Appunti Biologia della cellula animale

Biologia cellula animale

Cellule germinali e somatiche

Nel nostro corpo sono contenuti due tipi di cellule: cellule germinali e cellule somatiche. A loro volta, in quali cellule si distinguono? Il differenziamento significa che la cellula si è riprodotta e si è divisa. Le cellule somatiche si differenziano, sono diverse. Abbiamo cellule terminalmente differenziate (ovvero che non si divideranno più) e cellule staminali. Ciò vale sia per le cellule germinali sia per quelle somatiche. Sono maggiori le cellule differenziate nel nostro corpo rispetto a quelle germinali. Le cellule terminalmente differenziate dovranno essere sostituite da cellule staminali che si dividono e diventano tali.

Da un individuo formato da un'unica cellula, per embriogenesi quest’ultima si dividerà e si differenzieranno tutti i tessuti. Il corpo umano: cellule germinali, cellule somatiche, staminali, terminalmente differenziate.

La teoria cellulare

Nel 1839 Schwaan propose la teoria cellulare. Poco prima c’era stata la rivoluzione francese, siamo in pieno romanticismo, Goethe ha scritto Faust in cui parlava di un "homunculus". In questo periodo si pensava che il nuovo individuo fosse già preformato all’interno dello spermatozoo e che il ventre materno servisse solo per farlo sviluppare. Però si iniziò a delineare anche l’idea che gli esseri viventi fossero formati da una o più cellule e che la cellula sia l’unità strutturale della vita. Dopo si capì che le cellule per continuare a vivere hanno bisogno di dividersi e riprodursi.

(Leggi la motivazione per cui è stato dato il premio Nobel. Quest’anno il premio Nobel per la medicina è stato vinto per gli orologi biologici).

Ciascuno di noi è fatto da centinaia di migliaia di cellule, se le raggruppassimo in tanti gruppetti alla fine abbiamo circa 200 mucchietti, ovvero 200 diversi tipi di cellule.

La cellula si logora per l’uso, vivono per un certo periodo e si sono differenziate, poi muoiono. La morte può essere programmata o accidentale. È dunque necessario sostituire queste cellule attraverso il rinnovo, che consiste nella divisione di cellule staminali che producono delle cellule figlie. Questo fenomeno è continuo, ma è uno dei tanti problemi dell’invecchiamento dell’individuo, ovvero la capacità delle cellule staminali.

Ciascuno di noi è formato da circa 2 kg di cellule morte che stanno per essere eliminate. Tre mesi è il tempo che impieghiamo per sostituire il nostro scheletro.

• 1 000 è la quantità di volte che ricostruiamo gli strati esterni della nostra pelle nel corso della vita.
• 30 giorni è la vita media di una cellula.
• 4 mesi è la vita media di un globulo rosso.
• 10 anni è la vita media delle cellule del fegato.
• 10 000 sono le cellule nervose che nascono ogni giorno nel nostro cervello.
• 25 milioni sono le cellule che nascono ogni secondo nel nostro corpo e vanno a sostituire quelle che muoiono.
• 2 milioni sono i globuli rossi che nascono nel tessuto emopoietico (che principalmente si trova nel midollo osseo).
• 500 milioni sono le cellule della nostra pelle che muoiono ogni giorno.

Perché si originano i tumori?

Per delle alterazioni molto complicate, oppure perché interviene un agente esterno molto distruttivo (raggi ultravioletti) o perché qualcosa ha funzionato male. Ciò nonostante, le divisioni cellulari sono un processo estremamente efficace. Le cellule hanno anche la possibilità di riparare l’errore, dunque non è facile che qualcosa vada storto. Tuttavia, col progredire dell’età è facile incorrere in forme tumorali perché questi meccanismi di correzione diventano sempre più lassi e meno efficienti.

Cellule eucariote e procariote

Tutti gli organismi sul nostro pianeta sono fatti di cellule, ma alcuni sono formati da un’unica cellula, altri sono pluricellulari. L’assenza di un involucro che avvolge il corredo genomico della cellula è determinante nella distinzione tra procarioti ed eucarioti.

I virus sono organismi unicellulari, posseggono una membrana all’interno con proteine di superficie molto importanti per la fusione del virus con la cellula ospite, permettendo il trasferimento all’interno di essa del DNA o RNA del virus. Abbiamo virus che sono batteriofagi e infettano le cellule procariote, i batteri, altri invece quelle eucariote.

Cellula eucariote

La cellula eucariote è avvolta da una membrana plasmatica che separa l’esterno dall’interno della cellula. L’esterno può essere un’altra cellula o un ambiente extracorporeo o interno. Si dice involucro nucleare e non membrana nucleare poiché sono due le membrane. All’interno di esse c’è il genoma della cellula costituito da cromatina. La cromatina è l’associazione tra DNA e proteine a formare il famoso filo di perle. A seconda di come questa associazione è più o meno stretta e compatta, quando osserviamo una cellula vedremo zone di cromatina scure o più chiare. Quelle scure hanno un grado di compattazione elevata, quelle chiare meno.

