Appunti bioprocessi

Bioprocessi: Lezione 1

Origini antiche della biotecnologia

Processi fermentativi di cibi e bevande

• 6000 a.C. i Sumeri e Babilonesi producevano birra
• 4000 a.C. Gli Egiziani producevano pane lievitato.
• Il vino era già conosciuto nei paesi del Vicino Oriente.
• Diverse specie di ‘muffe’ venivano usate per produrre formaggio.

Produzione biotecnologica di farmaci

Negli anni ’40, furono introdotte tecnologie per la coltura massiva di organismi microbici in condizioni sterili per la produzione di antibiotici (es. penicillina), vaccini, enzimi, ecc.

Produzione biotecnologica di pesticidi

Produzione su larga scala del Bacillus thuringensis come insetticida contro la piralide del mais.

Produzione di dolcificanti mediante l'impiego di enzimi

Negli anni ’60 con l’introduzione dell’amilasi per scindere l’amido in unità di glucosio, l’industria dell’amido ha iniziato molto presto ad impiegare enzimi in quanto speciali tipi di dolcificanti (principalmente sciroppi di glucosio e fruttosio) non potevano essere ottenuti con le tradizionali reazioni chimiche.

• Riduce i costi di produzione.
• Permette di condurre una reazione con un’alta resa.
• Permette di ottenere prodotti altamente puri e facilmente cristallizzabili.

Sciroppi e amido modificato trovano impiego in una vasta gamma di prodotti alimentari quali bevande, dolci, prodotti da forno, gelati, salse, alimenti per neonati, conserve di frutta, ecc.

Che cosa sono le biotecnologie?

Le biotecnologie sono tutte quelle tecnologie che usano organismi viventi, o parti di essi allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili all'uomo, di migliorare piante ed animali o sviluppare microrganismi utili per usi specifici. Le aree applicative sono molteplici e vanno dall’agricoltura, all’industria alimentare, alla sanità, alla protezione ambientale, alla produzione di energia.

Tipi di biotecnologie

• Biotecnologie tradizionali
• Biotecnologie innovative

Biotecnologie tradizionali

Sono tecnologie produttive utilizzate da millenni, quali l'agricoltura, la zootecnica e lo sfruttamento delle attività fermentative dei microrganismi; permettono incroci solo tra patrimoni genetici molto simili perché si passa attraverso l’incrocio sessuale; risultati, ottenuti in tempi lunghi, sono incerti.

Alimenti tradizionali prodotti mediante l'uso delle biotecnologie

• Bevande alcoliche: birra, vino
• Formaggi
• Pane
• Aceto
• Yogurt
• Frutta e verdure trasformate: sottaceti, salsa di soia, crauti
• Sottoprodotti di fermentazione: enzimi, aromi, additivi
• Integratori alimentari: aminoacidi, vitamine

Biotecnologie innovative

Grazie alle scoperte della microbiologia e della genetica si è giunti a manipolare il materiale genetico; le tecniche di ingegneria genetica hanno fatto cadere ogni barriera e promosso lo scambio di specie molto diverse. Le innovazioni in questo settore possono essere impiegate anche per i processi tradizionali come quelli per la produzione di vino, birra, pane ed altri prodotti in cui è possibile utilizzare ceppi di microrganismi geneticamente modificati.

Biotecnologie innovative per...

Produzione del pane: Sono stati sviluppati ceppi perfezionati di lievito che contengono i geni di altri enzimi, quali l'amilasi, che forniscono un impasto più ricco.

Produzione di succhi di frutta: La resa del succo ottenuto dalle mele può essere migliorata grazie all'aggiunta dell’enzima pectinasi. Questo enzima viene prodotto naturalmente da un ceppo di muffa Aspergillus. La velocità con la quale vengono prodotti gli enzimi può essere aumentata trasferendo il gene della pectinasi da un ceppo di muffa ad un secondo ceppo con una più elevata capacità di produzione enzimatica.

