Appunti biotecnologie genetico molecolari

Biotecnologie genetico-molecolari

Lezione 1/10

Cellula procariota

Cellula semplice perché ha unica molecola di DNA a doppio filamento, non ha organelli all'interno specializzati come la cellula eucariotica, ha solo una zona nucleare dove si condensa il DNA. Il DNA è composto da 2 milioni di informazioni di base, è una molecola a doppio filamento circolare che è super avvolto in modo specializzato così da stare all'interno della cellula, inoltre ci sono enzimi per avvolgere e srotolare la cellula.

Inoltre, ha DNA extra cromosomali, sono i plasmidi che hanno stesse caratteristiche del DNA, conformazione CCC (cromosomiali, covalentemente, chiusa). I plasmidi hanno dimensioni inferiori, e portano informazioni aggiuntive, non fondamentali che favoriscono la cellula in alcune situazioni. Sono elementi genetici mobili MBE, perché non tutti i batteri hanno plasmidi e possono non averli per tutta la loro vita, possono essere acquisiti o persi a seconda delle condizioni.

A livello plasmidico ci sono informazioni per la sintesi di enzimi detossificanti (per cui si utilizzano per smaltimento di reflui, petrolio in mare, batteri degradano queste sostanze). Sono però poste anche le resistenze agli antibiotici. Problema si pone con batteri patogeni, che acquisiscono resistenza e sarà difficile sconfiggere malattie. Vi è uno screening per valutare capacità di produrre nuove molecole antibiotiche. Per selezionare modalità per processo bisogna valutare a livello di plasmide se è portata una resistenza.

I plasmidi sono studiati e utilizzati in modo positivo, clonaggio molecolare, usati come vettori per trasferire informazioni da una cellula all’altra, anche da domini diversi. Plasmide non si replica con il DNA cromosomico, non con processo di scissione binaria. Non è legata alla crescita batterica ma si replica più volte, più copie della stessa molecola, più copie presenti maggiori informazioni sono espresse. La cellula batterica fa replicare il plasmide a seconda delle necessità, c’è sintetizzazione di proteine.

Episoma: plasmide che si integra all’interno del cromosoma batterico, non lo fanno tutti i tipi ma solo quelli che riconoscono la zona del DNA. Si può riconoscere sul DNA la zona del plasmide integrato.

Albero filogenetico e teoria dell'endosimbiosi

Maggiore semplicità cellulare comporta una migliore adattabilità con i cambiamenti climatici. Si hanno così i domini: batteri, archeobatteri (estremofili, adattato nel tempo a vivere in quelle condizioni di isolamento, batteri isolati dai ghiacciai, fosse oceaniche, solfatare) eucarioti, per capire come da cellulare procariote si è evoluta la cellula eucariote.

Teoria dell'endosimbiosi: Due cellule procariote erano in difficoltà in un habitat, c’è stato un contatto e hanno attuato simbiosi molto stretta così da dividersi i compiti. I mitocondri rappresentano cellula primitiva che deriva da quella simbiosi. Mitocondri hanno stesso RNA ribosomiale uguale a quello dei batteri. Cellula primordiale a RNA poi nel corso dell’evoluzione si è modificata, si è studiato un prodotto presente in tutte le cellule che potevano comparare, quindi da cellula primordiale hanno estratto materiale genetico da fossili, hanno individuato quello che viene chiamato un orologio molecolare: macromolecola informazionale che avesse la caratteristica di essere presente in tutte le cellule, che avesse la stessa funzione e che nell’arco di miliardi di anni avesse una sequenza dei costituenti che fosse conservata nel tempo, così che la comparazione della macromolecola potesse permettere di valutare la distanza evolutiva in funzione del numero di variazioni.

La scelta dell’orologio molecolare è stata l’RNA ribosomiale 16S, si trova nei ribosomi, nella subunità minore del ribosoma batterico. Subunità 30S e 50S nei batteri, ribosomi attivi le due subunità si uniscono (noto come ribosoma 70S quello batterico, 80S quello eucariote). Subunità minore data dal rRNA 16S insieme alla catena polipeptidica specifica rende attiva l’unità. La parte di rRNA 16S è presente in tutte le cellule più antiche ma anche in quelle eucariotiche (mitocondri). Utile per identificare ceppo batterico è quindi la sequenza conservata (orologio molecolare).

