Appunti biologia molecolare

DANNI AL DNA

• Danni che portano a modificazioni delle basi.
• Rotture del DNA o formazione di dimeri tra basi che impediscono la replicazione o la trascrizione.

I danni che portano alla modificazione delle basi sono causati da: Idrolisi, Alchilazione e Ossidazione.

1. Idrolisi come deaminazione, coinvolge Citosina o Adenina nel gruppo amminico.
   • Quando viene perso dalla Citosina si forma un Uracile. Nel caso in cui si fissi il danno otterremo una transizione.
   • L'Adenina, quando perde il gruppo amminico, si forma una base chiamata Hypoxanthine in grado di legarsi alla Citosina e con altre basi in modo promiscuo.
   • Deaminazione della mC (5-metil-citosina) causa una transizione C-T.
2. Idrolisi dell'intera base azotata comporta una depurinazione. Il legame glicosidico è idrolizzato, provocando il distacco della base. Al C1 è legato OH al posto della base, nessun tipo di appaiamento è possibile.
3. Agenti alchilanti: nitrosammine, N-nitroso-N-metilurea (NMU),

N-metil-N-Nitroso-N’-nitroguanidine (MNNG). Causano il trasferimento di unmetile sull’Ossigeno 6della Guanina, formando O -metilguanina chedetermina la perdita di un legame H, si legherà con la Timina attraversodue legami H. Avremo una transizione da piridina a piridina.

TEST di AMES: Utilizzato per capire se una sostanza chimica induce un potenziale effetto mutageno. Sfruttando organismi con una notevole velocità di replicazione, come Salmonella mutata, la quale non sopravvive in assenzadi istidina, analizziamo il numero di colonie visibili. In un terreno che manca di istidina vedremo pochissime colonie cresciute da reversione spontanea. In contemporanea piastriamo in agar mancante di istidina e addizionato all’agentemutageno, otteniamo numerose colonie caratterizzate da unase l’agente è realmente mutageno.

reversione indotta

210 Biologia Molecolare 11/10/213 Danno ossidativo, i radicali liberi dovuti al fumo di sigaretta, inquinamento atmosferico,

infiammazioni, radiazioni ioniche, catena respiratoria nei mitocondri eluce UV generano ossidazione. La Guanina è particolarmente sensibile. Il C8 avrà al posto di H un doppio legame con O. Si forma 8-oxoguanina che si lega a C ma anche ad A formando una Trasversione, le basi saranno quasi perpendicolari.

Dimeri di Pirimidina, causata dalla luce UV che genera legami covalenti tra due Timine adiacenti. Anello di ciclobutano tra C5 e C6 degli anelli pirimidinici. Si forma un kink, distorsione dell'elica.

Dimeri di timina e rotture hanno conseguenze su replicazione e trascrizione.

RIPARAZIONE DEL DNA

Meccanismi fondamentali:

• Diretta rimozione del danno con enzimi specifici.
• Escissione di basi eliminano le basi danneggiate.
• Escissione di nucleotidi rimozione della regione danneggiata e sintesi del nuovo filamento.
• No homologus end-joining e homologus recombination, riparazione di doppi filamenti spezzati.

Riparazione diretta: ad opera

Dell'enzima fotoliasi, in presenza di luce solare, scinde i dimeri di timina. Non è presente nell'uomo ma fino ai marsupiali.

Demetilazione metiltransferasi con gruppo SH ricevono il metile sullo zolfo rimuovendolo dal DNA. Fotoriattivazione Demetilazione.

Escissione di basi: nel quale si espone verso l'esterno. Sfrutta il base flipping, il nucleotide per rimuovere la base.

8-Oxoguanina legata con la Adenina è un errore, occorre legare la Citosina. Glicosilasi sono enzimi di riparo che rompono il legame tra dello zucchero e la base azotata.

Sito catalitico della Glicosilasi ha alfa eliche, si lega al DNA e genera un base flipping verso l'enzima, in modo da tagliare direttamente la base. Il nucleotide decapitato presenta un OH libero, le Endonucleasi eliminano il nucleotide che manca della base (short patch) o una porzione maggiore (long patch) nell'uomo.

Esistono 11 tipi di DNA.

Glicosilasi ed è uno dei sistemi di riparo più utilizzati. Sono circa 20000 le lesioni corrette ogni giorno per cellula.

Escissione di nucleotidi: Excission repair in E. Coli Nei dimeri di timina si rimuove tutta la regione attorno alla E' un processo indipendente deformazione. dalla replicazione del Dna. Viene attuato da proteine specifiche che si attivano in seguito a raggi UV.

UvrA si lega alla porzione di distorsione, recluta UvrB e ATP che rompe i legami e forma una bolla attorno alla regione danneggiata fondendo l'elica. Viene reclutata UvrC Endonucleasi che fa due Nick sul filamento distorto che viene rimosso. Dna pol I e ligasi riparano il DNA copiando il filamento inferiore. Vengono rimossi 12-13 nt.

Sistema TFIIH negli eucarioti XPC (UvrA) XPA/XPD-TFIIH(UvrB) e XPF/XPG(UvrC) attuano una rimozione di 30 nt. in corrispondenza della lesione. Sono stati scoperti da malattie genetiche come lo xeroderma pigmentoso (XP) o la sindrome di cockayane (CS) nelle quali sono mutate.

queste proteine.Danni nel genoma o durante la trascrizione.