Bioprocessi non tradizionali

Con microrganismi:

• Si producono metaboliti primari essenziali come: acido acetico, acido lattico, glicerolo, acetone, alcol butilico, acidi organici, amminoacidi, vitamine e polisaccaridi;
• Si producono metaboliti secondari quali: penicillina, streptomicina, cefalosporine, gibberelline ecc.;
• Si producono enzimi esocellulari come: le amilasi, le pectinasi e le proteasi;
• Si producono enzimi endocellulari come: l'invertasi, ecc.

Con cellule vegetali: Si producono aromi alimentari, profumi, sostanze farmacologiche ecc.

Con cellule di mammifero:

• Si ottengono anticorpi e vaccini;
• Si ottengono particolari proteine come gli interferoni.

Colori delle biotecnologie

Le biotecnologie, per l'ampiezza dei settori in cui possono avere ricadute, sono distinte, in base al loro campo di applicazione, in:

• White Biotechnologies
• Green Biotechnologies
• Red Biotechnologies

White biotechnologies

È la branca che si occupa dei processi biotecnologici di interesse industriale. Ad esempio, la costruzione di microrganismi in grado di produrre sostanze chimiche ed enzimi. Hanno un potenziale di applicazione particolarmente ampio, per una varietà di comparti industriali, quali quello chimico, farmaceutico, agro-alimentare, tessile, energetico, ecc.

• Microrganismi, enzimi, biocatalizzatori sono le basi per la conversione di biomasse (zuccheri, oli vegetali e in generale prodotti rinnovabili derivati dall'agricoltura) in una vasta gamma di sostanze utili, fra cui prodotti chimici, biocarburanti per la produzione d'energia.
• Nel settore tessile, sono impiegati enzimi per rimuovere le incollature a base d'amido;
• Nel settore della carta possono essere utilizzati funghi per rimuovere la lignina dalla cellulosa nella sospensione della pasta legno, in alternativa ai processi chimici altamente inquinanti ed energeticamente dispendiosi.

In termini di prestazioni, le biotecnologie industriali forniscono prodotti finiti più puri e con tassi di resa superiori ai processi tradizionali, a fronte di un ridotto consumo energetico e di una minore produzione di rifiuti chimici.

Green biotechnologies

È il settore applicato ai processi agricoli. Tra le applicazioni, figura la modificazione di organismi per renderli in grado di crescere in determinate condizioni ambientali o nutrizionali. Lo scopo di questo settore è quello di produrre soluzioni agricole aventi un impatto ambientale minore rispetto ai processi agricoli classici.

Red biotechnologies

È il settore applicato ai processi biomedici e farmaceutici. Alcuni esempi sono l'individuazione di organismi in grado di sintetizzare farmaci o antibiotici, oppure lo sviluppo di tecnologie di ingegneria genetica per la cura di patologie. Altri “colori” per etichettare settori in cui si utilizzano le biotecnologie sono:

• Il blu, per le tecniche che coinvolgono organismi acquatici;
• Il grigio, per le applicazioni di tipo ambientale (come la salvaguardia della biodiversità e la rimozione di inquinanti);
• Il giallo, che comprende le tecnologie computazionali e logiche che studiano le connessioni interne a una cellula.

Riepilogo delle biotecnologie

Le biotecnologie possono essere intese come qualsiasi processo produttivo che prevede l’utilizzo di agenti biologici, microrganismi o prodotti del loro metabolismo. Le biotecnologie più moderne migliorano i processi dell’industria alimentare, incrementando le rese, la qualità, creando innovazione, diversificando i possibili prodotti e proponendone di nuovi. I mezzi utilizzati per raggiungere tutto ciò sono le cellule e loro parti o frazioni, incluse le proteine e in particolar modo gli enzimi, che rappresentano i veri protagonisti nelle trasformazioni degli alimenti.

