Appunti completi Biologia molecolare ed applicata

DEAMMINAZIONE

È un danno idrolitico, causato dalla presenza dell’acqua. Le basi perdendo il gruppo

amminico perdono la loro capacità di attuare legami a idrogeno.

La Xantina, cioè la guanina deamminata, non forma coppie di basi, blocca la

replicazione ed è citotossica. La deamminazione della citosina genera un G-U

mismatch. La U è facile da riconoscere (non fa parte del DNA).

ALCHILAZIONE

L’alchilazione avviene per effetto di agenti alchilanti come: etilmetansulfonato e

nitrosoguanidina. O6-etilguanina (cioè guanina con aggiunta di gruppo alchilico) si

accoppia in modo sbagliato con T.

AGENTI INTERCALANTI: essi sono utilizzati per rendere visibile il DNA che assorbe

nell’UV a 360nm. Tuttavia, innestandosi nella doppia elica, possono distorcerla e

causare gravi danni. Esempio: PROFLAVINA.

SISTEMI DI RIPARAZIONE

Le alterazioni del DNA possono avere due conseguenze:

i) IMPEDIMENTO ALLA REPLICAZIONE O ALLA TRASCRIZIONE (dimeri di timina,

nick, rotture dello scheletro del DNA);

ii) appaiamenti errati che sarebbero fissati nei successivi cicli di replicazione. È

quindi fondamentale l’intervento di sistemi di riparo che identifichino e

riparino il danno, prima che questo SI PROPAGHI NELLE REPLICAZIONI

SUCCESSIVE.

TIPOLOGIE DI RIPARO

RIPARAZIONE DIRETTA

L’enzima che compie tale riparo è la DNA FOTOLIASI attivato dall’illuminazione. È un

enzima apposito per la riparazione dei DIMERI DI TIMINA: c’è un grande

investimento nelle proteine di riparazione poiché il codice genetico va preservato

a tutti i costi. Come agisce?

Il dimero di Timina viene ribaltato dentro una cavità dell’enzima vicina al suo sito

attivo che contiene un donatore di elettroni, il quale fornisce gli ELETTRONI NECESSARI

PER ROMPERE I LEGAMI. L’energia per la reazione è fornita dalla LUCE. Ciò è

consentito da uno dei due cofattori dell’enzima: FADH. Esso, eccitato, sottrae un

protone al dimero e vengono così ripristinate le due timine separate.

Un altro enzima che si occupa di riparazione diretta è

l’ALCHILGUANINATRANSFERASI. La sua azione consiste nella reazione chimica in

cui il gruppo alchilico viene trasferito dalla guanina ad un residuo di cisteina

dell’enzima. La proteina possiede una cavità nella quale si inserisce la base alchilata.

Si tratta di un ENZIMA SUICIDA: dopo aver acquisito il gruppo alchilico, non potrà più

essere funzionante. Esistono TRANSFERASI specifiche per la BASE e per il tipo di

ALCHILAZIONE.

RIPARAZIONE PER ESCISSIONE DI BASI – BER

Tali riparazioni sfruttano la capacità delle basi azotate di ruotare attorno al legame N-

glicosidico. L’ enzima che compie tale riparazione è la GLICOLIASI. Esso lega il DNA e

ruota le basi nel suo sito attivo. La base danneggiata viene riconosciuta dalla

glicosidasi in quanto protrude fuori dalla doppia elica. Se la base è DANNEGGIATA,

l’enzima idrolizza il legame e RIMUOVE LA BASE. Si crea così un SITO ABASICO. Verrà

successivamente inserita la base corretta. Ogni enzima è SPECIFICO per la base e per

il tipo di ERRORE esempio: OSSOGUANINA.

Cosa succede se una base ossidata NON viene riconosciuta?

Di fronte l’ossoguanina verrà aggiunta un’ADENINA, più affine della citosina. Esiste un

controllo di sicurezza per tale adenina, che sarà sostituita con una CITOSINA. Tuttavia,

la guanina resta ossidata e sarà riparata solo in seguito.

