Appunti Biotecnologie genetico molecolari

Biotecnologie genetico-molecolari

Cellula procariota

È aploide e contiene solo un cromosoma batterico chiamato DNA cromosomale. Questa molecola di DNA presenta milioni di basi nucleotidiche in sequenza. La cellula procariota può anche contenere DNA extra-cromosomale chiamato plasmidi che però non contengono informazioni importanti per la vita e sopravvivenza della cellula. I plasmidi sono degli idonei vettori di clonaggio perché possono trasferire informazioni genetiche da una cellula all’altra.

Cellula eucariota

La cellula eucariota è nata dalla simbiosi di due cellule procariote che, colonizzando lo stesso ambiente, si sono organizzate entrando una all’interno dell’altra specializzandosi in qualche funzione. I mitocondri e cloroplasti sono dunque delle cellule procariote specializzate rispettivamente nella respirazione o raccolta di elementi per fotosintesi. L’RNA ribosomiale è stato definito l’orologio molecolare, ovvero quella macromolecola presente in tutte le cellule, dalla più antica alla eucariota. L’RNA ribosomiale è stato trovato in tutte le cellule, e la sequenza delle basi nucleotidiche che porta alla sua formazione ha subito pochissimi cambiamenti. I ribosomi sono costituiti da due sub-unità. Quella più grande ha densità 50 S (Svedberg) mentre quella minore 30 S. Esse contengono del RNA ribosomiale, quello nella sub-unità minore ha densità di 16 S e viene chiamato rRNA 16S mentre l’altro rRNA 23S.

Ricombinazione genica

La ricombinazione genica indica i meccanismi con cui la cellula tende a evolversi. Lo scopo principale della cellula è la sopravvivenza, ovvero adattarsi e colonizzare l’ambiente. I processi più noti di ricombinazione genica sono trasformazione, coniugazione e trasduzione.

Trasformazione

La trasformazione è il processo più semplice: non implica un vero contatto fra le cellule. Una cellula infatti può vivere in un ambiente con DNA cromosomale o frammenti derivanti da lisi e morte di altre cellule. Dei sensori chimici segnalano la presenza di DNA extra-cromosomale e se la cellula ha necessità di evolversi arriverà allo stato di competenza, ovvero attiverà una serie di informazioni per produrre enzimi e proteine per acquisire quel DNA esterno grazie a proteine di trasporto. Talvolta sono necessarie anche delle nucleasi se il DNA è abbastanza grande. Una volta che il DNA viene trasportato da queste proteine, si attivano altre proteine per evitare che il DNA si pieghi su se stesso. A questo punto altre proteine specifiche cercano lungo il DNA se ci sono siti in cui il DNA esogeno può integrarsi. Se questo è possibile avviene l’inserimento. L’esito può essere positivo se il DNA è riuscito ad integrarsi e se le informazioni restano intatte e possono essere espresse dalla cellula. Oppure l’esito può essere negativo se il DNA esogeno non porta informazioni utili per la sopravvivenza o se non si è integrato nel DNA cromosomale, oppure ancora perché si è inserito in un gene che viene inattivato.

