Appunti Biotecnologie entomologiche

Il genoma degli insetti

Dogma centrale della biologia molecolare

Il "Dogma centrale della biologia molecolare" venne proposto da F. Crick nel 1958 e stabilisce che l'informazione biologica risiede nel DNA, viene trasferita dall'RNA e tradotta in proteine. L'acido desossiribonucleico (DNA) è una lunga molecola polimerica formata da numerosi monomeri collegati tra essi e organizzati ad elica. Ogni monomero si chiama nucleotide. Ogni nucleotide è formato da un gruppo fosfato, uno zucchero (desossiribosio) e una base azotata (adenina, guanina, timina e citosina). I nucleotidi si legano tra loro attraverso legami fosfodiesterici. Il DNA che forma i cromosomi è costituito da diversi milioni di nucleotidi. Ad esempio, nell'uomo il cromosoma 1 è costituito da quasi 250 milioni di basi.

Caratteristiche del RNA

L'acido ribonucleico (RNA) presenta due importanti differenze rispetto al DNA. Lo zucchero è il ribosio e, tra le basi azotate, manca la timina, sostituita dall'uracile. Inoltre, mentre il DNA è costituito da 2 filamenti di nucleotidi, l'RNA è formato da un solo filamento.

Scoperta della struttura del DNA

La scoperta della struttura del DNA si deve a J. Watson e F. Crick, che nel 1953, elaborarono il primo modello della molecola. Il DNA è costituito da una doppia elica di catene di nucleotidi che decorrono l'una in senso contrario all'altra (antiparalleli). Le basi azotate sono disposte nella parte interna della doppia elica, con l'adenina che combacia con la timina e la guanina con la citosina. Gli zuccheri e i gruppi fosforici sono dislocati all'esterno. Le due catene sono tenute insieme da un debole legame idrogeno. L'elica ruota ogni 10 paia di basi (bp) circa.

Complementarietà delle basi

Il principio della complementarietà delle basi è un elemento fondamentale del DNA, con notevole significato pratico nell'applicazione delle tecniche molecolari di laboratorio per produrre le copie del DNA. Questo principio è alla base della replicazione cellulare perché permette la produzione di una perfetta copia della molecola che contiene l'informazione genetica. La timina è complementare solo all'adenina, mentre la guanina lo è solo alla citosina. Nel RNA l'adenina è complementare all'uracile.

Organizzazione del DNA

La cromatina è la struttura in cui è organizzato il DNA, l'RNA e le proteine. Essa è fluida durante l'interfase (in questa fase si trascrive e si replica il DNA) e compatta (cromosomi) durante la mitosi. Il DNA nucleare è contenuto in un numero variabile (da 1 a 221, a seconda della specie) di cromosomi. La cromatina è suddivisa in eucromatina ed eterocromatina. Questa suddivisione è una delle caratteristiche più conservate del genoma dei viventi. Nell'eucromatina si trova gran parte dei geni e in essa si svolgono i processi di trascrizione e di sintesi proteica. L'eterocromatina controlla i processi di condensazione e replicazione del DNA, i movimenti dei cromosomi e l'appaiamento durante la meiosi.

Cromosomi degli insetti

I cromosomi degli insetti sono stati tra i primi ad essere studiati, permettendo significativi progressi nelle conoscenze genetiche. Il genoma completo di Drosophila melanogaster (Diptera, Drosophilidae) venne sequenziato nel 2000, poco tempo dopo i genomi di Saccharomyces cerevisiae e del nematode Caernorhabditis elegans.

Associazione DNA-proteine

Per poter essere contenute nel nucleo, le lunghe catene del DNA si legano a dei gruppi proteici (istoni). L'associazione viene chiamata nucleosoma. Si conoscono 5 tipi di istoni (H1, H2A, H2B, H3 e H4), formati da 100-200 aminoacidi dei quali il 20-30% sono arginina e lisina. Il DNA che codifica per gli istoni è altamente conservativo, ovvero immutato da milioni di anni. Questo testimonia il ruolo cruciale che gli istoni svolgono nel coadiuvare le funzioni del DNA. Gli istoni sono elementi strutturali che fanno mantenere al DNA una precisa forma.

Il concetto di gene

Oltre le proteine istoniche ve ne sono altre non-istoniche (neutre o acide). Il concetto di gene si è modificato con l'acquisizione delle nuove conoscenze in genetica molecolare. I geni sono segmenti del DNA formati da un numero variabile di nucleotidi da un minimo di 75 a non più di 200.000. Essi contengono l'informazione per la sintesi di una proteina, mentre la loro decodifica viene effettuata dall'RNA. Le proteine possono assumere le funzioni di enzima, entrare nella struttura delle cellule o attivare la funzionalità di altri geni.