Lezione 2/10

Modifiche genetiche e scambio genico

Cellule si modificano e le loro informazioni genetiche, acquisiscono nuove da altre cellule, scambiano materiale anche con ambiente. Primi processi di scambio genico sono legati solo ai batteri, sono unidirezionali, parziali e occasionali, possono portare ad un esito negativo, quindi fatto solo quando la cellula è indotta a cambiare, se ambiente non adatto, parziale perché cellula non è in grado di acquisire, unidirezionale perché c’è cellula che dona e una che riceve.

• Trasformazione: acquisizione di DNA esogene senza contatto diretto. Indotto da condizioni ambientali. Stato di competenza: Processo inizia quando c’è attivazione di geni in grado di produrre enzimi specifici per acquisire DNA esogeno, che proviene da altre cellule che hanno terminato la loro vita cellulare e si sono lisate. Cellula ricevente sente DNA esogeno all’esterno, attiva proteine di legame presente sulla superficie cellulare che legano il DNA. Si attiva nucleasi che idrolizza doppio filamento perché cellula preferisce usare singolo filamento da integrare nel suo cromosoma, ci sono poi proteine di membrana, di trasporto che permettono l’ingresso, altre proteine stabilizzano il filamento e non lo fanno ripiegare, rec A lega filamento e legge se c’è zona/sito in cui DNA esogeno può essere inserito e sostituisce una porzione del DNA cromosomale. Processo fatto anche in laboratorio. Ogni gene presente viene regolato in funzione delle esigenze della cellula.
• Coniugazione: prevede contatto tra cellula donatrice e cellula ricevente. Cellula ricevente manda un ferormone per chiedere aiuto. Processo studiato prima nei gram-negativi: formazione pilo F che forma ponte coniugativo tra le due cellule, nei gram-positivi avviene per contatto diretto, si forma canale tra due membrane, plasmide più grande e non c’è episoma (trasferimento genico orizzontale). Plasmide F che possiede unicamente le informazioni per la propria replicazione e per il pilo, quando plasmide si trova nel citoplasma e si forma il ponte una copia del plasmide passa nell’altra cellula. Doppio filamento del plasmide si rompe e solo un filamento passa all’interno del ponte, meccanismo rolling circle, si srotola solo un filamento, poi ce intesi del filamento complementare in entrambe le cellule. Da cellula F+ a F- (che diventerà F+, cioè potrà produrre un ponte). C’è variabilità quando plasmide f è all’interno del cromosoma, in un determinato punto (episoma). Punto in cui enzima rompe il filamento chiamato OIT. Plasmide legato al cromosoma e quindi c’è srotolamento del DNA cromosomale passa alla cellula ricevente, indice di grande variabilità, di solito non avviene in natura perché cellula non riesce a contenere tutto, tempo di contatto limitato così da non passare tutto il DNA cromosomale del donatore. Cellule HFR+ (alta frequenza di ricombinazione): hanno ricevuto porzione di DNA cromosomale.
• Trasduzione: mediato da un fago (virus che attacca i batteri). Fago può avere 2 cicli. Fago inietta lisozima che crea foro tra la membrana e inietta il suo DNA nel batterio (infetta).

Ciclo litico

Stimolo esterno causa la escissione del DNA fagico e ci sarà moltiplicazione e lisi della cellula, si hanno tante molecole virali. Cellula lavora solo per costruire fagi, e quindi si degradano le parti del Dna cromosomali, c'è assemblaggio dei virus. Durante assemblaggio il fago può sbagliare a introdurre DNA virale ed entra DNA cromosomale che si stava degradando, particella fuoriesce e può infettare altra cellula ma non sarà lisata, al contrario riceve combinazione genica per caso Trasduzione generalizzata.

→ Trasduzione specializzata: durante l’escissione può esserci un errore, taglio sbagliato, e si può avere DNA virale e cromosomale. Cellula blocca solo DNA virale mentre il DNA cromosomale nella cellula infettata può esprimere geni portati su porzione di DNA cromosomale.

Ciclo lisogenico

Il DNA del fago si integra nel DNA cromosomale, cellula riconosce geni fagici e li blocca.

Lezione 8/10

Struttura e funzione del DNA

DNA: sede di informazione genetica della cellula. Il DNA è formato da 2 filamenti antiparalleli, direzione indicata da 5‘ a 3’. Lo zucchero è il desossiribosio, ha 4 basi azotate divise in purine (adenina e guanina) e pirimidine (tiamina, citosina e uracile). Doppia elica formata da 2 filamenti tenuti insieme da legami idrogeno, 2 legami (adenina-timina) oppure 3 legami (guanina-citosina). A livello di laboratorio si rompono legami idrogeno a temperatura di denaturazione sarà tanto maggiore al contenuto di guanina e citosina, perché legati da 3 legami.