RIPARAZIONE PER ESCISSIONE DI NUCLEOTIDI – NER

La distorsione nella catena, prodotta dalla lesione, induce la RIMOZIONE DI UN CORTO

SEGMENTO A SINGOLO FILAMENTO che include la lesione. Tale attività in E. coli

dipende dall’attività di 4 proteine (UvrA-B e C-D). Sono sistemi che agiscono sui danni

causati da UV.

a) A e B analizzano il DNA alla ricerca di distorsioni

b) A esce dal complesso mentre B DENATURA LOCALMENTE IL DNA INTORNO ALLA

DISTORSIONE

c) C forma un complesso con B e produce delle incisioni al 5’ e al 3’ della lesione

d) D (elicasi) allontana il singolo filamento e la DNA pol I e la ligasi riparano e sigillano

la lesione

Lo stesso sistema è capace di recuperare le molecole di RNA POLIMERASI bloccate in

seguito a lesione. La polimerasi si interrompe quando trova una lesione sul DNA ed è

capace di reclutare le proteine che rimuovono i nucleotidi. È una RIPARAZIONE

associata alla TRASCRIZIONE.

RIPARAZIONE SUL DOPPIO FILAMENTO

Se si è persa parte dell’informazione su entrambi i filamenti, non c’è uno stampo da

poter complementare. Tuttavia, è più importante riempire quel buco di nucleotidi,

seppur con BASI CASUALI, piuttosto che rendere l’intera molecola non utilizzabile. In

questi casi il sistema di riparazione delle rotture del doppio filamento - DSB, DOUBLE-

STRAND BREAK - recupera le informazioni dalla coppia di filamenti del CROMOSOMA

FRATELLO attraverso un evento di ricombinazione, oppure unisce estremità non

omologhe: NHEJ, NONHOMOLOGOUS END JOINING.

DSB

È un meccanismo attuato solo da EUCARIOTI. Si attua un innesco simil CROSSING

OVER attraverso il cromosoma fratello. Si forma infatti un CHIASMA che consentirà di

inserire le basi mancanti. In questo modo la FUNZIONE viene conservata, ma le basi

sostituite NON sono le stesse.

NHEJ

Nel punto in cui il doppio filamento si è disunito perdendo delle basi, interverrà una

proteina di LIGASI per ricongiungere le due estremità separate. Due doppie eliche

saranno congiunte; non sarà tuttavia possibile recuperare le basi perse (ciò

comporterà danni anche sul frameshift).

RIPARAZIONE DI TRANSLESIONE

Vengono prodotte appositamente delle DNA POLIMERASI capaci di rimediare ad un

danno precedente creato durante la replicazione. Tali polimerasi di translesione

intervengono dopo che il danno è stato individuato dalla polimerasi standard sul

FILAMENTO STAMPO. Si tratta di un secondo sistema di controllo. Anche se la sintesi

trans-lesione è POCO FEDELE, consente di COMPLETARE IL PROCESSO REPLICATIVO 

polimerasi di translesione aggiunge nucleotidi in maniera RANDOM al posto dell’errore

poiché NON c’è uno STAMPO.

Tuttavia, il meccanismo di tali polimerasi resta ancora incompreso poiché tali proteine

compiono frequenze di errori TROPPO BASSE per agire completamente in modalità

randomica.

2 ipotesi del meccanismo:

O la polimerasi standard si stacca per consentire la riparazione dell’errore ad

 opera della polimerasi di translesione

O la polimerasi standard SALTA l’errore continuando la replicazione (e dietro di

 lei agirà la polimerasi di translesione).

L’errore nel filamento stampo RESTA MA LA REPLICAZIONE è GARANTITA e può

proseguire.

DNA polimerasi di translesione ha BASSA SELETTIVITÀ per i NUCLEOTIDI ma la priorità

consiste nell’avere un DNA INTEGRO, seppur con un errore.

POWERPOINT 5: TRASCRIZIONE

La TRASCRIZIONE è il processo mediante il quale l’informazione della sequenza

nucleotidica viene trasferita dal DNA all’RNA.

