Appunti Chimica Farmaceutica e Tossicologica 2

Introduzione alla chimica farmaceutica

La chimica farmaceutica si interessa della scoperta, progettazione, identificazione e preparazione delle sostanze biologicamente attive (farmaci), delle loro proprietà, metabolismo e meccanismo a livello molecolare, della costruzione delle relazioni struttura-attività (SAR). Alla base dell'attività farmacologica vi sono le seguenti caratteristiche:

• Peso molecolare
• pK_a
• Possibilità di stabilire legami idrogeno
• Lipofilicità
• Polarizzabilità
• Reattività chimica

Dalla struttura farmacologica dipendono le caratteristiche chimico-fisiche della molecola (solubilità, permeabilità, stabilità chimica) nonché le proprietà biologiche (interazione con il recettore, metabolismo, affinità di legame, trasporto). L'insieme di tutte queste proprietà condiziona la farmacodinamica, la farmacocinetica, e la tossicità di un farmaco. Tuttavia, è importante ricordare che sebbene un farmaco si leghi ad alta affinità a un recettore, la molecola non è di alcuna utilità farmacologica se l'assorbimento è scarso e se è eliminata troppo lentamente dall'organismo.

La regola del cinque di Lipinski

Elaborata a partire da uno screening di 2245 farmaci, ha permesso di stabilire che un farmaco abbia un assorbimento scarso o poca permeabilità se:

• Il peso molecolare supera 500 Da
• Il ClogP (ossia il coefficiente di ripartizione ottanolo/acqua calcolato) supera 5
• Sono presenti più di 5 donatori di legame idrogeno espressi come somma di gruppi OH e NH
• Sono presenti più di 10 accettori di legame idrogeno espressi come somma di atomi di N e O
• L'eventuale trasporto attivo determina eccezioni alla regola

Solitamente quanto più una molecola è complessa tanto più selettiva. Solitamente si parte da un semplice farmacoforo (ossia l'insieme di atomi o raggruppamenti atomici indispensabili per l'attività farmacologica), che viene reso più complesso e di conseguenza più selettivo con l'aggiunta di gruppi come aromatici, catene alchiliche ecc. Tuttavia, non sempre il farmaco reso così complesso sarà attivo in vivo pur essendo fortemente attivo in vitro. Infatti, l'attività in vivo dipende dalla sua affinità al target, nonché dalle sue caratteristiche farmacocinetiche.

Esempi di calcolo del legame idrogeno per la regola di Lipinski

Ad esempio, l'ossidrile può donare un legame idrogeno, avendo un solo H; d'altra parte può accettare un solo legame idrogeno avendo un solo ossigeno. Al contrario, un estere non avendo atomi di idrogeno non può donare legami a idrogeno; tuttavia, avendo due atomi di ossigeno, può accettare due legami a idrogeno. Lo stesso vale per gli altri gruppi funzionali.

Farmaci attivi sul sistema nervoso (SN)

Classificazione del sistema nervoso

Il SN per ragioni didattiche si può suddividere in: sistema nervoso centrale (SNC) che comprende encefalo e midollo spinale e sistema nervoso periferico (SNP) che comprende nervi cranici, nervi spinali e gangli. Il SNP comprende: il sistema nervoso somatico e il sistema nervoso autonomo (SNA). Il primo è costituito da nervi sensoriali afferenti e da nervi motori efferenti. I nervi motori originano dal midollo spinale e proiettano senza interruzioni verso tutta la muscolatura scheletrica. Il SNA si divide in sistema nervoso simpatico, parasimpatico ed enterico.

Il sistema simpatico regola l'attività della muscolatura liscia e le secrezioni ghiandolari, vale a dire quelle funzioni che sfuggono al controllo della coscienza (involontarie), tra le quali la respirazione, la circolazione, la digestione, la temperatura corporea, il metabolismo. I due comparti danno luogo ad effetti contrastanti sulle condizioni interne all'organismo. Il simpatico è un'unità che dissipa energia, specialmente in situazioni di rabbia o paura; il parasimpatico agisce per scariche discrete e localizzate ed è adibito principalmente ad immagazzinare e preservare energia.

Farmaci e neurotrasmettitori

Un'altra classificazione in uso per i farmaci e le sostanze che agiscono sul SN si basa sul tipo di neurotrasmettitore rilasciato a livello della terminazione nervosa. Di conseguenza, i farmaci del SNA si suddividono in adrenergici, che agiscono sulle fibre simpatiche postgangliari che rilasciano noradrenalina (NA) e adrenalina (A), e colinergici che operano sulle rimanenti fibre del SNA e sulle fibre motorie dei nervi somatici che rilasciano ACh.