Codice genetico

Il codice genetico si basa sulla sequenza di triplette o codoni di nucleotidi nelle molecole del DNA. Ogni tripletta corrisponde a un aminoacido, per cui l'ordine con cui esse si succedono rappresenta la modalità con cui debbono essere assemblati gli aminoacidi nella costruzione di una proteina. Le 4 basi combinate possono originare 64 triplette o codoni. Tuttavia, essendo gli aminoacidi solo 20, più codoni possono codificare per un aminoacido. Tre triplette (UAG, UAA, UGA) funzionano come segnale di fine traduzione e AUG (corrispondente alla metionina) è il codone che ne indica l'inizio. Il codice non è identico per tutti gli organismi. Ad esempio, AGA che codifica l'arginina, in Drosophila sp. codifica la serina.

Sezioni codificanti e non codificanti

In una catena di DNA le sequenze geniche codificanti sono alternate a sequenze non codificanti. In alcuni casi, un numero variabile di geni formano gruppi con funzioni che possono essere o meno correlate e coordinate tra loro. Se l'attività è tra loro collegata, si parla di famiglie multigene. Gli studi hanno evidenziato che esse hanno origine da un singolo gene che col tempo si è più volte duplicato. Esempi di famiglie multigene (poligeniche) sono quelli che codificano per l'actina, la tubulina, ghiandole salivari, corion e cuticola.

Esone e introne

In molti geni, le sequenze utili per la sintesi di una proteina (esoni) vengono interrotte da sequenze geniche senza senso apparente (introni). Quando le cellule producono una nuova proteina, per prima cosa esse copiano la sequenza genica in una molecola di RNA. Dopo, un meccanismo di taglia e incolla interno alla cellula, rimuove gli introni e unisce nella sequenza genica gli esoni. Molti difetti genetici sono causati dal fallimento di questo meccanismo. Questo avviene quando i nucleotidi posti all'estremità degli introni sono talmente mutati che gli enzimi che devono rimuoverli non li riconoscono più.

Replica del DNA

È fondamentale che la replica del DNA sia perfetta. Se così non fosse, la stessa sopravvivenza dell'organismo sarebbe a rischio: anche un errore riguardante un singolo nucleotide su 100.000 (0,001%) potrebbe essere letale. Le modifiche nel DNA sono relativamente frequenti, ma la maggior parte di esse sono neutre, mentre una piccolissima percentuale sono deleterie o utili. La replica del DNA è semiconservativa. In sostanza, ogni doppia elica è formata da una catena derivata dal DNA originario e da una catena di nuova sintesi. Il meccanismo presuppone quindi che la formazione del nuovo DNA sia preceduta dall'apertura della doppia elica, seguita dalla sintesi di 2 nuove catene.

Meccanismo di replicazione

La replica del DNA inizia in determinati punti della catena, che si aprono grazie all'attività dell'enzima elicasi. In questi punti va ad inserirsi una proteina (SSB) che impedisce alle 2 catene di riunirsi nuovamente. La DNA polimerasi è l'enzima che avvia la sintesi delle 2 nuove catene complementari.

• Può avviare la sintesi solo in direzione 5' > 3'.
• Non può avviare la sintesi senza la presenza di un primer.

Un primer (50-75 nucleotidi) è costituito da brevi sequenze nucleotidiche, il cui intervento è permesso dall'enzima RNA primasi e funziona da innesco alla reazione di sintesi continuata dalla DNA polimerasi. A fine sintesi, la rimozione della RNA polimerasi viene effettuata da un'altra DNA polimerasi I che provvede ad avviare la reazione di chiusura del punto lasciato vuoto.

Danni e riparazione del DNA

Durante la replicazione o in seguito a danni determinati da fattori esterni detti mutageni (UV, radiazioni, sostanze chimiche), il DNA può subire dei danni. Per evitare significative conseguenze alle cellule, entrano in azione una serie di meccanismi di riparazione.

• I danni alle singole catene vengono riparati agendo sui legami del gruppo metilico delle basi azotate attraverso specifici enzimi, oppure tagliando e sostituendo i nucleotidi danneggiati.

Quando il danno riguarda entrambe le catene esistono due meccanismi:

• La riparazione per ricombinazione consiste nel "superamento" del tratto di DNA danneggiato, utilizzando un meccanismo simile a quello del crossing-over.
• Con la riparazione non omologa vengono riunite le due estremità in cui si è verificata la frattura senza la sintesi della parte mancante. Quindi può esserci una perdita di sequenza e avere una mutazione.