RNA e sue forme

RNA: in 3 forme diverse. Ribosio al posto del desossiribosio, a singolo filamento, uracile al posto della tiamina. Messaggero, ribosomiale e transfer.

• RNA messaggero: Filamento lineare di sequenze nucleotidiche: copia l’informazione presente sul DNA e porta il messaggio a livello dei ribosomi.
• RNA ribosomiale: costituisce i ribosomi, in cui avviene la sintesi proteica. Subunità maggiore: 50S contiene rRNA 23S + 5S, subunità minore: 30S contiene rRNA 16S.
• RNA transfer: lega e trasferisce un amminoacido specifico ad una catena polipeptidica in crescita a livello dei ribosomi.

Espressione genica e codice genetico

Le informazioni presenti a livello del DNA espresse dal codice genetico che si esprime in triplette (64 codoni) che identificano gli amminoacidi. I codoni sono maggiori ai 20 AA di senso, più codoni possono codificare per più amminoacidi. Codoni di inizio (ATG a cui corrisponde un n-formil-metionina-AA modificato che serve per identificare l’inizio) e di 3 codoni fine identificano una porzione di DNA, che codifica per un determinato prodotto. Diversità risiede solo nell’ultima base della tripletta → degenerazione del codice genetico, ha permesso alla cellula di continuare anche se ci sono state modificazioni.

Replicazione e trascrizione

Replicazione: copia per la molecola figlia. Semi conservativa perché ciascuna cellula ha filamento originario e uno di nuova sintesi. OIT: inizio della replicazione, formazione della forcella replicativa. Filamenti rimangono aperti grazie alle proteine specifiche – single strand end blinding protein. Dna polimerasi: richiede 2 requisiti. Vuole lavorare solo in direzione 5’→3’, si deve legare al doppio filamento di DNA antiparallelo, quindi usa i primer che sono complementari a una piccola regione del DNA da cui inizia la sintesi.

Trascrizione: avviene a livello di specifici geni, richiesti dalla cellula. Processo a opera della RNA polimerasi, si lega al gene che deve essere trascritto, così da formare l’RNA corrispondente. A monte del gene esiste regione nucleotidica che rappresenta ciò che è noto come sito promotore, zona specifica riconosciuta da RNA polimerasi, che si lega sul sito promotore e consente apertura dei 2 filamenti e copia l’informazione fino a quando riconosce il sito terminatore definito dal codone di stop, e dal fatto che il filamento aperto in copiatura si richiude a formare una forcina (ansa) che consente lo stacco della polimerasi.

RNA polimerasi e sito promotore

RNA polimerasi è formata da diverse subunità tra cui la subunità sigma che consente l’attacco alla zona promotore. Il sito promotore, definito con sensus, è stato identificato come la zona migliore per avere una trascrizione efficiente del gene è costituito da 2 box: -10 e -35 sono a 10 basi prima dell’inizio ATG del gene, e a 35 basi dalla fine del gene. Importanti per promuovere la trascrizione. In queste zone la sequenza deve essere tale da consentire il legame più forte con RNA polimerasi. Box – 10 costituito da sequenza specifica di paia di basi, che nelle condizioni migliori è data da TATA AT. La sequenza del box -35 è TTGACA.

Tra questi box e l’RNA polimerasi si forma un forte legame che consente l’apertura dei filamenti e la trascrizione. Se sito promotore costituito da box -10 e -35, che si trovano alla giusta distanza e si hanno sequenze con sensus allora la trascrizione avviene nel modo più efficiente possibile e quindi il sito promotore è detto forte.

Siti promotori e traduzione

Sito promotore non è uguale a quello con sensus ma ha diversità di basi e alcune volte è a distanza maggiore del con sensus, ciò significa che la cellula può aver subito modificazioni, oppure può essere stata la cellula a mettere sotto promotore debole quel particolare gene che deve essere trascritto. Effetti di combinazione genetica allontana il promotore, rallenta la trascrizione. Tra sito promotore e gene c’è regione che serve per regolare la trascrizione del gene. Cellula è in grado di accendere/spegnere un gene a seconda delle sue necessità.

