Appunti Biotecnologie genetico-molecolari

STRATEGIE DI IMPIEGO PCRSonda specie-specifica

Per tutte le specie batteriche note esiste un gene o una regione specifica con particolare sequenza comune a tutti i ceppi di quella specie (e diversa per i ceppi di altre specie). Non ha importanza se la sequenza target è codificante o meno. Le coppie di primers, costruite sulla base di questa sequenza, andranno ad amplificare questa sequenza solo nei ceppi che appartengono a quella determinata specie (amplificazione specie-specifica). Ciò che mi aspetto da questa applicazione è quindi una sola banda con un determinato PM (in questo caso si ha anche il PM dell'amplicone che deve corrispondere a quella regione precisa che è stata amplificata).

Tutti i microrganismi possiedono regioni specifiche a livello di specie ma il problema è che non per tutti esistono quelle coppie di primer che permettono di avere una sonda specie-specifica. Si chiama sonda specie-specifica ma in realtà si tratta di una coppia.

di primer specifici e un ciclo termico specifico che permettono di ottenere una sola banda di un determinato PM noto. Se si vuole applicare in campo reale in una matrice alimentare questa tecnica, si può cercare nelle banche dati bibliografiche se qualcuno ha già messo a punto queste coppie di primers, questo specifico ciclo termico e il PM dell'amplicone che rappresenta la sonda specie-specifica. Se la banda è unica e corrisponde ad un determinato PM, si può dire che quella specie è presente nella matrice alimentare. PubMed: banca dati biomedica che può essere usata gratuitamente. Esempio: ricerca in una matrice di una Salmonella enteritidis. La PCR è qualitativa quindi dice solo se è presente o assente. Serve quindi una sonda-specifica da ricercare sulle banche dati, in cui si troveranno anche il target utilizzato per valutare la presenza del genere e della specie. Dalla banca dati si ottengono anche il PM dell'amplicone nel formato HTML.caso di presenza di Salmonella enteriditis e il ciclo termico necessario ad ottenere il risultato corrispondente alla sua presenza. Dal target si possono poi costruire i due primers forward e reverse. Bisogna quindi estrarre il DNA dalla matrice in questione: considerare che nella matrice possono esserci componenti che possono proteggere il DNA che dobbiamo estrarre. Devo quindi fare in modo che queste cellule siano più predisposte alla lisi. A seconda della matrice può essere utilizzato un detergente cationico oppure dei kit commerciali (colonnine di affinità per il DNA, in modo tale da eluire il materiale contaminato e recuperare il DNA). Quindi, quando si esegue la PCR specie-specifica bisogna mettere a punto un protocollo di estrazione: passaggio critico e, di conseguenza, devo fare in modo di avere anche dei controlli positivi e negativi. Una volta recuperata la coppia di primers e il protocollo di estrazione del DNA della matrice, faccio la PCR specie-specifica. Non

bisogna fare la PCR solo per il mio campione, in quanto se dovesse risultare negativo non sarebbe comunque sicuro affermare che Salmonella enteriditis è assente. Importante è quindi specificare le condizioni di analisi ed effettuare un controllo positivo (verificare che ciò che ho trovato in letteratura corrisponda ad una specie-specifica, attraverso una prova con un ceppo di Salmonella enteriditis). Poiché è critico il passaggio dell'estrazione del DNA totale dalla matrice, devo fare anche un controllo di avvenuta lisi e di avvenuta estrazione, ovvero si cerca di amplificare un gene che sappiamo essere presente in tutti i microrganismi (indipendentemente dalla specie): si tratta dell'orologio molecolare. Questo viene amplificato con una coppia di primers universali, quindi utilizzati per il gene 16 rDNA di tutti i microrganismi (con rarissime eccezioni). Un' aliquota del DNA campione estratto dalla matrice alimentare la metto a contatto con

iprimers universali. Dopo gel elettroforesi devo vedere una banda di amplificazione relativa algene 16S, sempre se ho estratto quantità di DNA sufficiente all’amplificazione.

Dopo aver verificato che le procedure di analisi sono corrette, posso poi verificare la reale presenza o assenza del DNA di Salmonella enteriditis nella matrice.

Comunque, da non dimenticare è il controllo negativo di PCR per verificare l’assenza di contaminanti (campione amplificato con il campione in analisi, con tutti gli ingredienti della miscela, ad esclusione del DNA stampo). Questo non deve dare nessun segnale, appunto indicedi assenza di qualunque DNA (controllo negativo!).

Se non conosco nulla, ad esempio se devo rilevare la specie di un ceppo che contamina i processi di un’azienda, posso ricorrere all’impiego di primer universali. Questi permettono di amplificare il gene 16SrDNA. L’amplicone che ottengo lo si può inviare a ditte specializzate che operano il

sequenziamento (oppure si può fare nel proprio laboratorio). In questo modo si ottiene la sequenza del gene, il quale può essere inviato ad una banca dati genomica che conserva le sequenze del gene 16S dei batteri fino ad ora noti. Al sistema si richiede di allineare la nostra sequenza con i geni 16S depositati in quella banca dati. Nell'arco di pochi secondi / minuti si ha la risposta di allineamento, con anche la % di similarità della sequenza con un determinato gene 16S depositato. Dal 96.6% in su di omologia si può già pensare di aver individuato la specie. Ulteriore conferma si ha con la sonda specie-specifica o con riassociazione molecolare DNA-DNA spettrofotometrica.