Farmaci attivi sulla neurotrasmissione colinergica

L'ACh si considera il neurotrasmettitore d'elezione per il sistema nervoso parasimpatico. L'ACh funziona come neurotrasmettitore per molti differenti neuroni. Nel SNA viene rilasciata dalle fibre pre e postgangliari del sistema parasimpatico, dalle fibre pregangliari del simpatico e da alcune fibre postgangliari del simpatico (ghiandole sudoripare e salivari). Viene inoltre rilasciata da neuroni del sistema nervoso somatico (volontario) e da alcuni neuroni del SNC. Tutti i neuroni che rilasciano ACh sono comunemente chiamati colinergici così come i recettori presenti nelle sinapsi di questi neuroni. Questi recettori possono inoltre essere classificati come muscarinici o nicotinici in base alla loro capacità di legare rispettivamente gli alcaloidi muscarina o nicotina.

Gli impulsi nervosi del parasimpatico mediano la stimolazione della muscolatura liscia del tratto gastrointestinale e urinario, la contrazione del muscolo ciliare dell'occhio, il rilassamento della muscolatura liscia vasale e la diminuzione del ritmo cardiaco. I composti chimici che stimolano il sistema parasimpatico sono chiamati colinomimetici o parasimpaticomimetici. Gli agenti colinomimetici sono considerati agonisti quando agiscono direttamente sui recettori colinergici o fungono da inibitori dell'acetilcolinesterasi (AChE), l'enzima responsabile dell'idrolisi dell'ACh. I composti dotati di affinità per i recettori colinergici, ma non di attività intrinseca, sono chiamati antagonisti colinergici, colinolitici o agenti parasimpaticolitici.

Neurochimica dell'ACh

I neuroni colinergici sintetizzano, immagazzinano e rilasciano ACh. Nel fegato, l'aminoacido serina viene decarbossilato da una serina decarbossilasi ad etanolammina, successivamente metilata, ad opera di una colina N-metiltransferasi (che utilizza la SAM come cofattore), a colina. Nel citoplasma dei neuroni colinergici avviene la sintesi dell'ACh per trasferimento del gruppo acetilico dell'acetilcoenzima A (acetil-S-CoA) alla colina ossia un alcol con un gruppo ammonico quaternario. L'enzima che catalizza questa reazione è la colina acetil-transferasi (ChAT).

Oltre ad essere sintetizzata dalla serina, la maggior parte della colina proviene dal riciclo in seguito all'idrolisi enzimatica dell'ACh da parte della AChE nello spazio sinaptico. Esiste un profarmaco che è la R-colina alfoscerato, un estere fosforico della colina con il glicerolo, che si dimostra utile per la sintesi dell'ACh. Si estrae dal pancreas bovino ed è utilizzata nei disturbi cognitivi dell'anziano. La colina extracellulare è trasportata attivamente nella terminazione nervosa presinaptica da siti di ricaptazione ad alta e bassa affinità. Questa ricaptazione è considerata il passaggio limitante la biosintesi dell'ACh. È inibita dall'emicolinio cloruro, un sale ammonico quaternario presente nella forma emiacetalica in equilibrio con la forma aperta. È proprio in questa conformazione aperta che tale sostanza mostra analogie strutturali con la colina tanto da inibirne competitivamente la ricaptazione. A causa della paralisi respiratoria che induce, l'emicolinio non si usa a scopi farmacologici.

Immagazzinamento e rilascio dell'ACh

La maggior parte dell'ACh neosintetizzata viene trasportata attivamente in vescicole di deposito citosoliche, localizzate nelle terminazioni nervose presinaptiche, dove viene conservata con ATP, ioni calcio e magnesio fino al suo rilascio. Parte di essa rimane nel citosol e viene infine idrolizzata. Solo la forma depositata nelle vescicole svolge la funzione di neurotrasmettitore. Il vesamicolo blocca l'immagazzinamento del neurotrasmettitore nelle vescicole. Il rilascio dell'ACh dalle vescicole di deposito viene iniziato da un potenziale d'azione trasmesso lungo l'assone fino alla membrana nervosa presinaptica. Questo potenziale d'azione porta all'apertura dei canali del calcio voltaggio-dipendenti fornendo un ingresso di calcio ed un rilascio per esocitosi dell'ACh nella sinapsi.