L’azione metabolica delle cellule e quella catalitica degli enzimi producono o migliorano le proprietà sensoriali, l’aspetto e la conservabilità del prodotto. I microrganismi (MO) sono dei veri e propri “mini-operai”; la loro aggiunta diretta permette di sfruttare il metabolismo cellulare alla base di molti processi fermentativi di grande importanza economica.

I microrganismi nel processo produttivo

Come fonte primaria per un utilizzo direttocome fonte secondaria per l’estrazione di proteine e altri prodotti utilicondizione necessaria è la specificità; in caso contrario si avrebbero effetti negativi e incontrollabili e le caratteristiche richieste dal prodotto non verrebbero raggiunte e i contaminanti presenti potrebbero risultare dannosi per il consumatore.

I prodotti ottenibili su larga scala da MO, appartenenti a generi e specie differenti, possono essere:

• MO per uso alimentare: Starter per fermentazioni degli alimenti, la classe di prodotti più “semplici” da ottenere, derivano dalle reazioni cataboliche e anaboliche.
• Metaboliti:
  • Metaboliti primari: Essenziali per la vita e la riproduzione della cellula, derivano dalle reazioni del metabolismo primario, sono una classe di prodotti abbastanza eterogenea che comprendono: Metaboliti finali del metabolismo anaerobio, es. ac. lattico; Intermedi del metabolismo aerobio, es. ac. citrico. Generalmente sono accumulati durante la fase di crescita microbica.
  • Metaboliti secondari: Derivano dalle reazioni del metabolismo biosintetico secondario e sono in genere accumulati durante la fase stazionaria dello sviluppo microbico.
• Enzimi: Sono una classe di costituenti molto importante. Il numero e la diversità degli enzimi ottenibili da un processo fermentativo dipendono dal numero e dall’eterogeneità dei MO.
• Prodotti complessi: Comprendono molti prodotti del settore alimentare (coloranti, aromi, vitamine, etc.), in questo caso l’azione dei MO produce delle rilevanti modificazioni del substrato di partenza, comprensivo in qualche caso anche dei MO stessi (es. yogurt).
• Prodotti di biotrasformazione: Derivano dalla trasformazione di alcune sostanze per via microbica (es. glicosilazione).

Curva di crescita microbica

(vedere grafico slide 1 pag. 23) Lo sviluppo microbico in funzione del tempo ci dà la curva di crescita, divisa in diverse fasi:

• Latenza (Lag phase): [MO]=cost., fase di adeguamento metabolico, il MO sintetizza nuovi componenti, es. ATP, ribosomi, cofattori;
• Crescita esponenziale (Log): aumento esponenziale del numero di cellule e il corrispondente aumento della biomassa;
• Intermedia: in cui la velocità di crescita esponenziale decrementa gradualmente. Si può considerare parte della fase Log e parte di quella stazionaria;
• Stazionaria: [MO] = cost. e velocità di crescita = 0 (la crescita si interrompe). Le sostanze nutritive sono state consumate e le cellule non possono più alimentare il proprio metabolismo;
• Decadimento o morte: progressiva morte del MO e la corrispondente diminuzione del numero di cellule a causa dei fenomeni di lisi delle cellule stesse.

Fattori da cui dipende la fase di latenza

• Questa fase è breve:
  • È impiegata un’alta percentuale di inoculo;
  • L’inoculo viene effettuato con una coltura in fase logaritmica.
• Questa fase è prolungata:
  • È impiegata una bassa percentuale di inoculo;
  • La coltura impiegata come inoculo è in fase stazionaria per esaurimento dei nutrimenti; in tal caso occorre una fase di adattamento.

La velocità con la quale una coltura microbica aumenta il proprio numero di cellule varia in relazione al tipo di MO considerato:

• I batteri possono raddoppiare il numero delle proprie cellule nell’arco di 20-60 min;
• Per lieviti, muffe e funghi che presentano una maggiore complessità strutturale, il tempo di duplicazione è di diverse ore.

