Appunti biologia molecolare

Metodi di marcatura

Radioattivi: con i radioisotopi (fosforo, zolfo, trizio) che emettono radiazioni beta, adatte per impressionare la lastra autoradiografica. L'isotopo del fosforo sono i più usati e si ottengono usando dei substrati marcati sul fosfato alfa, beta o gamma. Lo scopo è ottenere un pezzo di DNA con un'alta attività specifica: attività di un isotopo radioattivo rispetto all'unità di massa o di volume del frammento.

Esempi di preparazione di sonde (sono in un crescendo di efficacia):

Marcatura al 5' con polinucleotide kinasi. Si ottiene sostituendo il gruppo fosfato più estremo al 5', poi con una polinucleotide kinasi e l'ATP marcato nel fosfato gamma (gamma perché la polinucleotide kinasi attacca il gruppo fosfato all'estremità 5'). Se è marcato, la marcatura viene portata all'estremità.

Lezione 28 Pagina 16510 lunedì 14 marzo 2022 20:07 La polinucleotide chinasi

è un enzima che sfrutta un substrato che presenta il fosfato gammaradioattivo, può rendere radioattive le estremità della molecola. Se sono marcate solo le estremità, quando si separano i 2 filamenti, sulla piastra avremo un segnale debole. Se vogliamo aumentare il numero di isotopi radioattivi, incorporiamo un intero nucleotide radioattivo, possiamo usare la parte Klenow della DNA pol 1 e si aggiungono dei nucleotidi radioattivi. Il fosfato che deve essere incorporato deve essere il fosfato alfa, si devono formare proprio legami fosfodiesterici. Si chiama marcatura per filling in e alla fine facciamo entrare 4 nucleotidi.

Lezione 28 Pagina 16611 lunedì 14 marzo 2022 20:13

La terza tecnica di marcatura è la nicktranslation: si fa uso di tutta la DNA pol perché la DNA pol1 quando è completa ha la capacità di fare prima un nick sul DNA, poi siccome ha delle capacità di esonucleasi, comincia ad eliminare frammenti al 5' e

Vengono riempiti in modo radioattivo sempre dalla DNA pol. La prima cosa è il taglio, dopo vengono eliminati dei frammenti nella direzione verso il 3' e siccome c'è un'estremità OH disponibile, si può sostituire il pezzo eliminato con substrati radioattivi. Questa ha una grande attività specifica però ha un limite (li vediamo in figura), cioè le sonde sono a doppio filamento. Un problema è che la sonda si possa riappaiare, la cosa migliore sarebbe avere una sonda a singolo filamento e questo si può ottenere con il metodo del ribo probe (RNA sintetizzato in vitro che porta la sequenza complementare a quella che vogliamo riconoscere).

L'RNA pol dei fagi sono piccoli e sono ottimi per fare la trascrizione in vitro perché basta inserire nel plasmide questo promotore e aggiungendo nella provetta la RNA pol del fago T7, sarà possibile trascrivere.

Lezione 28 Pagina 16712 lunedì 14 marzo 2022 21:36

un tessuto) può essere creato utilizzando la trascrizione inversa. Iniziamo con il DNA, da cui viene sintetizzata la sequenza complementare. Quando creiamo una sonda a RNA, dobbiamo preparare l'antisenso, che è complementare (se sul DNA c'è TAC, sull'RNA c'è UAC). Nel plasmide, abbiamo il promotore di T7 su un lato, dove possiamo inserire il nostro frammento di DNA da cui vogliamo sintetizzare l'RNA. Utilizzando la T7 RNA polimerasi, che parte dal promotore, verrà trascritto un RNA complementare al DNA. La sonda senso non può ibridare e può essere utilizzata come controllo: partendo da un promotore di un altro fago (SP6), possiamo sintetizzare la sonda antisenso e quando andiamo a fare l'ibridazione in situ, non ci sarà ibridazione e otterremo un risultato negativo. L'antisenso (complementare a quello presente fisiologicamente in un tessuto) può essere utilizzato per studiare l'espressione genica e la localizzazione dell'RNA in un campione.

(cell) parte da SP6.a seconda di come cloniamo possiamo scegliere se partire da un'estremità o l'altra.

Lezione 28 Pagina 1681 martedì 15 marzo 2022 08:23

La solda è quel pezzo che ci permette di discriminare il DNA di nostro interesse tra i cloni. Anche la PCR. Il southern e northern permettono di analizzare il DNA (southern) o RNA (northern) o proteine (si possono fare interazioni che saranno aa-aa e si usa un'altra tecnica in cui la sonda è un anticorpo, la tecnica si chiama western).

Il nome southern deriva dal nome del ricercatore che lo ha messo a punto che capì che per effettuare l'ibridazione dopo aver fatto un gel di agarosio, era necessario fare dei trattamenti. Una sonda serve a ibridizzare direttamente il frammento e se la sonda è marcata riusciremo a riconoscere il punto in cui è avvenuta l'ibridazione. Il DNA dei mammiferi è più abbondante per cui quando viene digerito dà vita a una serie

di bande, con una sonda marcata possiamo identificare un gene di interesse. Se usiamo la sonda su un gel di agarosio lei entra e si attacca in maniera specifica, ma sporca anche tutto il gel.

Southern trova un modo di trasferire il DNA presente sul gel di agarosio su un filtro dinitrocellulosa, che ha la forma di una piastra e si può facilmente appoggiare sul gel; è necessario fare qualcosa per spingere il DNA a muoversi, uscire dall'agarosio e attaccarsi sul filtro. Una sonda radioattiva può essere a doppio filamento (dobbiamo denaturarla) oppure ribo probe (singolo filamento), come facciamo a trasferire il DNA dal gel al filtro? Per capillarità è possibile.

