Appunti biotecnologie genetico molecolari

IBRIDAZIONE SU MEMBRANA

Con la PCR posso effettuare molti altri esperimenti, ma a volte è necessario abbinare

all’amplificazione anche delle altre tecniche. Come per esempio l’ibridazione su membrana o

ibridazione Sauder, permette di andare per esempio a rilevare la presenza di un gene di cui non

conosciamo la sequenza all’interno del genoma, permette di determinare il numero di copie di un

determinato gene presente lungo il genoma e permette di andare a localizzare un determinato gene di

interesse a livello cromosomale o a livello plasmidico. Per ottenere queste informazioni è necessario

oltre all’amplificazione imparare la tecnica di ibridazione su membrana. Per geni di cui sospetto la

presenza ma non conosco la frequenza. Con l’analisi RSA non mi da il numero di operoni, ma solo

delle bande corrispondenti alle lunghezze diverse della sequenza presenti nel genoma. Per esempio

posso avere 6 geni, ma con solo due differenti lunghezze, ciò produce solo due bande differenti.

L’ibridazione su membrana mi permette di localizzare un determinato gene a livello cromosomale o

plasmidico, è indicazione utile per esempio per i geni che portano resistenza agli antibiotici.

Purtroppo non è più possibile trovare dei MO positivi che vogliamo utilizzare nell’ambito alimentare

che siano sensibili agli antibiotici, dobbiamo sincerarci che quella resistenza sia portata a livello

cromosomale e non plasmidico per sincerarci che la resistenza agli antibiotici non sia trasmissibile.

Quindi quando voglio saggiare la potenzialità di impiego di un determinato ceppo e sappiamo che

quel MO è resistente ad alcuni antibiotici dobbiamo individuare i geni di resistenza e se si trovano a

livello cromosomale. Se questi geni sono portati a livello plasmidico non devono essere utilizzati per

scopi alimentari.

IBRIDAZIONE DOT BLOT

Membrana di nitrocellulosa o nylon a seconda dei laboratori sul quale poter fissare un’aliquota del

DNA. Se voglio solo una risposta qualitativa della presenza/assenza di un determinato gene che sto

studiando estraggo il DNA totale del ceppo e poi una aliquota con un capillare viene deposta sulla

membrana per ibridazione, si crea uno spot in cui ho deposto i DNA da saggiare, questo DNA deve

essere preventivamente denaturato per permettere l’ibridazione. Questo DNA viene fissato alla

membrana. Ho trattamento con sonda opportuna, vale a dire DNA, gene o regione, che deve ibridare

su DNA totale se trova complementarietà.

Gene che sto ricercando deve essere estratto da un DNA, poi amplificato con PRC. Viene marcato

per permettere successivamente di verificare l’ibridazione. Poi messo a contatto con il DNA messo

su membrana nelle opportune condizioni per favorire la riassociazione con opportune condizioni di

T e forza ionica.

Faccio avvenire l’ibridazione nelle giuste condizioni per circa 3-4 ore. Se ho adottato delle giuste

condizioni di riassociazione, se la sonda trova della complementarietà con una regione del DNA

denaturato si legherà a quelle regioni. Legandosi porterà con sé la marcatura. Al termine

dell’ibridazione devo effettuare lavaggi della membrana per eliminare il rumore di fondo della sonda

non legata, lavorando sulla specificità della reazione che voglio ottenere faccio in modo che la sonda

che si è legata solo parzialmente venga staccata in modo tale da avere alta stringenza di reazione, alta

specificità. Dipende dall’analisi che sto effettuando, se voglio alta specificità devo avere alta

astringenza, la ottengo con un lavaggio con tampone con forza ionica decrescente e temperatura

crescente. Vari protocolli indicano T e forze ioniche migliori per fare in modo che rimanga legata

solo sonda molto complementare, viceversa se voglio bassa specificità.

Dopo aver effettuato i lavaggi vado a rilevare la marcatura. La marcatura può essere con chiemio-

luminescenza, reazione antigene anticorpo con una fosfatasi alcalina. Permette di andare a rilevare su

una lastra fotografica l’avvenuta ibridazione della sonda con il DNA, dove si è legata valuto la

presenza di uno spot la dove la sonda è rimasta legata al DNA. Se ho segnale forte la sonda si è legata

bene a una regione complementare del DNA. Se ho segnale debole o il gene è presente in minor

quantità o che il legame era forte ma non al 100%, indicazione qualitativa della presenza o assenza.

Questo tipo di esperimento lo si può fare quando voglio rilevare la presenza di un gene all’interno di

un ceppo di interesse di cui non conosciamo la frequenza. Gene che codifica per beta-galattosidasi.

Lattobacillus Elveticus ha operone LAC molto presente, volevano verificare se potessero modificare

l’espressione del gene per aumentarla. In banca dati non c’era la sequenza per quel MO. Si tratta di

un gene che codifica per un enzima ho possibilità di andare a cercare in banca dati la sequenza

depositata di geni codificanti per lo stesso enzima, con uguale attività in altri MO, posso chiedere di

allineare selezionandole le sequenze depositate di un certo numero di geni codificanti la beta-

galattosidasi presenti in altri MO, l’allineamento di sequenza di geni che codificano per diversi

enzimi permette di individuare una regione nucleotidica conservata rispetto al resto del gene perché

corrisponde al dominio catalitico tipico di quel particolare enzima. I geni codificati per attività

enzimatiche possono avere sequenze diverse per MO differenti, ma avranno conservata una sequenza

nucleotidica che poi permette di avere la catena di amminoacidi specifici all’interno del sito catalitico.

