Appunti biologia molecolare

Aminoacidi e proteine

Le proteine sono gli strumenti molecolari attraverso cui si esprimono le informazioni geniche. Tutte le proteine, anche se derivano dalla linea batterica primitiva o da organismi complessi, sono costituite dallo stesso gruppo di 20 amminoacidi. Le cellule possono produrre proteine con proprietà diverse solo legando tra di loro gli stessi 20 amminoacidi, così si ottengono una varietà di prodotti differenti come: enzimi, ormoni, anticorpi.

Gli amminoacidi

Più amminoacidi formano le proteine. Le proteine sono polimeri di amminoacidi in cui ogni residuo amminoacidico è unito a quello vicino da un tipo di legame covalente. Il termine residuo sottolinea la perdita di una molecola di acqua quando un amminoacido si unisce a quello vicino. I 20 amminoacidi presenti nelle proteine sono α-amminoacidi. Hanno un gruppo carbossilico e un gruppo amminico legati allo stesso carbonio α. I 20 amminoacidi differiscono tra di loro per la catena laterale o gruppo R. Tutti gli amminoacidi eccetto la glicina hanno il carbonio α unito a quattro gruppi diversi. L'atomo di carbonio α quindi è detto centro chiralico. I quattro gruppi sostituenti possono disporsi nello spazio in due modi diversi dal momento che la disposizione degli orbitali di legame intorno al carbonio α è tetraedrica. Gli amminoacidi quindi presentano due stereoisomeri. Ma siccome sono immagini speculari non sovrapponibili, le due forme sono una classe di stereoisomeri detti enantiomeri. Inoltre tutte le molecole con un centro chiralico sono otticamente attive, cioè possono ruotare il piano della luce polarizzata.

C'è una nomenclatura ben definita per la configurazione assoluta dei quattro sostituenti degli atomi di carbonio:

• Gli stereoisomeri che hanno configurazione correlata alla L-gliceraldeide sono designati con la lettera L.
• Gli stereoisomeri che hanno configurazione correlata alla D-gliceraldeina sono designati con la lettera D.

Una nomenclatura simile dove sono presenti D e L era stata introdotta per indicare l'attività ottica delle molecole levogire (che ruotano il piano della luce polarizzata verso sinistra) e destrogire (ruotano il piano di luce polarizzata verso destra). Ma nella convenzione di Fischer, L e D indicano soltanto la configurazione assoluta dei quattro sostituenti intorno all'atomo di carbonio e non le proprietà ottiche della molecola. Gli amminoacidi nelle molecole proteiche sono tutti stereoisomeri L.

Classificazione degli amminoacidi

Gruppi R alifatici, non polari

• Gli amminoacidi sono: Glicina, Alanina, Prolina, Valina, Leucina, Isoleucina, Metionina.
• I gruppi R di questa classe di amminoacidi sono non polari e idrofobici.
• I gruppi R di: alanina, valina, leucina, isoleucina tendono a raggrupparsi insieme all'interno della proteina e stabilizzano la struttura proteica con interazioni idrofobiche.
• La glicina è l'amminoacido con la struttura più semplice.
• La metionina è uno dei due amminoacidi contenenti zolfo.
• La prolina ha una catena laterale alifatica con una caratteristica struttura ad anello, il gruppo amminico secondario di questo amminoacido è tenuto in una conformazione rigida che diminuisce la flessibilità strutturale.

Gruppi R aromatici

• Gli amminoacidi sono: Fenilalanina, Tirosina, Triptofano.
• Con le loro catene laterali sono non polari, quindi idrofobici.

Gruppi R polari, non carichi

• Gli amminoacidi sono: Serina, Treonina, Cisteina, Asparagina, Glutammina.
• I gruppi R di questi amminoacidi sono molto più solubili in acqua.
• La polarità della serina e treonina è dovuta al loro gruppo ossidrilico.
• La polarità della cisteina è dovuta al gruppo sulfidrilico.
• Asparagina e glutammina devono la loro polarità ai gruppi amminici.

Gruppi R carichi positivamente (basici)

• Gli amminoacidi sono: Lisina, Arginina, Istidina.

Gruppi R carichi negativamente (acidi)

• Aspartato.
• Glutammato.