Si mette il gel sotto, il filtro di nitrocellulosa e sopra dei fazzolettini di carta asciutti che attireranno il liquido. Il filtro deve essere bagnato dalla parte di sotto con un tampone e nel caso del southern è bene che sia una soluzione.

Lezione 29 Pagina 1692 martedì 15 marzo 2022 08:43

La soluzione alcalina (con NaOH) è fondamentale perché vogliamo che il DNA, denaturandosi, salga per capillarità e si scontri con il filtro. Si ha un flusso verso l'alto che bagna i tovaglioli. La soluzione alcalina tende a inibire la carta, poi sale verso l'altro, il DNA si attacca sul filtro perché il liquido passa e il DNA passa, ma viene bloccato dal filtro e non va sul fazzoletto (come fa il liquido). Avremo quello che c'era sul gel, attaccato sul filtro. Il filtro viene inserito in una busta, si aggiunge la sonda marcata e dopo aver lavato bene il filtro si può asciugare ed esporre su una lastra di autoradiografia. La sonda ha individuato bande di diverso peso molecolare perché il DNA è stato tagliato con enzimi di restrizione diversi. Spesso attraverso queste tecniche è stato possibile confrontare genomi diversi: facendo digestioni, facendole correre su gel, confrontando le dimensioni dei segmenti di uomo/scimmia ad esempio vediamo che ci sono.

bande di tipo diverso, a causa dell'evoluzione. Non si può fare la stessa cosa con l'RNA perché se lo mettiamo con la soluzione alcalina come succede? L'RNA è più delicato del DNA, è molto fragile e reattivo perché ha i gruppi =H al 2' che facilmente tendono a reagire all'interno della molecolare, per cui si possono rompere i ponti fosfodiesterici tra i nucleotidi. In ambiente alcalino la presenza dei gruppo OH fa sì che si rompa a pezzi l'RNA.

Una tecnica alternativa che permette lo stesso si fare ibridazione, usa il fatto che possiamo estrarre l'RNA da un tessuto, viene caricato in un pozzetto di gel di agarosio e quando migra, quello che si vede sono il 28S e il 18S (si migra con etidio bromuro, sostanza intercalante che si intercala nell'RNA in particolare si intercala nelle doppie eliche dell'rRNA).

Lezione 29 Pagina 1703 martedì 15 marzo

2022 08:56Dobbiamo trasferire l'RNA che si è distribuito all'interno del gel e invece si usare la capillarità, si fauna migrazione che si chiama elettroblot: quello che muove il flusso dal gel al filtro è l'elettricità. La migrazione è data dalla differenza di potenziale che applichiamo dal polo - al polo +. Questa tecnica a cosa serve? Nei tessuti alcuni RNA saranno prodotti e altri no, noi possiamo verificare con una sonda specifica quale RNA e quindi quale gene viene espresso in quale tessuto. EDC cross link serve per rendere più forti i legami elettrostatici tra RNA e filtro. Esempio di analisi mediante il northern di espressione tessuto specifica (si guarda la proteina iporinae come controllo si usa la beta actina): Lezione 29 Pagina 1714 martedì 15 marzo 2022 09:02 TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI La bolla di trascrizione rimane piccola e man mano che pol avanza si richiude da dietro e si apre davanti, questo fa sì che solo un

piccolo tratto sia legato alla DNA pol. Nel procarioti, non essendoci il nucleo, la coda di RNA nascente viene subito attaccata dai ribosomi, mentre negli eucarioti il filamento neosintetizzato rimane sciolto. Si ha rimodellamento della cromatina per permettere la trascrizione (si deve rilassare). Quando avviene la trascrizione l'RNA viene prodotto e non ancora finita tra trascrizione comincia già il cupping e lo splicing; solo alla fine quando si arriva alla terminazione si aggiunge il poliA. Questo deve uscire attraverso i pori nucleari e andare nel citoplasma, dove viene tradotto.

Inizio (riconoscimento del promotore)- Allungamento (formazione del precursore RNA capping e splicing)- Terminazione (taglio e poliA)-La tappa di inizio è la più importante, dobbiamo evitare di trascrivere geni che non servono per cui ci sono meccanismi che permettono di evidenziare il fatto che in quel tessuto il gene deve essere espresso. Si ha riconoscimento del promotore, l'allungamento,

La mutazione, il taglio e l'aggiunta del poliA. Quello che deve trascrivere l'RNA è l'enzima RNA pol (ce ne sono 3 specifiche per determinati geni: la 1 trascrive gli rRNA, la 2 trascrive i geni che codificano per le proteine ma anche per RNA non codificanti, la 3 trascrive i tRNA, 1 tipo di rRNA e alcuni piccoli RNA importanti per lo splicing).

Le pol dal punto di vista catalitico fanno la stessa cosa (aggiungono un ribonucleotide nella tasca catalitica e se uno confronta la tasca della RNA pol con quella della DNA pol ci sono somiglianze: derivano da un progenitore comune, hanno la forma di mano ed è proprio una tasca in cui nel caso delle RNA pol ci entrano i ribonucleotidi. La bolla di replicazione entra nel sito catalitico e fa sì che i 2 filamenti siano divisi. Il legame fosfodiesterico avviene tra il 3' dello zucchero e il 5' fosfato dell'altro nucleotide. Ci