Mutazioni

Se la riparazione non avviene con successo si ha una mutazione. Queste possono verificarsi sia in un esone che in un introne. Se la mutazione avviene in un introne o in una zona non codificante, essa è silente o sinonima, cioè non ha effetti concreti sulla vita dell'organismo. Se invece è interessato un esone, si possono avere conseguenze dirette sulla proteina e quindi sull'individuo, che verrà chiamato mutante. Le mutazioni sono alla base della variabilità genetica e quindi dei processi evolutivi. Esse infatti permettono l'affermazione di genotipi favorevoli a scapito di quelli meno utili, che col tempo quindi diverranno sempre meno frequenti nelle popolazioni.

Tipi di mutazioni

Le mutazioni spontanee si verificano senza l'intervento di agenti mutageni noti. Esse sono causate da fattori chimici endogeni o da alterazioni genetiche.

Deaminazione e depurinazione

La deaminazione è una reazione attraverso cui una base azotata viene trasformata in una diversa. La più comune è la deaminazione della citosina che porta alla formazione dell'uracile con rilascio di uno ione ammonio. Gli enzimi della famiglia delle glicosidasi sono preposti al riconoscimento e alla riparazione dell'errore. Talvolta però questo meccanismo non interviene e la mutazione rimane costituzionale.

La depurinazione consiste nella perdita di una base azotata purinica (adenina o guanina) per la rottura del legame glicosidico (legame base azotata-zucchero) e sostituito da un gruppo ossidrilico (-OH). La mancata riparazione si riflette in un blocco della successiva replicazione del DNA.

I danni ossidativi sono causati da molecole di ossigeno che attaccano e danneggiano le basi azotate del DNA. Infine vi sono i danni che derivano da errori che si verificano durante le fasi di replicazione, ricombinazione e riparazione del DNA.

Mutazioni indotte

Le mutazioni indotte sono causate da agenti fisici o chimici detti agenti mutageni. I danni possono manifestarsi attraverso la sostituzione delle basi con molecole di struttura analoga a quelle presenti nel DNA, ma che formano appaiamenti diversi e quindi errati. Un altro tipo di mutazioni sono quelle in cui si determinano rotture dei legami tra le basi azotate, inserzioni (aggiunta) e delezioni (sottrazioni) di basi azotate. I mutageni fisici sono soprattutto radiazioni ionizzanti (raggi X e gamma) e non ionizzanti (raggi UV), mentre quelli chimici possono essere di natura variabilissima.

Mutazione puntiforme

Una mutazione puntiforme riguarda la variazione di una sequenza di DNA che interessa da 1 a 50 nucleotidi. La maggior parte delle mutazioni puntiformi sono senza effetto. Vi sono 5 tipi di mutazioni puntiformi:

• Silenti
• Missenso
• Delezioni o inserzioni in frame
• Inserzioni nonsenso
• Mutazioni frame-shift o mutazioni di splicing

Transizione  Sostituzione A con G (basi puriniche) e viceversa, T con C (basi pirimidiniche) e viceversa; Trasversione  Sostituzione A/G con T/C e viceversa.

1. Le sostituzioni silenti riguardano normalmente il terzo nucleotide del codone e non alterano l'aminoacido.
2. Se in una sequenza di DNA la sostituzione di una base azotata causa l'alterazione di un aminoacido si parla di mutazioni missenso.
3. Le mutazioni nonsenso si verificano quando la mutazione riguardante un nucleotide di una tripletta causa la modifica in un codone di stop.
4. Le delezioni e le inserzioni in frame causano rispettivamente l'eliminazione di una tripletta o di un numero di nucleotidi divisibili per 3, oppure l'inserzione di una tripletta o di un numero di nucleotidi divisibili per 3. Come conseguenza si può avere l'eliminazione o l'aggiunta di amminoacidi nella proteina codificata.
5. Le mutazioni frame-shift sono dovute a delezione o inserzioni di un numero di nucleotidi non divisibile per 3. Questo comporta lo spostamento della cornice di lettura a valle della mutazione e quindi la codifica di una sequenza di amminoacidi non corrispondente a quella del trascritto originario.
6. La mutazione all'indietro (back mutation) si verifica quando la mutazione è seguita da un'altra che riporta allo stato originario.
7. La regressione si ha quando vi è il ritorno all'originale condizione, attraverso una seconda variazione che non riguarda i geni originari. La soppressione consiste nel neutralizzare l'effetto di una mutazione attraverso un'altra mutazione all'interno dello stesso gene.

Sequenziamento del genoma

Come si sequenzia il genoma? Il metodo tradizionale è quello messo a punto nel 1975 da Sanger. Il principale limite è la ridotta lunghezza di DNA che può essere ottenuta con un ciclo di sequenziamento. I frammenti ottenuti (100-300 Kb) vanno ordinati seguendo vari metodi di mappatura fisica, fino a ottenere la ricostruzione dell'intero cromosoma. Un punto fondamentale è la corretta scelta dei vettori plasmidici di clonazione del DNA che vengono inseriti nei frammenti del DNA e che servono a riconoscere i frammenti stessi.