Gli amminoacidi possono agire da acidi e da basi. Quando un amminoacido viene sciolto in acqua diventa uno ione dipolare o zwitterone. Le sostanze che hanno questa doppia natura sono anfotere e sono spesso chiamati anfotiti.

Peptidi e proteine

I peptidi sono catene di amminoacidi. Due amminoacidi si possono unire covalentemente mediante un legame ammidico chiamato legame peptidico formando un peptide. Questo tipo di legame si genera per disidratazione, cioè eliminazione di una molecola d'acqua dal gruppo α-carbossilico di un amminoacido e dal gruppo α-amminico dell'altro. La formazione di un legame peptidico è l'esempio di una reazione di condensazione.

Oligopeptide: definizione data alla struttura di amminoacidi uniti insieme da legami peptidici quando il numero degli amminoacidi è relativamente piccolo.

Polipeptide: quando gli amminoacidi sono tanti.

Residuo ammino terminale: è il residuo amminoacidico con cui termina la catena polipeptidica, questo ha il gruppo α-amminico libero (N-terminale).

Residuo carbossiterminale: è il residuo all'estremità opposta che ha un gruppo α-carbossilico libero (C-terminale).

Alcune proteine sono costituite da una singola catena polipeptidica, mentre altre sono chiamate proteine multisubunità e hanno due o più polipeptidi associati non covalentemente.

Oligomerica: quando le catene polipeptidiche presenti in una proteina multisubunità sono identiche e le unità identiche sono dette protomeri.

• Esempio: L'emoglobina possiede quattro subunità polipeptidiche: due catene α identiche e due catene β identiche. All'interno della proteina multimerica, ogni subunità α è appaiata ad una subunità β, quindi l'emoglobina può essere considerata sia un tetramero con quattro subunità polipeptidiche ma anche un dimero di protomeri αβ.

I 20 amminoacidi standard non sono mai presenti in una proteina in quantità uguali. L'idrolisi completa da sola non è sufficiente per un'analisi esauriente della composizione amminoacidica perché durante la procedura avvengono delle reazioni collaterali.

Le proteine si classificano in:

• Proteine semplici: contengono solo amminoacidi e nessun altro gruppo chimico.
• Proteine coniugate: contengono, oltre agli amminoacidi, altri gruppi chimici addizionali permanentemente associati.

Gruppo prosteico: la parte amminoacidica delle proteine coniugate. Queste proteine sono classificate in base alla natura chimica del loro gruppo prosteico:

• Lipoproteine: contengono lipidi.
• Glicoproteine: contengono gruppi saccaridici.

Analisi e separazione delle proteine

Per analizzare in dettaglio una proteina bisogna separarla dagli altri costituenti della cellula e disporre di tecniche per determinare le proprietà:

• Le proteine possono essere separate e purificate.
• La prima tappa del processo di purificazione della proteina è la rottura delle cellule per rilasciare le proteine in una soluzione chiamata estratto grezzo.
• Frazionamento: trattamenti che separano le proteine in frazioni diverse in base a proprietà comuni.
• Dialisi: si separano le proteine da altri soluti sfruttando la maggiore dimensione delle proteine.
• Cromatografia su colonna:
  • Sfrutta le differenze di carica, dimensioni, affinità di legame.
  • Prendiamo un materiale solido e poroso (matrice) posto all'interno di un tubo di vetro; questo materiale solido costituisce la fase stazionaria attraverso cui fluisce la sostanza, la fase mobile.
  • La sostanza effluente che è fornita da un recipiente posto sopra la colonna passa attraverso la matrice fino a raggiungere il fondo.
  • La soluzione proteica forma una banda all'interno della fase mobile.
  • Man mano che le proteine attraversano la colonna, esse sono diversamente ritardate dalle interazioni che si instaurano con la matrice solida.
  • I diversi tipi di proteine si separano gradualmente l'una dall'altra generando delle bande specifiche.
  • La separazione è tanto maggiore quanto più lunga è la colonna; tuttavia le singole bande proteiche tendono ad allargarsi anche per effetto della diffusione, un processo che tende a diminuire la capacità risolutiva della cromatografia.
• Cromatografia a scambio cationico:
  • La matrice solida possiede gruppi carichi negativamente.
  • Nella fase mobile, le proteine con più carica positiva migrano attraverso la matrice più lentamente di quelle che hanno una carica netta negativa.
  • La migrazione delle proteine con carica positiva è ritardata dalle interazioni che si generano con la fase stazionaria.
  • Quindi le proteine con carica negativa e quelle con carica positiva vengono separate in due bande distinte.
• Cromatografia ad esclusione molecolare:
  • Detta anche gel-filtrazione.
  • Separa le proteine in base alle dimensioni.
  • Con questo metodo, le proteine di grandi dimensioni escono dalla colonna prima di quelle di piccole dimensioni.
  • La matrice solida è costituita da granuli con pori o cavità.
  • Le proteine grandi non possono entrare nelle cavità, così percorrono un cammino più corto attraverso la colonna.
  • Le proteine piccole invece, entrano nelle cavità e migrano attraverso la colonna più lentamente.
• Cromatografia per affinità:
  • È basata sull'affinità di legame di una proteina.
  • Il materiale solido contiene gruppi specifici.
  • Le proteine sono trattenute nella colonna soltanto se sono in grado di legarsi ad uno specifico ligando ancorato alla matrice solida; la loro migrazione sarà rallentata.
• Cromatografia liquida ad alta performance (HPCL):
  • Questa tecnica usa pompe ad alta pressione che spingono la fase mobile attraverso la colonna.
• Le proteine possono essere separate o caratterizzate mediante elettroforesi:
  • Questo processo si basa sulla migrazione delle proteine cariche in un campo elettrico.
  • Questa procedura non è di solito usata per purificare una grande quantità di proteine.
  • È un metodo utile quando si vuole allo stesso tempo separare e visualizzare le proteine presenti nella miscela.
  • Un metodo elettroforetico usato per valutare la purezza e la massa molecolare delle proteine comprende l'uso del detergente sodio dodecil solfato (SDS).
  • Questo è un composto che si lega alla maggior parte delle proteine in quantità proporzionali alla massa molecolare della proteina.
  • L'SDS legato conferisce una carica negativa alla proteina.
  • L'elettroforesi in presenza di SDS separa le proteine principalmente in base alla massa molecolare e i polipeptidi migrano più velocemente.
  • Isoelettrofocalizzazione: è la tecnica usata per determinare il punto isoelettrico di una proteina.
  • Elettroforesi bidimensionale: si ha un considerevole incremento della risoluzione che permette di separare anche miscele complesse.
• Le proteine possono essere quantificate:
  • Per poter purificare una proteina è necessario disporre anche di un sistema di dosaggio che identifichi e quantifichi quella proteina.
  • La purificazione può essere monitorata mediante il dosaggio di attività specifica.
  • Per proteine che possiedono attività enzimatiche, la loro concentrazione in un estratto grezzo può essere misurata mediante l'effetto catalitico, cioè valutando l’aumento della velocità di conversione del substrato in prodotto della reazione.
  • Per convenzione internazionale, un’unità di attività enzimatica viene definita come la quantità di enzima necessario per trasformare 1,0 micromoli di substrato al minuto a 25°C.
  • Il termine attività si riferisce alle unità totali di enzima nella soluzione.
  • Attività specifica: il numero di enzima per milligrammo di proteina presente nel campione.

Struttura delle proteine

Le proteine hanno diversi livelli di struttura:

• Struttura primaria: costituita dall'insieme dei leganti covalenti (legami peptidici e legami disolfuro), il principale elemento della struttura primaria è la sequenza dei residui amminoacidici.
• Struttura secondaria: sono disposizioni stabili dei residui amminoacidici che danno origine ad organizzazioni strutturali piuttosto ricorrenti.
• Struttura terziaria: corrisponde al ripiegamento tridimensionale di un polipeptide.
• Struttura quaternaria: quando una proteina ha due o più subunità polipeptidiche.

La struttura tridimensionale di una proteina è determinata dalla sua sequenza amminoacidica. La funzione di una proteina dipende dalla sua stessa struttura. Una proteina presenta un'unica o poche conformazioni stabili. Le forze che stabilizzano una specifica struttura di una data proteina sono interazioni non covalenti. Tra le diverse strutture delle proteine si possono individuare alcuni modelli comuni che consentono di classificare le varie strutture proteiche. L’organizzazione spaziale di una proteina viene detta conformazione: le conformazioni possibili di una proteina comprendono tutti gli strati strutturali che è possibile ottenere senza la rottura di legami covalenti. Le conformazioni possibili nelle specifiche condizioni sono quelle termodinamicamente più stabili. Le proteine che si trovano nella loro conformazione funzionale vengono dette proteine native.

