Biologia cellulare - Appunti

Principi generali di segnalazione cellulare

La comunicazione tra cellule è molto antica, esiste già negli organismi monocellulari (meccanismo di quorum sensing, si legge la composizione dell’ambiente e arrivano segnali esterni). Ad esempio, in Saccharomyces cerevisiae viene espresso un fattore di accoppiamento da una cellula che agisce su altre per renderle prone all’accoppiamento. L’evoluzione degli organismi multicellulari dipende dalla capacità delle cellule di comunicare una con l’altra.

Comunicazione intercellulare

La comunicazione intercellulare regola:

• Lo sviluppo e l’organizzazione dei tessuti, coordinando le diverse attività cellulari per il corretto funzionamento degli organi del nostro organismo.
• La comunicazione intercellulare negli animali superiori è complessa, suggerendo che molti geni in questi organismi siano coinvolti nel suo controllo e coordinazione.

Ogni cellula necessita di una serie di segnali provenienti dall’esterno per svolgere e regolare: sopravvivenza (segnali per mantenere la cellula in uno stato vitale), apoptosi (in molte cellule è inscritto come meccanismo di default seppur bloccato da segnali extracellulari), divisione, differenziamento (regolato strettamente dall’esterno ed è l’assunzione di una identità funzionale in genere post-mitotica), attività metaboliche (regolata da segnali extracellulari) e cambiamenti di forma e migrazione.

Meccanismi di segnalazione

In un organismo multicellulare possiamo vedere comunicazione intercellulare a corto raggio e lungo raggio. Il primo meccanismo a corto raggio scoperto è la segnalazione autocrina. La cellula rilascia il segnale all’esterno tramite esocitosi e viene raccolto dalla stessa cellula che lo ha prodotto. La segnalazione paracrina prevede la cellula segnalante che secerne molecole (scarsamente diffusibili) per agire su cellule bersaglio nelle vicinanze.

La segnalazione a corto raggio dipendente da contatto è quando il segnale si attacca su un recettore della cellula adiacente, non c'è diffusione del segnale perché le cellule si toccano. Ad esempio, nel moscerino della frutta vediamo che una cellula diventa neurone e sulla sua membrana sviluppa delta. Le cellule di fianco hanno il recettore notch e il legame tra i due porta all’inibizione laterale (attraverso meccanismi proteolitici). Un caso particolare del contatto è dato dalle gap junctions che uniscono i due citoplasmi. Nel canale scorrono ioni, piccole molecole e secondi messaggeri che mettono in diretta comunicazione i due citoplasmi.

La comunicazione a lungo raggio prevede la cellula segnalatrice a distanza ampia dalla cellula bersaglio (altro tessuto o altra parte del corpo). La segnalazione endocrina significa che la cellula segnalatrice rilascia il primo messaggero (ormone) nel flusso circolatorio. Ciò viene fatto da organi del sistema endocrino. Dal sangue vengono indirizzati da proteine vettrici/carrier (es. albumina) che le portano all’organo bersaglio e poi colpiscono la cellula bersaglio che reagisce. È una segnalazione molto diffusa e anche lenta.

La segnalazione a distanza più precisa e specifica è quella sinaptica data dal sistema nervoso. Combina segnale elettrico e segnale chimico. La differenza tra le due segnalazioni a lungo raggio è la specificità del segnale. Il segnale endocrino è diffuso, ma è letto solo da cellule che hanno i recettori specifici. Il segnale sinaptico viaggia sull’assone e va a sinaptare sulla cellula bersaglio in modo preciso. La specificità è organizzata dall’organizzazione somatotropica e strutturale. Le due segnalazioni sono discriminate dalla sensibilità.

La segnalazione si complica perché la cellula risponde in base alla sua intensità. Superato il valore soglia si attiva il meccanismo di risposta che arriva a un valore massimo e poi si spegne. La segnalazione segue una rappresentazione sigmoide. La cellula però riceve tanti segnali. La cellula riceve segnali per sopravvivere e poi per crescere e dividersi o per differenziarsi. Esistono anche segnali di apoptosi. Le vie di segnalazione sono tante. I recettori rilevano i segnali e lo trasducono poi all’interno della cellula. Nella cellula abbiamo fenomeni di segnalazione intracellulare.

Meccanismo di segnalazione

Il meccanismo è: segnale -> ricezione -> risposta. La cellula ha un primo livello di controllo della complessità in base a numero, intensità e combinazione dei segnali che vanno a dare una risposta diversa. Però possiamo vedere anche l’opposto, il segnale dell’acetilcolina che viene letto in modo diverso. Il recettore dell’acetilcolina sta sulla membrana.