SINTESI DI DNA TRANSLESIONE

Dna polimerasi si blocca in presenza di ponti di timina e la forcareplicativa implode.

Uno scambio di polimerasi permette un "superamento" delproblema, senza risolverlo realmente. La cellula non andrà inapoptosi.

Durante lo stallo PCNA viene modificata da unaubiquitina, che si lega alle lisine. Questa etichetta comporta unaperdita dell'affinità per la polimerasi e l'acquisizione dell'affinitàpolη per la (Eta) che non è molto fedele ed inserisce nucleotidispesso errati. Appena supera la lesione enzimi specificila pol η per eliminarla.

poliubiquitinano Si riassocia quindi laε o δpolimerasi precedente, in base al filamento.

411 Biologia Molecolare 13/10/21

ROTTURE DEI FILAMENTI E MECCANISMI DI RIAPRO

Danni al Dna come rotture a singolo o doppio filamento causati da radiazioni ionizzanti, e filamentilegati covalentemente tra loro

da agenti alchilanti portano a morte cellulare o eventi di aneuploide.

Rotture a singolo filamento: rilevate dall'enzima Sono PARP, Poly ADP-ribosio polimerasi. Polimerizza delle catene di ADP-ribosio, ed effettua un'etichetta di danno riconosciuta dai sistemi di riparo del Dna. Durante la replicazione del Dna, quando si rompe un filamento, PARP rivela la rottura ma molto spesso la forca replicativa collassa e la cellula va in apoptosi. Dna polβ, Recluta XRCC1, proteina adattatrice in grado di legarsi a PARP e legare a sua volta, PCNA, ligasi e chinasi dipendenti dal Dna. attivate in seguito all'esposizione di Le proteine XRCC sono state scoperte e cellule ai raggi X. Sono portate al Dna spezzato e presentano domini proteici per enzimi necessari per riparare il danno. Sono in grado di reclutare tutto il complesso. Per riparare il danno si lega quindi PARP, rileva il danno, forma catene di ADP, si reclutano le proteine XRCC e le proteine successive.

Rottura a doppio filamento

DSB: double strand break è uno dei danni più citotossici. Le cause sono molteplici come la presenza di inibitori della topoisomerasi, radiazioni ionizzanti e agenti cross-linking. I sistemi di riparo che si attuano sono due: Homologus recombination e Non Homologus end-joining.

ESTREMITA' NON OMOLOGHE NHEJ GIUNZIONE DI

Meccanismo attuato dalle cellule eucariotiche e meno frequente in quelle procariotiche. Quando si uniscono due molecole tagliate si formano dei danni ed errori, ciò può perché l'informazione della sequenza portare a mutazioni si perde non mantenendo fedelmente la sequenza originaria. Quando il DNA è spezzato su entrambi i filamenti le elicasi Ku70 e Ku80, proteine filamentose, si avvolgono sul DNA e rilevano il danno. Richiamano la chinasi dipendente dal DNA, la DNA-PKcs che fosforila Artemide, proteina che possiede un'attività eso-endonucleasica che si attiva e taglia i filamenti fino a quando incontra regioni

di micro-omologia di 3-4 nucleotidi. Sono reclutate poi le XRCC,1Ligasi e Cernunno-XLF .Il taglio al Dna può presentarsi come Hairpin end con i due filamenti chiusi a forcina o blunt end con estremità piatte. In entrambi i casi vengono richiamati Ku70 e Ku80 seguendo la catena di fosforilazione.

Cernunno-XLF: la sua funzione è poco chiara ma mutazioni in questo gene causano immunodeficienza. Sono presenti difetti nella produzione di immunoglobuline. La ricombinazione nei loci delle immunoglobuline si basa su NHEJ.

Biologia Molecolare 13/10/21

RICOMBINAZIONE OMOLOGA: è il meccanismo che genera nuove combinazioni di geni in un genoma e permette lo scambio di gruppi di geni tra cromosomi omologhi. È utilizzato anche per riparare il Dna in modo estremamente fedele. Per avvenire necessitiamo di cellule in replicazione ed una copia di Dna integra. Prevede rottura, invasione del filamento con formazione della giunzione di Holliday, migrazione del chiasma e

risoluzione per taglio o dissoluzione. Con sequenze omologhe, intendiamo sequenze di almeno 100 bp. quasi identiche che presentano piccole variazioni di uno o due nucleotidi sparsi. Al 3’ è presente il filamento che va alla ricerca della sequenza omologa. c’è stata una perdita di materiale genetico, Nel Dna danneggiato, poiché le sequenze dovranno essere ricostruite. Si utilizza come stampo il Dna omologo ed una ligasi richiude il sistema. estremità al 3’ protrudenti: Formazione delle RecBCD è il sistema di riparo in E. Coli. È un complesso di tre proteine, che riconoscono il punto di rottura. RecB si lega al filamento superiore 3’ e al filamento inferiore 5’. RecD Sono elicasi che rompono 3’-i legami H che utilizzano ATP. RecB ha attività eso-endonucleasica 5’ mentre RecD ha attività esonucleasica in direzione 5’-3’. forma un’ansa, Il filamento superiore essendo RecD più