Tra sito promotore e inizio del gene si può trovare un sito chiamato – ribosomial binding site: corta sequenza di basi, ricca di adenina e guanina, regione è utile per essere riconosciuta a livello dei ribosomi per dare inizio alla traduzione, questa sequenza viene riconosciuta da una sequenza complementare presente su rRNA 16S. Sequenza presente su RNA ribosomiale 16S chiamata Shine – Dalgarno. Se gene non ha sito promotore significa che è stato reso inattivo dalla cellula. Il sito promotore non va letto a triplette, regione non codificante, cerco solo sequenza consensus.

Ribosoma attivo ha 2 siti, sito amminoacidico e sito peptidico, RNA trasfer ha legato sul codone l’amminoacido corrispondente e si lega sul sito.

Organizzazione del DNA: operoni

Operone: Cellula riunisce sotto un cosiddetto operone 2 o più geni che forniscono prodotti utili nello stesso momento, quindi da fare trascrizione unica, unico RNA messaggero, unico sito promotore a monte del primo gene, geni sono trascritti insieme. Insieme di geni trascritti e regolati insieme perché i loro prodotti servono contemporaneamente alla cellula.

Operoni studiati

• Operone ribosomiale: più studiato, e più semplice. Tutti gli rRNA sono specificati a livello di geni raggruppati in questo operone. Nei batteri è costituito dal gene che codifica per rRNA 16S separato da corta regione non codificante, regione 23S rRNA, infine gene che codifica per rRNA 5S, sito terminatore unico.
• Operone LAC: riunisce almeno 3 geni per utilizzo del lattosio: Permeasi (proteina di trasporto per riconoscere lattosio presente all’esterno e che lo porta in modo selettivo all’interno della cellula), Beta galattosidasi (enzima in grado di rompere il lattosio in galattosio e glucosio), Altri enzimi (a seconda delle diverse specie batteriche, coinvolti per utilizzo successivo del lattosio).

Operone LAC studiato su Escherichia Coli: esperimenti per capire come i geni siano regolati dalla cellula, ci sono tanti meccanismi di regolazione che sono indispensabili per la cellula, coinvolgono proteine in grado di formare legami più o meno stabili con delle regioni specifiche del DNA, sono proteine regolatrici in grado di formare legami H tra basi nucleotidiche del DNA e gruppi R degli AA. Motivo HTH = helix-turn-helix ci sono processi di regolazione anche sulla traduzione.

Strategie per il controllo della trascrizione

• Controllo mediante repressione (negativo): si lega al sito operatore, impedisce la trascrizione.
• Controllo mediante attivazione/repressione da catabolita (positiva): complesso proteico (proteine Camp).

Operone LAC

Contiene i 3 geni per utilizzo del lattosio, chiamati Lac Z, Lac Y e Lac A, codificano per gli enzimi per l’utilizzo del lattosio. Lac Z è a monte del primo gene, è il sito promotore debole: tra il sito promotore e inizio del primo gene esiste una regione che allontana il promotore, e costituisce il sito operatore: regione deputata al legame con specifiche proteine regolatrici, che regolano l’attivazione dei geni a valle. Sito difficile da identificare perché non ha sequenze con sensus, ma possono variare a seconda del batterio, del gene e dell’operone.

Repressione e attivazione dell'operone LAC

A questo sito si lega una proteina regolatrice - repressore - nel momento in cui la cellula non ha disposizione di lattosio e quindi non ha bisogno dell’attivazione di geni (operone viene spento). Il repressore viene sintetizzato e si lega nel sito operatore e crea ingombro sferico per l’RNA polimerasi e quindi si blocca la trascrizione.

In presenza di lattosio: la cellula attiva l’operone. La proteina repressore è una proteina allosterica che ha affinità anche con il lattosio, che fa da induttore; lattosio si lega alla proteina regolatrice, con un legame forte (più forte di quello che legava la proteina regolatrice) e permette staccare repressore e far attaccare l’RNA polimerasi, per dar luogo la trascrizione.

I mo possono trovarsi in ambiente con 2 fonti di carbonio: es glucosio e lattosio. Prima mo cresce utilizzando glucosio, alla fine attiverà i geni per l’utilizzazione del lattosio.

Controllo mediante attivazione

Operone LAC regolato da promotore debole perché lattosio induce il repressore ad attaccarsi: cellule pone operone LAC sotto promotore debole così che vengano formati pochi trascritti degli enzimi per lattosio, e ha un altro a monte del sito promotore.