1. Acetilcolina si lega alla cellula pacemaker del cuore, una volta arrivata una scarica sulla cellula causa la riduzione del ritmo di contrazione. Il recettore è legato a una proteina G trimerica. Il recettore è di tipo muscarinico. La muscarina è un agonista per il recettore sulle cellule del pacemaker. Ingerire la muscarina, stimola i recettori quando non ci sarebbe il segnale fisiologico. Deriva dal fungo amanita muscaria.
2. Acetilcolina lega la cellula della ghiandola salivare attraverso un recettore muscarinico. Ma il bersaglio non è più il canale ionico, ma dei secondi messaggeri intracellulari che determinano la fusione di vescicole esocitotiche che sono rilasciate attraverso la salivazione. Questi due esempi sono segnalazioni veloci.
3. Acetilcolina lega attraverso un recettore nicotinico attaccato a canali ionici delle cellule del muscolo scheletrico e porta a contrazione. Il segnale è lo stesso, ma è interpretato dalle tre cellule in modo diverso. A parità di segnale, le cellule danno risposte diverse.

Interazione ligando-recettore

Il segnale è detto ligando perché sarà riconosciuto con una interazione fisica dalla molecola che lo rileva. Il recettore sente e trasduce il segnale nella cellula bersaglio. Trasforma il segnale portandolo all’interno della cellula. Nella cellula troviamo i secondi messaggeri (natura più svariata e toccano più bersagli). In questo modo si avrà un effetto biologico quindi attivazione di enzimi, modificazioni citoscheletrici e trascrizione di geni.

Le molecole segnale possono essere:

• Piccole molecole come amminoacidi e derivati. Costituiscono neurotrasmettitori e ormoni.
• Gas come NO (importante nel viagra) e CO.
• Ormoni steroidei, derivati dal colesterolo.
• Ecosanoidi, molecole non polari derivate dall’acido arachidonico.
• Proteine transmembrana, della matrice extracellulare o secrete nello spazio extracellulare.

L’interazione del segnale con l’antenna porta alla segnalazione. Interazione tra molecole segnali e recettori avviene tramite legami deboli (ionici, van der waals, ponti idrogeno, idrofobiche). Spesso il segnale cambia la conformazione del recettore per far attivare la segnalazione. Interazione ligando-recettore è reversibile (il segnale deve essere terminato). La stabilità del complesso è legata al numero di legami che si riescono a formare. L’interazione ligando-recettore è data dalla complementarietà fisica del sito di legame sul recettore col ligando. Di solito il legame tra segnale e recettore, creano modifiche di conformazione nel recettore. L’affinità tra ligandi e recettori è varia. La Kd varia da 10^-3 M a 10^-12 M (es. ormoni hanno alta affinità mentre i neurotrasmettitori più bassa). Esistono sia recettori di superficie (molecola di segnale idrofilica) che intracellulari (spesso per ormoni quindi sostanze idrofobiche). La proteina trasportatrice porta la molecola sulla superficie della cellula che la deve recepire. La molecola idrofobica diffonde nella membrana e dentro la cellula lega il recettore. Il recettore può essere nel nucleo o citoplasma.

Sequenza di eventi di segnalazione

1. Riconoscimento: dallo stimolo sulla superficie esterna della membrana plasmatica o all’interno del citoplasma (per molecole che attraversano la membrana).
2. Trasferimento-Trasduzione (recettore): dell’informazione attraverso la membrana plasmatica e attraverso il citoplasma. L’informazione poi dovrà essere trasformata in una reazione.
3. Trasmissione (cascate di trasduzione) e Interpretazione: dal segnale a molecole specifiche che lo interpretano e lo trasducono. Esistono dei meccanismi complessi di feedback loop o segnalazione retroattiva. Il segnale è modulato all’esterno e soprattutto all’interno della cellula.
4. Cessazione: dalla risposta in seguito all’eliminazione delle molecole segnale e all’attivazione di processi di modulazione negativa del segnale.

Interazione tra le molecole segnale e i loro recettori impone cambiamenti conformazionali ai recettori che subiscono transizioni allosteriche. Interazione molecola segnale-recettore scatena una cascata di segnali intracellulari.