Struttura primaria

Ogni tipo di proteina ha una sequenza amminoacidica specifica che influenza la struttura tridimensionale. La sequenza di una data proteina non è proprio fissa, ma è dotata di una certa flessibilità: circa il 20-30% delle proteine dell’uomo sono polimorfiche, cioè hanno sequenze amminoacidiche variabili nella popolazione. Molte delle variazioni della sequenza amminoacidica non provocano effetti sulla funzione delle proteine. Molte proteine contengono particolari regioni che sono essenziali per la loro funzione e quindi la loro sequenza deve essere conservata. Per questi motivi è di vitale importanza il sequenziamento chimico delle proteine per poter comprendere l’esatta sequenza degli amminoacidi.

Ci sono molti metodi da usare per poter marcare e identificare i residui amminoacidici ammino-terminali:

• Dopo aver marcato il residuo N-terminale, il polipeptide viene idrolizzato e sono identificati gli amminoacidi marcati, ma l’idrolisi distrugge il polipeptide quindi questa tecnica può essere usata soltanto una volta e non può essere usata per identificare i residui che si trovano oltre il residuo N-terminale.
• Per sequenziare un’intera catena polipeptidica viene usato un metodo chimico detto degradazione Edman:
  • Questa è una tecnica che marca e stacca da un peptide soltanto un residuo ammino-terminale, lasciando intatti tutti gli altri legami peptidici.
  • Il peptide viene fatto reagire con il fenilosioticinato.
  • Il residuo ammino-terminale si converte il PTC.
  • Si identifica e si taglia l’ammino terminale.
  • Viene esposto un nuovo ammino terminale che può essere marcato, staccato e identificato ripetendo la stessa serie di reazioni.
  • La degradazione Edman è stata automatizzata in una macchina detta sequenziatore.
  • La lunghezza di polipeptide che può essere sequenziato con il metodo di Edman dipende dall’efficienza delle singole reazioni chimiche.
  • Dipende dall’efficienza del sequenziatore; oggi giorno hanno un’efficienza del 99% per ciclo e permettono di sequenziare anche più di 50 residui contigui di polipeptidi.
• Per essere sequenziate, le proteine grandi devono essere suddivise in segmenti più piccoli; per fare ciò bisogna:
  • Rottura dei ponti di solfuro: perché interferiscono con il procedimento del sequenziamento, oppure con le reazioni chimiche o enzimatiche utilizzate per la rottura della catena polipeptidica.
  • Rottura della catena polipeptidica: si possono ad esempio usare gli enzimi proteasi che catalizzano l’idrolisi dei legami peptidici.
  • Sequenziamento dei peptidi: tutti i frammenti peptidici prodotti vengono sequenziati con la degradazione di Edman.
  • Ordinamento dei frammenti peptidici: un altro campione del polipeptide nativo viene rotto in piccoli frammenti usando un enzima differente che spezza la catena polipeptidica in punti differenti; la sovrapposizione delle sequenze dei peptidi generati dalla seconda procedura di frammentazione con le sequenze generate dalla prima, determina l’ordine corretto.
  • Localizzazione dei ponti di solfuro: se nella struttura primaria vi sono ponti di solfuro, bisogna identificare la loro posizione; in questo caso un campione della proteina viene frammentato senza rompere i ponti di solfuro; i peptidi comuni sono separati per elettroforesi e vengono confrontati con i peptidi generati dalla prima frammentazione dove si erano rotti anche i ponti; il risultato sarà che per ogni ponte di solfuro mancheranno due dei peptidi originari, i quali rappresentano le regioni della catena polipeptidica intatta unita con il ponte di solfuro.
• I piccoli peptidi possono essere sintetizzati con metodi chimici:
  • Purificazione del tessuto: lavoro difficoltoso per le basse concentrazioni di alcuni peptidi.
  • Ingegneria genetica.
  • Sintesi chimica diretta.

Dalla sequenza amminoacidica si possono ricavare importanti informazioni biochimiche:

• Struttura tridimensionale.
• Funzione.
• Localizzazione ecc.

Sequenze proteiche ed evoluzione

Se due organismi sono strettamente correlati tra di loro, le sequenze dei loro geni e delle loro proteine potrebbero essere simili.