All’interno della regione conservata posso costruire una coppia di primer che mi permette di

amplificare una regione all’interno del gene di interesse. Questo permette per queste tipologie di geni

di andare ad ottenere una piccola regione interna del gene di interesse che rappresenta il dominio

catalitico, da questa regione posso applicare l’amplificazione divergente per andare a ottenere via via

tutta la sequenza del gene. Cerco in specie lontane dalla mia per avere la sicurezza di considerare la

zona che codifica per il sito attivo.

Però in alcuni casi, soprattutto per geni che non conservano una regione conservata il problema risulta

più difficile; a volte dobbiamo andare a individuare la presenza di un gene che codifica la resistenza

a un antibiotico non riesco più a fare quello che abbiamo fatto per la ricerca dell’enzima. I geni che

codificano per la resistenza a un antibiotico in MO differenti trovo una tale variabilità di sequenza da

rendere difficile individuare una regione in cui costruire dei primer. In questo caso mi avvalgo della

banca dati per andare a cercare la sequenza di un gene che codifica per la stessa resistenza nelle specie

geneticamente simili. Sperando che le variazioni di sequenza non siano così grandi. In questo caso le

specie devono essere simili. Anche in questo caso se individuo la sequenza di un gene in una specie

filogeneticamente simile alla mia di utilizzare dei primer poi poi vedere se l’amplificazione avviene.

Non sempre avviene.

Quando non avviene l’amplificazione uso geni con sequenza nota come sonda, conoscendo la

sequenza di quel gene, ordino il ceppo di riferimento amplifico con primer e ottengo l’amplicone del

gene di interesse (es resistenza all’antibiotico). Ottengo quindi una sonda per il gene, questa viene

marcata e messa sulla membrana con il DNA denaturato. Se quel gene è presente otterrò un risultato

positivo alla rilevazione della marcatura, inizierò ad avere delle prime rilevazioni sulla presenza di

un gene simile. Poi sarà la specificità della reazione che mi farà capire se quel gene che ha ibridato

con la sonda è più o meno complementare con la regione corrispondente sul DNA totale del ceppo

allo studio.

Se ottengo questo segnale posso poi procedere con ulteriori studi.

IBRIDAZIONE SAUTER

Se voglio isolare la regione del DNA che ha dato segnale positivo devo attuare ibridazione su

membrana che è l’ibridazione Sauder. Permette di ottenere indicazione sugli altri due esperimenti.

Posso pensare di separare il DNA su un gel di elettroforesi e poi di utilizzare questo gel per trasferire

il DNA alla membrana di nitrocellulosa, anziché di impiegare tutto il DNA. A seconda di tutto quello

che voglio ottenere il DNA totale che ho estratto può essere o frammentato con opportuni enzimi di

restrizione in moto dale poi da caricare il campione su gel e ottenere una serie di frammenti lungo

tutta la corsa elettroforetica di diverso peso molecolare in funzione dell’azione dell’enzima di

restrizione impiegato oppure di separare il DNA cromosomale da quello plasmidico grazie a una

diversa corsa elettroferetica. Il DNA da caricare su gel per effettuare poi l’ibridazione su membrana

verrà trattato in funzione di quello che voglio ottenere.

Se io voglio frammentare il DNA con opportuni enzimi di restrizione lo voglio fare perché o voglio

individuare la presenza di quel gene che ho visto prima col dot-blot e vorrei individuare un frammento

sul quale quel gene è portato in modo tale da cercare di ottenere la sequenza di quel gene fin ora

sconosciuto, oppure frammentae il DNA per conoscere il numero di copie di un determinato gene

lungo il genoma. Se voglio invece ottenere solo la localizzazione di un gene allora il DNA totale

viene direttamente fatto correre su gel perché sappiamo che il DNA cromosomale si separa facilmente

dal DNA plasmidico. Quindi come tratta il DNA prima di un’ibridazione su membrana dipende da

quello che voglio studiare.

Indipendentemente da questo il trattamento sul DNA nel gel prima di essere trasferito su membrana

è diverso, non basta denaturare e caricare, devo comunque denaturare ma non posso alzare la T perché

il gel si scioglierebbe quindi devo denaturare in situ utilizzando una soda concentrata, avrò

denaturazione alcalina. Prima però poiché è stato visto che le purine vengono trasferite più

difficilmente sulla membrana si effettua anche un trattamento con HCl a cui segue il trattamento di

denaturazione con soda e al termine si usa un tampone a elevata forza ionica con pH 7 per riportare

il gel alla neutralità. Il gel viene lavato con queste tre soluzioni, il DNA presente sul gel è denaturato

posso procedere con il trasferimento del DNA separato alla membrana di nitrocellulosa. Si ritaglia la

membrana della dimensione adatta si pone la membrana a contatto con il gel e poi sopra questa

membrana vengono posti diversi strati di carta assorbente e poi un penso. SI lascia così per una notte

in modo tale che per capillarità il DNA passi sulla membrana nella stessa posizione in cui era presente

sul gel. Al termine del trasferimento il gel diventa molto sottile, il tampone è passato alla membrana.

Al termine di