Tipi di recettori

In base al tipo di recettore abbiamo:

• Recettori collegati ai canali ionici, a proteine G, a enzimi.
• Recettori accoppiati a canali ionici o ionotropici (neurotrasmettitori): il recettore stesso può essere un canale ionico. Il legame del ligando col canale ionico provoca il cambiamento di conformazione. Quindi il canale passa dall’essere impermeabile ad uno ione e provoca una depolarizzazione.
• Una delle più grandi famiglie per la segnalazione sono i recettori accoppiati alle proteine G che sono trimeriche. G deriva da GTP. I recettori sono composti da tre subunità: alfa, beta, gamma. Sono agganciati alla parte citoplasmatica della membrana in contatto con il recettore nella sua forma inattiva. I recettori hanno domain intramembrana ripetuti. Quando arriva la molecola segnale, ingaggia il recettore e si ha un cambiamento conformazionale. Viene esposto un sito di legame in una subunità che porta all’attivazione della proteina G. il complesso della proteina G si disaccoppia, si sganciano alfa e beta. Gamma viene trasformata con l’attivazione della proteina G perché favorisce l’ingresso un gruppo di GTP a sfavore del GDP. Provoca un cambiamento conformazione che rende la proteina G attiva. Gamma, sganciata da alfa e beta, ha un sito per un enzima bersaglio (es. adenilato ciclasi).
• I recettori accoppiati agli enzimi prevedono il modulo funzionale/catalizzante dell’enzima (chinasi) è parte integrante della struttura del recettore. Il recettore è fatto dai domini funzionali delle proteine. Esternamente si ha il modulo di riconoscimento della molecola. Il legame di essa porta un cambiamento conformazionale. Sotto si ha un braccio spaziatore e in fondo un modulo enzimatico di solito tirosina chinasi. Il sito catalitico aperto fosforila i residui di tirosina sulle proteine bersaglio. È usata la fosforilazione. Se non c’è il ligando normalmente il sito catalitico è inattivo. Con la presenza del ligando, le molecole si associano insieme poiché il ligando come dimero è più lungo. L’agganciamento al ligando costringe i due recettori ad avvicinarsi. Fanno attivazione incrociata, vengono esposti i domini catalitici e parte la reazione. Ci sono recettori accoppiati a enzimi in cui ci sono due componenti: enzima e l’altro è parte del recettore che serve per l’attivazione. In questo caso l’enzima è reclutato dall’ambiente esterno.

Ci sono anche altre proteine che segnalano grazie al GTP che sono le piccole proteine monomeriche che legano GTP. Non sono direttamente associate al recettore, ma hanno una propria attività GTPasica. Queste proteine quando arriva il segnale agiscono come interruttori molecolari:

1. Segnalazione per fosforilazione: recettore legato a enzima che agisce con ATP. Il sistema in uno stato riceve il segnale che attiva il recettore tirosina chinasi. Viene idrolizzato ATP e viene inserito un gruppo fosfato che produce un cambiamento allosterico della proteina così da esporre un componente della catena di segnalazione (che diventa attivo). Così si accende la segnalazione (tipico delle chinasi). Lo spegnimento avviene a carico delle fosfatasi (però esistono alcuni casi in cui la fosfatasi attiva un enzima).
2. Segnalazione da parte della proteina che lega il GTP: allo stato spento la proteina monomerica è legata al GTP. Il segnale in entrata, attiva GEF che produce uscita del GDP e ingresso GTP. GTP cambia la conformazione della proteina di segnalazione che produce il segnale in uscita. Idrolisi del GTP fa ritornare la molecola allo stato inattivo. Il fosfato è tolto dalla proteina G stessa, avendo attività GTPasica intrinseca (stimolabile da GAP).

In funzione del recettore ho risultati diversi. La risposta è contesto dipendente cioè non solo dal segnale, ma dalla capacità di rispondere e come è trasdotto il segnale. Poi ho una serie di effetti. Nella cellula il segnale è ramificato, interpretato e modulato attraverso dei secondi messaggeri.

Interruttori molecolari

Interruttori molecolari con regolazioni alternative alla fosforilazione e proteine G sono calcio dipendenti, usano cAMP ciclico (secondo messaggero prodotto da un enzima) e modifiche covalenti non fosforilative (es. ubiquitina). La risposta è contesto dipendente (non dipende dal segnale ma anche dalla capacità del segnale e da come è tradotto).