Coniugazione

La coniugazione prevede il contatto diretto fra due cellule. Nei gram - avviene con la formazione del ponte coniugativo mediato dal pilo F. Alcune cellule gram - possiedono un plasmide F che possiede le informazioni per far produrre alla cellula un pilo sessuale F che è il vero e proprio organo di contatto fra la cellula che ha prodotto il pilo F chiamata F+ e una cellula F- che non possedendo il plasmide non è in grado di produrre il ponte e collegarsi con altre cellule. In particolari condizioni ambientali, la cellula F+ prende contatto con la F-, si forma il ponte coniugativo che è un pilo cavo all’interno e può passare uno dei due filamenti di cui è costituito il DNA plasmidico: il plasmide F si rompe in un punto di uno dei due filamenti e attraverso un meccanismo di rotazione circolare uno dei due filamenti si srotola e raggiunge la cellula ricevente F-. Quando tutto il filamento ha raggiunto F-, si attivano in entrambe le cellule dei meccanismi di replicazione del filamento complementare costituendo plasmidi F completi. F+ ha quindi donato alla F- la capacità di diventare anch’essa F+. Questo è il meccanismo più semplice ma non porta grande variabilità. Il meccanismo è più interessante se il plasmide F è presente nella cellula donatrice come episoma, ovvero è presente nel DNA cromosomale invece di essere libero nel citoplasma. Il plasmide F possiede un punto OriT ovvero l’origine della replicazione e da qui viene tagliato per permettere al singolo filamento di passare alla cellula ricevente. Quando si legano F+ e F-, il plasmide si srotola e fa passare tutto il DNA cromosomale fino alla fine del plasmide F. Quindi potrà essere più o meno lungo a seconda della posizione del plasmide F. Entra quindi nella cellula ricevente anche parte di DNA cromosomale precedente al plasmide F. Questo può portare ad un’alta variabilità genetica. Nel caso dei gram + invece avviene la coniugazione ma non si ha il plasmide F e non si forma il ponte coniugativo ma avviene un contatto diretto tra la superficie cellulare del donatore e quella del ricevente. Ci sono dei segnali che emettono le cellule donatrici e riceventi come feromoni che vengono sintetizzati e portati all’esterno come segnali di riconoscimento affinché si formi un canale a livello della membrana e della parete per far passare il contenuto genetico. In questo caso vengono trasferiti i plasmidi che hanno un peso molecolare maggiore e non contengono dunque solo informazioni per la replicazione ma anche ad esempio la resistenza ad antibiotici che viene trasferita.

Trasduzione

La trasduzione viene mediata dai fagi (virus specifici per batteri). Essi sono entità dannose per le cellule perché sono parassiti, una volta che entrano nella cellula possono dare luogo a due cicli: litico o lisogenico. I virus hanno un capside proteico che protegge un genoma virale che è solo a DNA o RNA e questo spiega il fatto che essi hanno bisogno di entrare nella cellula per compiere il ciclo vitale. Questi però possono sbagliare e la cellula può trarne vantaggio. La trasduzione può essere generalizzata dovuta a un errore nel ciclo litico oppure trasduzione specializzata per un errore del fago nel ciclo lisogenico. Per quanto riguarda il ciclo litico, esso è composto da: infezione che inizia con il riconoscimento tra il batteriofago e la superficie cellulare. Il batteriofago inietta all’interno il proprio genoma mentre la struttura rimane all’esterno. Nel frattempo, le macromolecole della cellula si degradano perché non sono più utili alla cellula che sta andando incontro a morte e quindi ci sono anche dei frammenti di DNA degradati. Può capitare che nel capside venga inserita una frazione di DNA cromosomale della cellula e non il genoma virale, questo è un fago aberrante perché verrà fatto uscire dalla cellula durante la fase di lisi e sarà in grado di infettare un’altra cellula ma quello che si inserirà nel ciclo successivo non sarà DNA virale ma frazione di DNA cromosomale che può integrarsi a seconda del DNA all’interno del proprio cromosoma e permettere alla cellula di acquisire più informazioni.

Per quanto riguarda la trasduzione specializzata, invece ci si riferisce al ciclo lisogenico, cioè quello che viene chiamato profago che in alcuni casi quando fa entrare il proprio genoma all’interno della cellula non instaura un ciclo litico ma riesce a inserirsi all’interno del DNA cromosomale della cellula. Le informazioni portate dal genoma virale non vengono riconosciute e non vengono espresse dalla cellula. Questo può andare avanti per molto ma eventi esterni possono portare il DNA virale ad avere lo stimolo per staccarsi dal DNA cromosomale e nel momento in cui avviene la scissione si instaura subito il ciclo litico comportando la morte della cellula. Nella trasduzione specializzata, durante la scissione il DNA fagico può staccarsi in modo imperfetto e può portare con sé una piccola regione del DNA cellulare presente in una delle due estremità nelle quali è stato inserito il genoma virale; se questo avviene, quando il fago andrà a instaurare un altro ciclo lisogenico e riuscirà ad inserirsi all’interno di un altro DNA cellulare, porterà anche quei frammenti della cellula precedente che non vengono riconosciuti come genoma virale e fin quando la cellula vivrà col ciclo lisogenico, li potrà utilizzare.

Processi vitali della cellula

I processi vitali che avvengono nella cellula sono tre: replicazione, trascrizione e traduzione.

