazione incline all'errore

Oltre ad avere una funzione biologica all'interno delle cellule, le DNA polimerasi sono utilizzate per applicazioni pratiche nel campo delle biotecnologie (PCR).

Durante la replicazione del DNA, ogni 10-100 milioni di nucleotidi può essere introdotta una base sbagliata. Gli errori di appaiamento durante la replicazione vengono eliminati dalla cosiddetta attività di correttore di bozze della DNA polimerasi (attività esonucleasica 3' → 5'). Quasi tutte le DNA polimerasi hanno anche attività esonucleasica 3' → 5'. Le esonucleasi sono enzimi che degradano gli acidi nucleici a partire da un'estremità. L'attività esonucleasica 3' → 5' della DNA polimerasi consente la rimozione di nucleotidi appaiati scorrettamente dall'estremità 3' del filamento nascente di

Il DNA è l'unica molecola presente nelle cellule per cui ci sono meccanismi di riparazione, se il DNA viene danneggiato a tal punto da non poter essere riparato le cellule vanno incontro a un processo di suicidio organizzato (apoptosi).

Quindi:

• La sintesi di DNA procede sempre in direzione 5' → 3'
• La replicazione avviene in modo continuo su un filamento, discontinuo sull'altro
• La sintesi di DNA necessita di un primer (innesco) di RNA

TELOMERI

La regione terminale del cromosoma è chiamata telomero (non codifica per niente), evita che i cromosomi si accorcino troppo da una replicazione all'altra, infatti ad ogni replicazione si perde parte dell'estremità 5', infatti quando l'attività esonucleasica 5' → 3' della DNA polimerasi rimuove l'ultimo primer dal filamento ritardato, nessuna DNA polimerasi è in grado di riempire gli spazi vuoti perché non ci sono estremità.

3’OH libere, questo provoca l’accorciamento dei telomeri, essi sono infatti sequenza di nucleotidi che si ripetono. La sequenza TTAGGG, situata all’estremità dei cromosomi umani è un esempio di sequenza telomerica. La telomerasi è un enzima costituito da una porzione proteica e delle sequenze di RNA (→ riboproteina). Il frammento di RNA associato all’enzima serve da stampo per la formazione della sequenza ripetuta di DNA che è aggiunta alle estremità telomeriche. Nelle cellule della linea germinale non avviene l’accorciamento dei telomeri grazie alla telomerasi, che consente alle cellule di dividersi indefinitamente senza che i telomeri si accorcino. Nelle altre cellule la telomerasi è inattiva, questo pone un limite al numero di volte in cui la cellula si può dividere. Se una cellula va incontro a un numero sufficiente di divisioni e i telomeri rischiano di scomparire e il DNA codificante rischia di essere eroso.