L’ambiente intracellulare ha un rumore di fondo sia quantitativamente che qualitativamente. Nella cellula ci sono molte molecole di natura diversa. Il rumore è antagonizzato dalla specificità dei componenti del segnale intracellulare (es. affinità), dalla “filtrazione” del segnale intracellulare (cioè posso avere delle molecole che rispondono al legame col cAMP, le molecole bersaglio che ricevono il segnale si attivano quando si legano più molecole di cAMP. Il segnale deve essere forte per passare da questo filtro. Toglie le molecole che possono arrivare dall’ambiente) e dalla “ridondanza” del segnale (il segnale arriva a valle da un altro pathway cellulare, delle frequenze spurie. Cellula necessita che la cellula per passare il nodo sia ridondante. Passa solo se riceve il segnale dalla prima via di segnalazione, ma anche da una seconda. È un ulteriore filtro. La cellula deve vedere le due vie per svolgere la funzione).

Il segnale è trasmesso con precisione, velocità e efficienza.

Tipi di trasduzione del segnale

(recettori di membrana):

1. Un modo di direzionare il segnale è dato dalle proteine impalcatura. Queste sono una impalcatura su cui sono già agganciate e preformate (anche quando il recettore è inattivo) le proteine/elementi che producono segnalazioni intracellulari, trasmettendosi a cascata l’uno all’altro. Anche quando il recettore è inattivo, la proteina di impalcatura ha legate a sé le proteine di segnalazione. Quando la molecola segnale lega il recettore, esso cambia la sua conformazione e si espongono dei siti particolari. Così il recettore diventa attivo. Subito sotto si trova la proteina di segnalazione la quale è molto affine a quella parte di recettore che cambia conformazione. Si attiveranno altre proteine di segnalazione fino ad avere i segnali a valle. Una proteina di segnalazione oltre ad attivare la proteina sottostante possono anche mandare un ulteriore segnale a valle.
2. Ci sono anche complessi di segnalazione non pre-assemblati, ma si formano quando arriva il ligando che attiva il recettore. Le proteine di segnalazione intracellulari restano inattive seppur in prossimità del recettore inattivo. Quando arriva la molecola segnale, il recettore si dimerizza (due recettori che si fosforilano l’un l’altro) oppure si autofosforila. In quest’ultimo caso, il recettore ha domini chinasi sotto la membrana e quindi il legame del ligando modifica la configurazione intracellulare. I siti chinasici sono esposti e attivati, hanno alta affinità per alcuni residui del recettore stesso quindi vengono aggiunti gruppi fosfato. La fosforilazione di questi siti fa sì che siti di riconoscimento specifico delle molecole di segnalazione si assemblino sul recettore stesso (in modo simile al recettore pre-assemblato). Il segnale poi può essere trasmesso in cascata o in parallelo. Il meccanismo è basato sulla prossimità indotta perché le molecole di una catena di segnalazione hanno alta affinità di loro, ma la sviluppano per legarsi tra loro mettendosi nella posizione corretta. Infatti si devono assemblare forzatamente sul recettore stesso. Posizionalmente, sono messe in modo tale che molecole affini si incontrino frequentemente grazie alla prossimità indotta. L’assemblaggio avviene una volta che il recettore è attivato. La prossimità delle molecole di segnalazione è indotta dall’attivazione del recettore.
3. Assemblaggio di un complesso di segnalazione su siti di attracco formati da fosfoinositidi: nella membrana cellulare ci sono molecole fosfolipidiche dette fosfoinositidi (fosforilati in due dei tre siti). Il recettore inattivo galleggia nella membrana e anche le molecole di segnalazione poste vicino sono inattive. Arriva la molecola segnale e si attiva il recettore. Spesso si ha un cambiamento conformazionale. Si attiva una capacità del recettore di fosforilare i fosfoinositidi che diventano iperfosforilati. Dentro la membrana, attraggono a sé le proteine di segnalazione nella parte citosolica della membrana. Così producono vie di segnalazione diverse. Anche in questo caso abbiamo il meccanismo di prossimità indotta. Anche qua la prossimità indotta attiva la via di segnalazione.

Domini di riconoscimento modulare

La cellula a parità di contenuto di informazione genetica cerca di risparmiare attraverso i domini di riconoscimento modulare. Si dice modulare perché sono dei moduli quindi sono sequenze di una proteina che tendono a essere omologa e con la stessa funzione. Nell’evoluzione questi moduli sono apparsi presto e sono stati mantenuti, nel tempo sono stati adattati per asservire altre funzioni. Un singolo gene è usato per produrre più funzioni nella cellula. Uso lo stesso schema per far svolgere a proteine diverse, una funzione simile in termini di riconoscimento e di legame del bersaglio. Sono usati ripetutamente. Nelle vie di segnalazione...