Replicazione

Il DNA è una molecola a doppio filamento costituita da 4 basi nucleotidiche: le purine (adenina e guanina) e le pirimidine (citosina e timina/uracile per RNA). Queste basi vanno a legarsi al desossiribosio e al gruppo fosfato formando due filamenti antiparalleli (la direzione di sintesi è 5’→3’) e complementari (ovvero ad adenina corrisponde timina e a citosina corrisponde guanina). I legami H presenti sono in numero diverso: tra A e T sono 2 mentre tra G e C sono 3. L’RNA a differenza del DNA è a singolo filamento e inoltre c’è l’uracile al posto della timina.

Esistono 3 tipologie di RNA:

• mRNA (o RNA messaggero): macromolecola intermedia fra le informazioni portate al DNA e il prodotto dell’informazione presente sul DNA. Esso si forma durante la trascrizione copiando le info che sono presenti sul DNA in una molecola a singolo filamento che poi andrà ai ribosomi che tradurranno il messaggio genetico nei prodotti codificati.
• rRNA (o RNA ribosomiale): macromolecola che costituisce i ribosomi dove avviene la sintesi proteica. All’interno delle due subunità 30S e 50S sono posti l’rRNA 16S nella più piccola e il 23S nella più grande.
• tRNA (o RNA di trasporto): presenta una forma a quadrifoglio in quanto è composto da un singolo filamento che si ripiega a formare delle anse per complementarietà delle basi ed è presente un ramo accettore che è quello che lega l’aminoacido specifico mentre dalla parte opposta c’è l’anticodone ovvero una sequenza di basi nucleotidiche che è complementare a quella posta sul DNA che si chiama codone. Ogni codone specifica per uno specifico AA che è quello che verrà legato al tRNA e portato a livello dei ribosomi per la sintesi proteica.

Il DNA è formato da una sequenza molto lunga di basi nucleotidiche. L’informazione si legge a triplette di basi nucleotidiche dove ogni tripletta rappresenta un codone ed è specifico per un particolare aminoacido. Questi codoni non sono pochi ma molti codificano per uno stesso AA. Sono stati individuati 64 codoni infatti rispetto ad un numero inferiore di AA. Le prime due basi sono specifiche per un AA mentre la terza può cambiare (degenerazione del codice genetico). Delle 64 triplette possibili che sono state individuate ci sono 61 codoni di senso che specificano per i 20 AA, 3 codoni di stop che danno un segnale di arresto nel processo della traduzione e trascrizione e 1 codone di inizio che è la tripletta ATG che è un segnale di inizio per far avvenire la traduzione. Questa tripletta ATG codifica solo per una N-formil-metionina.

Il gene è una sequenza nucleotidica continua, specificata da un codone di inizio ed un certo numero di codoni interni a cui si aggiunge il codone di stop. Il gene è l’unità che codifica per un determinato prodotto. Ci saranno più geni presenti lungo tutto il DNA ognuno codificante per un determinato prodotto. In biologia molecolare prima di gene si parla di ORF (open reading frame), ovvero una sequenza potenzialmente codificante ma non si conosce ancora il fenotipo.

Replicazione

La replicazione è complessa in quanto il DNA è superavvolto e non può disavvolgersi contemporaneamente quindi si devono aprire le forcelle di replicazione. Lungo il DNA c’è l’origine della replicazione, punto nel quale si apre la prima forcella replicativa per mettere a disposizione degli enzimi entrambi i filamenti. La replicazione infatti è semi conservativa, le cellule figlie avranno entrambe un filamento originale e il complementare di nuova sintesi. All’interno della forcella replicativa lavorano diversi enzimi e proteine che hanno il compito di tenerla aperta oltre alla DNA polimerasi che è l’enzima chiave della replicazione. La cellula ha diversi tipi di DNA polimerasi. La principale è in grado di copiare la sequenza nucleotidica presente sul filamento complementare. Essa però agisce solo sul filamento 5’-3’ e quindi la cellula per sintetizzare entrambi i filamenti complementari ha dovuto escogitare un metodo: i frammenti di Okazaki. Un’altra richiesta della DNA polimerasi è quella di cominciare la sintesi legandosi al doppio filamento grazie quindi a dei primer che sono dei corti frammenti di RNA che sono complementari al sito di azione della DNA polimerasi. Quando si aprono i filamenti, uno sarà in direzione 5’-3’ e uno nella direzione antiparallela. Nella direzione 5’-3’ il primo primer è all’inizio della forcella perché l’innesto ha la direzione opposta al filamento in cui si deve legare. Su un filamento 3’-5’ dunque avrò una sintesi continua mentre nell’altro caso la cellula predisporrà più inneschi all’interno della forcella per far sì che la DNA polimerasi sintetizzi i frammenti di Okazaki, ovvero piccole porzioni di DNA che verranno ricongiunte a fine processo per dare il filamento complementare a quello originale.