L'aumento del calcio intracellulare induce infatti la fusione delle vescicole di deposito con la membrana presinaptica prima del rilascio del neurotrasmettitore. In particolare, perché avvenga la fusione tra le vescicole sinaptiche e la membrana plasmatica presinaptica è necessario l'intervento di proteine specifiche della membrana vescicolare (sinaptobrevina, detta v-SNARE) e della membrana bersaglio (sintaxina e SNAP-25, dette t-SNAREs). L'interazione fra queste proteine e la formazione del cosiddetto "complesso SNARE" è regolata proprio dall'ingresso di ioni calcio all'interno della terminazione nervosa. Il calcio lega la sinaptotagmina, una proteina integrale delle vescicole sinaptiche che funge da sensore citosolico per il calcio. La sinaptotagmina è in grado di interagire con il complesso SNARE provocando così la fusione completa della vescicola sinaptica con la membrana e la conseguente liberazione del neurotrasmettitore.

Tossine e inibizione dell'esocitosi dell'ACh

Le tossine di Clostridium botulinum e tetani agiscono interferendo con l'esocitosi dell'ACh. Esse, pur avendo azioni simili, presentano grande diversità nelle sindromi neurologiche da esse provocate, paralisi flaccida nel caso del botulismo e paralisi spastica nel caso del tetano. Ciò è dovuto al fatto che le tossine, pur bloccando entrambe l'esocitosi del neurotrasmettitore, agiscono a livello di sinapsi diverse. La tossina botulinica agisce a livello delle giunzioni neuromuscolari dove, bloccando il rilascio di Ach, impedisce la conseguente attivazione dei muscoli scheletrici. La tossina tetanica, che pure viene internalizzata a livello della giunzione neuromuscolare, è trasportata lungo i nervi motori fino ai motoneuroni del midollo spinale, per poi raggiungere le terminazioni degli interneuroni inibitori, da dove inibisce il rilascio di neurotrasmettitori inibitori (GABA e glicina). Il risultato è una sovraeccitazione generalizzata dei motoneuroni e la contrazione simultanea e incoordinata di muscoli estensori e flessori, causando paralisi spastica. Lo studio dei meccanismi molecolari alla base dell'azione di queste tossine ha permesso di identificare come loro bersaglio proteolitico le proteine del complesso SNARE, confermando così il ruolo di queste ultime nella neuroesocitosi.

L'ACh nella sinapsi si può legare ai recettori presinaptici per produrre una risposta. L'ACh libera, non legata a un recettore, viene idrolizzata dall'AChE. Questa idrolisi rappresenta il meccanismo per porre fine alla sua azione. L'AChE è in grado di idrolizzare tutta l'ACh rilasciata da un potenziale d'azione (3 x 10⁶ molecole). Numerosi agenti colinomimetici terapeuticamente utili sono stati sviluppati sulla base della loro capacità di inibire l'AChE.

Recettori colinergici

Storia e scoperta

Nei primi del '900, Dale isolò l'ACh dall'estratto di ergot e successivamente la sintetizzò. Osservò che l'azione di tale trasmettitore era di breve durata e suggerì che i tessuti contenessero un'esterasi in grado di idrolizzarla a prodotti inattivi. Dale notò che l'ACh aveva azioni simili sia alla nicotina sia alla muscarina ed ipotizzò che potesse agire su due tipologie di recettori: i recettori nicotinici e i recettori muscarinici.

Recettori nicotinici

La nicotina è un liquido igroscopico solubile in acqua ed etanolo, dal sapore amaro e dall'odore pungente. È un alcaloide estratto dalla pianta del tabacco (Nicotiana tabacum). Presenta un anello piridinico ed uno pirrolidinico saturo. Dei due azoti presenti nella molecola, il più basico è quello dell'anello pirrolidinico con un pK_a di 7,9. L'azoto basico permette alla nicotina di essere presente anche in forma protonata, ricordando così il gruppo quaternario dell'ACh. La nicotina presenta un solo centro di asimmetria.

La muscarina è un alcaloide presente nel fungo Amanita muscaria. Presenta un anello tetraidrofuranico con un azoto quaternario. Ha 8 stereoisomeri; questo valore è ricavato dalla formula 2ⁿ con n uguale al numero di carboni asimmetrici. Poiché nella muscarina i centri di asimmetria sono 3, si avrà che 2³ = 8. La muscarina presenta 4 isomeri geometrici: muscarina, epimuscarina (epimero in 4), allomuscarina (epimero in 5) ed epiallomuscarina (epimeri in 4 e 5). Poiché nessuno degli isomeri ha un piano di simmetria, ognuno può esistere come coppia di enantiomeri. L'attività della muscarina si attribuisce in modo esclusivo all'enantiomero (+) – muscarina di origine naturale. La muscarina possiede la stereochimica ottimale per agire sui sottotipi recettoriali muscarinici, ma è del tutto priva di attività nicotinica.