SOLO UNA FRAZIONE MINORE del DNA presente nelle cellule viene trascritta. La

replicazione deve copiare tutto il genoma una sola volta. Parte di questi RNA è

CODIFICANTE PER PROTEINE, cioè è in grado di specificare la sequenza amminoacidica

di una data proteina. Negli EUCARIOTI, gli RNA codificanti, prima di essere tradotti,

VENGONO MODIFICATI (trascritto primario -> trascritto maturo). Altri RNA hanno

RUOLO FUNZIONALE e non sono codificanti. L’Espressione del genoma è SPECIFICA

DEL TIPO DI CELLULA e del SUO STATO.

TRASCRITTOMA = insieme dei trascritti presenti in una cellula. La trascrizione è

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MENO ACCURATA della replicazione (1mismatch ogni 10 nt, relativa ASSENZA DI

MECCANISMI DI RIPARAZIONE). Ogni errore che insorge durante la replicazione del

DNA diventa permanente nel genoma di quell’individuo e viene trasmesso alla

progenie. La trascrizione produce solo copie transienti di ciascuna regione e

DANNEGGIA SOLO UN SINGOLO TRASCRITTO tra i diversi che sono prodotti.

Più enzimi possono trascrivere lo stesso gene contemporaneamente.

Qual è il filamento CODIFICANTE?

Il filamento codificante è uguale al filamento di RNA. Il filamento stampo di DNA è

quindi complementare al reale filamento codificante.

Non stampo codificante o senso uguale all’RNA

  

Stampo non senso complementare all’RNA

  

Appositi SEGNALI sul DNA indicano alla RNA Polimerasi dove cominciare e dove finire.

RNA polimerasi è DNA DIPENDENTE.

PROMOTORE: indica il VERSO della trascrizione, cioè QUALE dei due filamenti

utilizzare. Non viene trascritto. Si trova sul DNA ed agisce sul DNA. Sono definiti

segnali VETTORIALI, DIREZIONALI. In E. coli i promotori seguono i movimenti

dell’enzima facendo sì che DNA polimerasi e RNA polimerasi non si scontrino (processi

che avvengono contemporaneamente). Per FORZA DI UN PROMOTORE s’intende il

numero di trascritti a cui esso può dare inizio in un dato tempo. La forza di un

promotore è collegata alla affinità di legame con la polimerasi ed alla capacità di

evadere dal promotore.

- Promotore FORTE: maggiore quantità di trascritti ottenuti.

- Promotore DEBOLE: centinaia o migliaia di trascritti.

TERMINATORE: indica il termine della sintesi e viene trascritto interamente. Si trova

sul DNA ma NON funziona sul DNA: assumerà la sua funzione solo dopo esser stato

trascritto in RNA.

REAZIONE GENERALE

Reazione catalizzata dalla RNA polimerasi. Dopo aver selezionato il corretto nucleotide

trifosfato, l’enzima catalizza la formazione del LEGAME FOSFODIESTERICO

utilizzando ioni Mg2+ quali cofattori. La reazione di allungamento dell’RNA in fase di

sintesi è:

(RNA)n + rNTP → (RNA)n+1 + Ppi

La reazione avviene all’interno del SITO ATTIVO dell’enzima: sarà sempre il 3’ OH ad

allungarsi poiché l’enzima ORIENTA il legame con l’OH correttamente posizionato per

l’attacco nucleofilo.

RNA polimerasi ha 2 ioni Mg2+, 1 strettamente legato, il secondo introdotto ad ogni

ciclo con il NTP.

RNA polimerasi è detto enzima a chela di granchio. La RNA Polimerasi è un enzima

“spettacolare”, infatti è in grado di svolgere le seguenti funzioni:

1. RICONOSCIMENTO della regione PROMOTRICE

2. SVOLGIMENTO della doppia elica del DNA

3. RNA PRIMING

4. RNA Polimerizzazione

5. Riconoscimento del TERMINATORE

Si muove srotolando l’elica del DNA (ELICASI + TOPOISOMERASI). Non necessita di un

primer ma l’inizio av