Trascrizione

L’enzima chiave è l’RNA polimerasi che andrà a legarsi a monte del gene della cellula che ha bisogno di trascrivere e tradurre; si apriranno i due filamenti e l’RNA polimerasi darà luogo alla sintesi dell’mRNA fino a quando al termine della sequenza ci sarà un terminatore che permette alla RNA polimerasi di staccarsi e terminare la sintesi dell’mRNA. Il sito promotore è una regione nucleotidica che sta a monte del gene da trascrivere. A livello di questo, la cellula può mettere in atto dei sistemi di regolazione affinché un certo gene possa essere espresso in determinate condizioni. Infatti, non tutti i geni sono sempre attivi e la cellula ha bisogno di meccanismi per bloccare la trascrizione di geni che non servono.

Quando parliamo di regione nucleotidica che sta a monte si intende una regione non codificante ma che ha delle particolarità, ovvero delle sequenze nucleotidiche che vengono riconosciute dalla RNA polimerasi e permettono il legame per dare inizio alla trascrizione. La cellula ha predisposto davanti ad ogni gene che può essere trascritto una regione con particolari sequenze che vengono riconosciute ed in particolare vi è il fattore sigma che è costituito da varie subunità, ognuna delle quali ha il suo compito nel processo della trascrizione; la subunità sigma è deputata a riconoscere questo sito promotore e consentire all’RNA polimerasi di legarsi al sito corretto per dar luogo alla trascrizione.

Il sito promotore è una regione non codificante che ha il compito di essere riconosciuto dall’RNA polimerasi e legarla attraverso due regioni (box) che hanno particolari sequenze di 6 nucleotidi: box -10 (sequenza che sta 10 basi prima della ATG iniziale del gene che deve essere trascritto), box -35 (35 basi prima della ATG del gene che deve essere trascritto). Questi box presentano quando la trascrizione è il più efficiente possibile, delle sequenze chiamate consensus, ovvero le sequenze alle quali si lega più fortemente l’RNA polimerasi e dà luogo ad una trascrizione efficiente. Nel box -10 queste sequenze sono TATAAT e viene chiamato tata-box mentre nel box -35 sono TTGATA.

Traduzione

Tra il box -10 e la ATG iniziale del gene che deve essere trascritto si trova anche una regione di 4-5 basi che è ricca di adenina e guanina chiamata rbs (ribosome binding site), una regione trascritta con l’mRNA e consente a livello dei ribosomi l’aggancio dell’rRNA nella giusta posizione per dare luogo alla traduzione di una proteina intera. Questa sequenza viene riconosciuta a livello dei ribosomi dal RNA ribosomiale 16s che caratterizza la subunità 30s dei ribosomi. Il sito promotore è quello che permette la variabilità dell’espressione di un gene che è fondamentale per la cellula. La regolazione può avvenire anche a livello dei ribosomi durante la traduzione ma questa avviene meno frequentemente. La maggior parte della regolazione dell’espressione genica avviene a livello del sito promotore ed avviene per tutti i geni che vanno a costituire l’operone. Un certo numero di geni può essere unito insieme perché raggruppati codificano prodotti che sono utili alla cellula contemporaneamente, per cui la cellula risparmia energia esprimendoli sotto un unico promotore. L’operone più noto è quello ribosomiale perché comprende tutti i geni che vanno a codificare per tutti gli RNA ribosomiali utili per la cellula. Un altro operone importante è l’operone E. Coli LAC, studiato in E. Coli nel quale ci sono 3 geni che codificano enzimi necessari per l’utilizzo del lattosio da parte di E. Coli. Comprendono una permeasi che consente al lattosio di entrare nella cellula, una beta-galattosidasi per la scissione del lattosio in glucosio e galattosio ed infine una acetil-transferasi per modificare il galattosio e farlo entrare nella via metabolica.

Regolazione

A livello del promotore ci possono essere più processi...