Biologia Molecolare - Appunti

REGOLAZIONE FATTORI TRASCRIZIONALI

Le modalità di controllo degli attivatori:

• Trascrivere o meno come nei geni omeotici -> regolazione on/off (la proteina/fattore trascrizionale c'è o no)
• Espressione tessuto specifica o inducibile di fattori di trascrizione costitutivamente attivi
• Attivazione post-traduzionale di fattori inattivi (es. tramite fosforilazione).
• Regolazione della localizzazione cellulare (es. sequestramento nel citoplasma del recettore nucleare, solo nel nucleo lega la sua sequenza). Ad esempio NF-kB rimane segregata nel citoplasma, legata a un inibitore, in seguito a una cascata di segnali può modificarsi e andare nel nucleo dove lega i geni target.
• Attivazione per modifica dell'eterodimero: myoD esiste in due versioni: eterodimero che non lega il DNA e un altro in cui c'è uno scambio di partner in cui diventa competente per legare la sequenza target.
• Attivazione mediata da ligando (es. ormoni steroidei)

• Competizione per il sito di legame (dipende chi si lega per primo, per ingombro sterico non si legano entrambi) o dominante negativo.
• Inibizione sterica (sito di legame di

attivatore e repressore sono così vicini che il dominio di attivazione non riesce a contattare il complesso di trascrizione per l'ingombro del repressore)

Il repressore interagisce con l'apparato trascrizionale inibendo l'inizio della trascrizione

Repressione mediante reclutamento di un modificatore degli istoni (p.es. HDA) -> hanno effetti sulla struttura della cromatina che porta al silenziamento del gene.

Inizialmente ci si limitava a caratterizzare linearmente le sequenze dei promotori col complesso basale di trascrizione. Ma esistono sequenze in grado di attivare il promotore e sono stati caratterizzati i fattori che si legano. Solo che le sequenze possono essere molto distanti perciò si è elaborato un modello che prevede un'ansa nel DNA che consente l'interazione tra complesso basale e attivatore. Tempo fa si vide che gli attivatori trascrizionali non agiscono direttamente sul complesso basale, ma interagiscono con delle proteine

Il complesso del mediatore è composto da circa 20 subunità che sono divise in moduli. È altamente conservato evolutivamente. Si riconosce una coda, una parte centrale e una testa. La struttura deve fare dei contatti specifici con RNA polimerasi II e altri con gli attivatori. Solo di poche subunità si conosce la funzione esatta, troviamo quelle che fanno parte dell'istone acetilasi. Quando le code istoniche sono acetilate, il contatto con il DNA e nucleosomi vicini sono ridotti, quindi una acetilazione degli istoni favorisce l'apertura della cromatina. Quindi le regioni di istone acetilasi del mediatore servono a mantenere la regione del promotore e nucleosomi in uno stato iperacetilato così da essere accessibile. Il mediatore è composto da una struttura core mantenuta e poi altre subunità presenti solo su alcuni geni, funzionali per i legami con alcuni fattori trascrizionali. Gli attivatori della

trascrizionefacilitano il reclutamento della RNA Pol al promotore e ne stabilizzano il legame. Gli attivatorireclutano I complessi modificatori e rimodellatori dei nucleosomi. Spesso l'interazione avviene conil complesso del mediatore, associato con il CTD della subunità maggiore della Pol II.Il mediatore si lega all'RNA pol II e ai fattori di trascrizione (attivatori o repressori) e "media" isegnali regolatori a pol II. RNA pol II da sola senza attivatore e mediatore, da un basso livello ditrascrizione, la trascrizione basale. Se metto un po' di attivatore c'è un aumento leggero. Se mettosolo il mediatore vedo che non c'è aumento della trascrizione. invece se c'è una quantità fissadiattivatore e una crescente di mediatore otteniamo un aumento drammatico e concentrazionedipendente di trascrizione.Esistono geni che regolano sequenze a distanze molto ampie. La formazione di contatti a lungoraggio tra

La sequenza di DNA è facilitata da proteine architettoniche. Le proteine architettoniche aumentano la frequenza di contatto tra gli elementi regolatori formando interazioni proteina-proteina stabili tra di loro. Il cluster delle globine ad esempio è regolato anche (oltre che dagli enhancer distanti) da regioni di controllo LCR. LCR sono un gruppo di elementi regolativi posizionato 30-50 kb a monte dell'intero set di geni della globina. Lega un set di proteine che provocano l'apertura della cromatina attorno ai geni della globina. È costituito da elementi di sequenza multipli (enhancer, insulators, promotori). Ciascun gene possiede siti regolativi specifici, ad esempio il gene della b-globina ha 2 enhancer, uno a monte e uno a valle del promotore. Si parla di controllo a distanza della trascrizione che può essere di attivazione e repressione. I silencer si crede siano in grado di creare blocchi steriche che non permettono il funzionamento dell'enhancer. Sono sequenze isolatore.

Ci fa individuare complessi proteici sul DNA. Inizia con un trattamento di formaldeide che forma legame covalenti con le proteine e DNA, dopodei lavaggi le cellule vengono rotte e si estrare il DNA con le proteine legate. Si ha un’ulterioreframmentazione con sonicazione o digestione enzimatica così i frammenti sono più piccoli peressere poi usati col sequenziamento o PCR. I frammenti sono incubati con l’anticorpo direttocontro la proteina target o la modificazione degli istoni. L’anticorpo si lega poi a una matrice solidaquindi possiamo poi immunoprecipitare i frammenti di DNA con i complessi assocciati. Possiamopoi analizzare i frammenti staccando le proteine per PCR, miRNA e sequenziamento o con westernblotting o spettrometria di massa.

REGOLAZIONE DELLA STRUTTURA DELLA CROMATINA: il DNA si arrotola sull’istone a formare strutture più complesse come il solenoide della fibra 30nm. La maggior parte delle transizioni tra le strutture di

cromatina è determinata dalle modificazioni delle code degli istoni. H2A e H2B formano un eterodimero, mentre H3 e H4 dei tetrameri che si associano a formare l'ottamero istonico. Al centro abbiamo diversi ripiegamenti che formano alfa-eliche, dalla struttura core emergono le code ammino-terminali non strutturate degli istoni. Sulle code sono posti degli amminoacidi specifici che vanno incontro a modificazioni post-traduzionali. Le code contattano sia il DNA che i nucleosomi adiacenti quindi regolano l'impaccamento della fibra cromatinica. È verosimile che queste modificazioni influenzino la capacità di formare la fibra di 30 nm ed altre strutture nucleosomiche di ordine superiore.

Le principali modificazioni post-traduzionali sono: acetilazione, metilazione, ubiquitinazione, fosforilazione. Aggiungono dei piccoli gruppi funzionali, mentre nell'ubiquitinazione si ha la modificazione dell'ubiquitina. Tipicamente i residui target delle modificazioni sono

riconoscere la coda