Next-Generation Sequencing (NGS)

Il precedente metodo è in corso di sostituzione dalla tecnica Next-Generation Sequencing (NGS), basata principalmente sulle piattaforme di sequenziamento 454 Roche, Solexa Illumina e Solid A&B. Questa tecnica, che consente di sequenziare moltissimi frammenti di DNA in parallelo, è molto performante, veloce, economica e permette di ottenere una elevatissima quantità di dati. Attualmente, il maggior problema è la disponibilità di software adeguati alla gestione dei dati e la capacità di utilizzarli!

Confronto tra i genomi degli insetti

Dal confronto dei genomi dei vari insetti si possono acquisire importanti informazioni, come l'individuazione e la classificazione delle funzioni dei geni. Inoltre, possono essere individuati i geni strutturali comuni a tutte le specie (ad esempio, A. pisum condivide dal 30 al 53% dei geni) e quelli specifici, ovvero preposti alla sintesi di proteine dalla quale derivano le peculiarità della specie.

Applicazioni in entomologia

In Entomologia, la conoscenza dell'intero genoma permetterà di aumentare le conoscenze sui meccanismi biochimici, sui processi biologici ed evolutivi degli insetti. Questo si rifletterà sugli aspetti applicativi che consentirà un maggiore precisione delle strategie di controllo degli insetti dannosi.

Paradosso del valore C

Per molto tempo si è pensato che la dimensioni dell'intero genoma corrispondesse (era direttamente proporzionale) al numero di geni presenti. Di conseguenza, più era complesso l'organismo, maggiore era il numero di geni. Tuttavia, gli studi genomici hanno evidenziato che, ad esempio, i protozoi hanno un genoma molto più grande rispetto ai mammiferi. Thomas (1972) formulò la teoria del "paradosso del valore c" in cui si dimostrava che molti organismi viventi hanno più DNA di quanto necessario per vivere, ossia non vi è diretta relazione tra le dimensioni del genoma e l'evoluzione dell'organismo. Sembra che la quantità di DNA presente negli organismi sia maggiore di quella che sarebbe necessaria per costruirli: gran parte del DNA non viene mai tradotta in proteine. Dal punto di vista dell'organismo sembra un paradosso. Se le scopo del DNA è quello di controllare la costruzione di un corpo, è sorprendente scoprire una grande quantità di DNA che non fa nulla del genere (Dawkins, 1976).

Funzioni del DNA

I dati sperimentali mostrano che, in media, il 62% del DNA è costituito da regioni intergeniche, la cui funzione è, apparentemente, solo quella di separare i vari geni l'un l'altro.

Pseudogeni

Il paradosso del valore C è dovuto al fatto che i genomi contengono numerose sequenze ripetute non codificanti chiamate pseudogeni (trash DNA o junk DNA), ovvero materiale genetico privo di funzione. Non è stata ancora trovata una risposta sul perché le dimensioni del genoma sono così variabili tra i diversi gruppi di viventi. Le ipotesi sono:

• Presenza di cromosomi in sovrannumero (es. cromosomi B)
• Presenza di duplicazioni popolazioni-specifiche
• Amplificazioni popolazione-specifiche di retrotrasposoni (I retrotrasposoni sono frammenti di DNA che si autotrascrivono in intermedi del DNA, si replicano e si spostano in varie posizioni del genoma. Quando un retrotrasposone si sposta in una nuova posizione, rimane sempre una copia nel punto originario).
• Presenza di popolazioni poliploidi.

Gli pseudogeni sono geni la cui sequenza originaria è stata leggermente alterata facendo perdere la funzionalità originaria, per cui non possono essere tradotti in proteine. Quando vennero scoperti, si credeva che gli pseudogeni, ancestralmente, fossero dei geni che avevano perso la capacità di espressione a causa di mutazioni genetiche nonsenso, che poi si sono stabilizzate nelle popolazioni con l'evoluzione (per questo vengono anche chiamati "spazzatura dell'evoluzione"). Recentissimi studi hanno tuttavia dimostrato che l'assenza di uno pseudogene può impedire l'espressione del suo gene attivo, causando la morte degli individui usati sperimentalmente.

Tipi di pseudogeni

Gli pseudogeni possono essere di tre tipi:

1. Processati (o retrotrasposti)  Sono comuni negli organismi superiori (es. mammiferi), e avviene quando una porzione di RNA messaggero un gene viene retrotrascritto spontaneamente in DNA e reinserito nel DNA cromosomico. La non funzionalità è dovuta alla perdita del promotore (tratto di DNA che innesca la duplicazione), nonché la rimozione della porzione 5' terminale.