Nella pratica, per una coltura microbica, in un processo produttivo, deve essere evitato il raggiungimento della fase di decadimento, dato che spesso le cellule stesse sono il prodotto richiesto, e devono rimanere integre e vitali. La massa cellulare deve essere raccolta non oltre la fase stazionaria; spesso la fermentazione è interrotta al termine della fase esponenziale.

Il mezzo o terreno di coltura

Per la produzione di biomassa, enzimi o metaboliti secondari, deve contenere tutte le sostanze nutritive richieste per permettere l’avvio di una crescita esponenziale della coltura: fonte di C, fonte di N, sali minerali, microelementi (zinco, molibdeno, manganese, ecc.), vitamine.

Le necessità nutrizionali dei vari MO sono diverse, in quanto in natura esistono differenze significative nei meccanismi relativi alla produzione di energia richiesta per le attività metaboliche. La maggior parte dei MO ottiene energia dal substrato nutritivo. Nella formulazione del terreno è essenziale come componente nutritivo l’ossigeno.

Gruppi di metabolismo e esigenze di ossigeno

Terreni di coltura

Si dividono in:

• Sintetici: Costituiti da materie prime chimicamente pure, impiegati generalmente a livello di laboratorio. Sono di più facile standardizzazione qualitativa e quantitativa, in genere forniscono crescita microbica e produzione di metaboliti limitate. Non economici. Buona riproducibilità del processo. Riformulazione sempre possibile.
• Complessi: Contengono materie prime, spesso in forma grezza, quali farine di origine vegetale o animale, idrolizzati di sostanze polimeriche e sottoprodotti di processi estrattivi, come acqua di macerazione del mais (corn steep) e melasso. Gli ingredienti in forma grezza possono richiedere pretrattamenti quali idrolisi (amido, cellulosa, ecc.), chiarificazione (corn steep). Presentano il vantaggio di essere più economici. Limitata standardizzazione qualitativa e quantitativa dei loro componenti.

Fattori da considerare nella messa a punto di un terreno colturale per un processo industriale

• Massima resa di conversione Prodotto/Substrato
• Massima resa di fermentazione (g/L)
• Massima velocità di formazione del prodotto
• Minima formazione di prodotti secondari indesiderati
• Rifornimento costante nel tempo delle materie prime
• Standardizzazione delle materie prime
• Inconvenienti tecnologici legati alle materie prime (aerazione), agitazione (schiuma), estrazione e purificazione del prodotto, ecc.
• Costi

Esempi di applicazioni

• Per la produzione di glicogeno, occorre che il MO si trovi in presenza di un eccesso di fonti energetiche, come il glucosio;
• Alte rese di RNA possono essere ottenute quando il MO viene fatto crescere alla massima velocità e in presenza di un eccesso di fosfato inorganico;
• Corynebacterium glutamicum produce alti livelli di acido glutammico in condizioni di deficienza di biotina;
• Aspergillus niger per produrre elevate quantità di acido citrico deve essere posto in carenza di ferro.

La costruzione della curva di crescita di un MO, in rapporto a diversi fattori quali substrato, temperatura e pH, è la base dello studio della cinetica delle produzioni microbiologiche, in particolare quando la finalità del processo sia la produzione di biomassa. Quando lo scopo del processo è l’ottenimento di prodotti del metabolismo cellulare, sarà necessario conoscere, oltre alla curva di crescita, quella relativa alla formazione del prodotto. In ogni caso è di fondamentale importanza conoscere l’andamento del consumo di substrato.

Andamento dei parametri

Crescita, formazione di prodotto (P) e consumo di substrato (S) consentono di classificare il processo dal punto di vista cinetico. Valutati come velocità specifica.

Classificazione delle fermentazioni microbiche secondo Gaden (1955)

Tipi di coltura

Nella messa a punto di un processo microbiologico bisogna considerare diversi fattori che indirizzano la scelta del tipo di coltura.