Caratteristiche dei recettori nicotinici

I recettori nicotinici sono direttamente accoppiati a canali ionici (recettori ionotropici) e mediano risposte molto rapide in seguito all'attivazione per azione dell'ACh. I canali ionici sono responsabili dell'eccitabilità elettrica delle cellule nervose e muscolari e della sensibilità delle cellule sensoriali. Si tratta di pori che si aprono e si chiudono, con modalità "tutto o nulla", su scale temporali che vanno da 0,1 a 10 ms, creando un percorso acquoso attraverso la membrana plasmatica che serve al passaggio degli ioni. La carica e le dimensioni dello ione sono tra i fattori che influenzano la selettività dei pori ionici.

Il recettore nicotinico dell'ACh è stato il primo ad essere isolato e purificato nella sua forma attiva a partire dagli organi elettrici di organismi acquatici quali la razza di mare Torpedo californica e dell'anguilla Electrophorus electricus. Si tratta di una glicoproteina incorporata nella membrana sinaptica, di struttura cilindrica, di 250 KDa di peso, costituita dalla combinazione di 5 subunità polipeptidiche α, β, γ, δ (oppure ε), 2 delle quali sono identiche. Per le singole subunità è stato suggerito che ciascuna possieda una sequenza extracellulare idrofila N-terminale, una sequenza intracellulare idrofila C-terminale e 4 domini idrofobici transmembrana elicoidali da M1 a M4.

Il dominio idrofobico M2 è quello che costituisce la parete interna del canale ionico. Allo stato di riposo, ossia quando il canale è chiuso, le eliche che costituiscono le subunità M2 sono piegate per determinare un restringimento del canale che impedisca il passaggio degli ioni. Nello stato aperto le metà inferiore delle eliche si muovono per far sì che i residui idrofobici di leucina siano rimpiazzati da residui polari più piccoli; ciò determina l'apertura del canale. Vi sono due siti di binding per l'ACh sul dominio extracellulare di ciascuna molecola di recettore. Un sito di binding è situato in ciascuna subunità α all'interfaccia αδ e αγ. Ciascuna catena α presenta un sito di legame carico negativamente, a livello del quale interagisce il gruppo ammonico quaternario dell'ACh. Quando il neurotrasmettitore si lega al recettore nicotinico provoca una variazione della permeabilità della membrana, che permette il passaggio di piccoli cationi come il calcio, il sodio e il potassio. L'effetto fisiologico è una temporanea depolarizzazione della membrana, ossia una riduzione del valore assoluto del potenziale di placca.

Tale depolarizzazione determina una contrazione muscolare a livello delle giunzioni neuromuscolari o una semplice prosecuzione dell'impulso nervoso, come si verifica nei gangli autonomi. I recettori nicotinici neuromuscolari rappresentano un bersaglio farmacologico per i farmaci agonisti usati nella miastenia grave (patologia autoimmune dove gli autoanticorpi distruggono il recettore nicotinico) e per i miorilassanti antagonisti impiegati durante gli interventi chirurgici. Il blocco dei recettori nicotinici dei gangli autonomi ad opera di antagonisti svolge un ruolo nel controllo dell'ipertensione (esametonio).

Sottotipi di recettori nicotinici

• N₁ (N_M): Localizzati a livello delle giunzioni neuromuscolari e sono bloccati dalla succinilcolina, dalla tubocurarina e dal decametonio mentre sono attivati dal feniltrimetil-ammonio.
• N₂ (N_N): Localizzati sui gangli autonomi principalmente post-sinaptici. Sono bloccati dall'esametonio ma stimolati dalla dimetil-4-fenilpiperazina (DMPP).
• N_SNC: Identificati in numerose regioni del SNC, anche se la loro funzione non è ancora interamente compresa.

Recettori muscarinici

I recettori muscarinici sono essenziali nella regolazione delle funzioni degli organi innervati dal SNA per il mantenimento dell'omeostasi dell'organismo. Mediante questi recettori, l'ACh stimola o inibisce le attività dell'organo colpito. In particolare, l'ACh stimola le secrezioni delle ghiandole salivari e sudoripare.