Sequenziamento: Bisogna preparare l'amplicone del gene ed inviarlo a ditte che fanno il sequenziamento. Come viene fatto? Richiede la presenza di nucleotidi (normali) e nucleotidi terminator (modificati). Quest'ultimi consentono di ottenere una PCR di amplificazione.

contenente tutti degli ampliconi di Pm variabile e che poi vengono analizzati. Solitamente si sequenzia un solo filamento per volta, quindi, nella miscela di reazione di PCR si aggiunge un solo primer (per il filamento da sequenziare) insieme agli altri componenti.

I nucleotidi terminator sono modificati nel 3’ Oh del ribosio: il gruppo ossidrile viene modificato per cui non si ha più la possibilità dell’attacco del nucleotide successivo. L’azione della DNA polimerasi viene così bloccata. Questi nucleotidi terminator vengono anche marcati con fluorocromi in grado di mettere un segnale a lunghezze d’onde differenti. I 4 nucleotidi terminator vengono aggiunti insieme nella miscela di reazione. Viene poi impostato il ciclotermico e, quando il primer si lega alla giusta posizione, la DNA polimerasi inizia la sintesi (pescando a caso i nucleotidi della miscela). Se si lega al terminator, la sintesi viene bloccata da quel punto in avanti. Si formano

Ampliconi con lunghezze diverse e che terminano tutti con un nucleotide terminator (comunque diverso a seconda del complementare che trovano sul filamento stampo). Nella miscela di reazione si formano quindi tutti dei possibili ampliconi di PM diverso, da separare successivamente. La separazione avviene sfruttando la diversa fluorescenza che emettono.

La miscela viene messa in un sequenziatore automatico che pone la miscela ad elettroforesi all'interno di un capillare. Esso permette la separazione degli ampliconi con diverso PM e la loro diluizione dal più basso al più alto PM. Durante la diluizione un raggio laser colpisce il capillare e una cella fotoelettrica rileva i segnali di fluorescenza, che corrisponderanno a una delle 4 basi dei nucleotidi terminator. I segnali vengono memorizzati da un software. Serie di picchi di altezze e dimensioni diverse: la sequenza dei picchi corrisponde alla sequenza dei nucleotidi, ovvero il colore corrisponde al tipo di base azotata.

(mentre l'intensità e quindi l'altezza del picco è irrilevante). Questo macchinario viene chiamato elettroferogramma.

Si invia poi alle banche dati: per quanto riguarda l'allineamento delle sequenze si entra in un sottoprogramma, che permette di inserire la nostra sequenza e chiedere al database di allinearla con le sequenze simili presenti all'interno della banca dati.

Lettura di una sequenza

Bisogna ricordarsi quali sono i codoni di inizio e di stop.

- Di inizio: ATG;

- Di stop: TAA, TGA.

Bisogna anche conoscere le sequenze che delimitano il promotore, che sono:

- -10 TATAAT;

- -35 TTGACA

Le letture sono tre: prime tre basi già presenti come tripletta Primo frame di lettura

RBS (corta regione ricca di A e G) appena prima della TG: GGAGAATAATA = box -10

TTGTGC = box -35

Secondo frame di lettura

Si parte dalla terza base della sequenza. Anche in questo caso trovo una potenziale ORF che inizia con un ATG ma è incompleta.

Terzo frame di lettura

Consideriamo la

prima base dellasequenza come ultima base dellatripletta precedente.Analisi RSASe ho diversi microrganismi in una stessa matrice, come faccio ad usare queste tecniche? Sipossono avere terreni selettivi diversi che selezionano gruppi fisiologici diversi e ogni coloniaverrà identificata. L'amplificazione può venire d'aiuto se si considera la regione spaziatrice RS(regione nucleotidica che separa il gene 16S dal 23S all'interno dell'operone ribosomiale). Èuna regione non codificante ma è sufficientemente conservata. All'interno dell'operone la RSpresenta differenze tra specie diverse, relative a lunghezza e sequenza. Le differenze dilunghezza possono essere presenti anche nelle diverse copie di operone che sono dislocatelungo il genoma batterico (infatti il genoma può avere più copie di operone ribosomiale, fino a10-11 copie). Questa numerosità di operoni è stata attribuita ad esempio ai batteri aerobi,

che hanno sintesi proteica più attiva, richiedendo maggior numero di ribosomi (nel corso dell'evoluzione questi batteri hanno replicato il loro operone in più copie). Queste copie poi possono presentare diversità per quanto riguarda la sequenza di RS, che può avere lunghezza diversa anche per copie dello stesso genoma. Questi operoni hanno permesso di mettere a punto una tecnica di amplificazione, che è l'analisi della regione spaziatrice dell'operone ribosomiale. Si possono avere due o più bande di diverso PM (anche se il PM di una RS può variare da 200 a 700 paia di basi). Questi profili possono essere caratteristici delle diverse specie batteriche. Si può pensare di raggruppare omogeneamente tutti quegli isolati che hanno uno stesso profilo di regione spaziatrice. Se isolo tanti gruppi fisiologici differenti da una matrice. All'interno di ciascun gruppo avrò isolato molte colonie che rappresentano diverse

specie all'interno del gruppo. Dell