È molto importante l’associazione tra morfologia e funzione. Nelle zone scure la cromatina è molto compatta e significa silenziamento genico, dove è chiara c’è l’attivazione dei geni. Si parte sempre da una cellula che presenta 20-25 mila geni pronti per accendersi. Parte il differenziamento e si formano cellule con un’iniziale potenzialità uguali, ma che poi si distingueranno. Esse modificano la loro forma per cambiare anche la funzione (il famoso rapporto forma-funzione) per arrivare alle cellule specializzate che danno origine al nuovo organismo.

Lo spermatozoo deriva da una cellula tonda e poi cambia completamente per diventare una cellula differenziata e molto piccola con corredo genomico all’interno della testa e un lungo flagello per percorrere i genitali femminili dove si trova l’ovocita. La cellula uovo è la cellula più grande nei mammiferi, i neuroni hanno lunghi prolungamenti, ma come corpo cellulare è la più grande e ha un diametro di 100 micrometri, inoltre è ricoperta da microvilli (sono specializzazioni di membrana).

Come studiare le cellule

Ci sono tanti e diversi strumenti per studiarle. Lo strumento per eccellenza da cui sono evoluti tutti gli altri è il microscopio, che è stato inventato più o meno nel 1600 e attribuito a Robert Hook, ma lo stesso Galileo lo utilizzò. Siamo dunque nel 1600. Stiamo parlando di microscopio ottico, che ha un potere di ingrandimento e di risoluzione ben limitato. Lo utilizziamo per oggetti più piccoli di mezzo millimetro. Arriviamo a osservare oggetti che sono piccoli fino a 0,5 micrometri. Sotto questa dimensione il microscopio ottico difficilmente è in grado di visualizzare. È possibile tramite esso osservare anche ciò che avviene all’interno delle cellule, in live.

Sotto a questo limite di risoluzione è necessario ricorrere al microscopio elettronico. Con quello ottico vediamo la presenza di una membrana plasmatica, degli organelli come mitocondri, ribosomi, lisosomi, apparato di Golgi, nucleo, nucleolo.

Microscopio ottico

• Tavolino su cui viene posto il vetrino
• Vetrino formato da vetrino porta oggetto (su cui poniamo cellule) e da vetrino coprioggetto

Questo vetrino lo poniamo sul tavolino e lo illuminiamo con una luce che arriva da una sorgente posta sotto. Questa luce passa attraverso un condensatore e viene focalizzata in un unico punto, più piccolo possibile. Poi osserveremo grazie a delle lenti.

• Obiettivo: legato a un revolver che ruota e fa scorrere i diversi obiettivi permettendo di cambiare ogni ingrandimento poiché ognuno moltiplica per un certo numero di volte l’immagine (10x, 20x, 40x, 100x)
• Oculare: è un 10x, 20x, 15x. Quello che si usa di solito è un 10x e fornisce una buona immagine che ci permette di definire bene la morfologia per abbinarla alla funzione.
• Rotella per avvicinare o allontanare gli obiettivi (micrometrica, macrometrica)

Nella microscopia è molto importante la profondità di campo (possibilità di mettere a fuoco contemporaneamente l’immagine davanti e quella dietro) e definisce la qualità del nostro microscopio. L’ingrandimento finale è la moltiplicazione dell’ingrandimento dell’oculare con quello dell’obiettivo.

Tutto ciò che conosciamo deriva dall’istologia classica, che risale ai tempi di Galileo e ancora oggi la eseguiamo in quel modo. È ancora estremamente importante poiché molto utilizzata nell’analisi dei campioni biologici. Il tessuto viene prelevato in diversi modi e, indipendentemente dalla tipologia, prima di arrivare all’analisi delle cellule del tessuto stesso è necessario seguire una serie di passaggi che portano alla preparazione del tessuto.

Isolamento del tessuto e preparazione del vetrino

1. Il tessuto deve inizialmente essere fissato, ovvero bisogna bloccare l’attività enzimatica (tutto quello che avviene all’interno del tessuto) per evitare la degenerazione.
2. Il tessuto, per fare ciò, viene trasferito in alcool (blocca l’attività enzimatica). Si possono utilizzare altre tipologie di fissativo come la gluteraldeide che blocca il tessuto e mantiene le proteine in loco.
3. È importante bloccare l’attività enzimatica, estrarre l’acqua dalla cellula e sostituirla con il liquido alcolico. La prima cosa che faccio è una scala di alcoli che va da una concentrazione del 50% di alcol e acqua fino al 95% di solo alcool e poi fino all’alcool assoluto.
4. Questa procedura è molto laboriosa ma serve per estrarre l’acqua dal campione che deve essere inizialmente sostituita con alcol e poi con paraffina, che mi serve per rendere solido il tessuto per poi poterlo sezionare in tante fette sottilissime. Per mantenere la paraffina liquida ciò viene fatto in una stufa.
5. Dunque ho prelevato del tessuto, ho fatto la fissazione, la scala degli alcoli, poi lo metto in un contenitore contenente paraffina liquida che penetra all’interno della cellula scansando via l’alcol.
6. Dopo un certo periodo prelevo il campione dalla stufa, lo faccio solidificare e grazie al microtomo lo affetto in tante fettine sottili di circa 4-5 micrometri di spessore.
7. Questa fettina di paraffina solida contenente il mio tessuto viene posta sul mio vetrino precedentemente trattato con una sostanza che fa aderire la fettina sul vetrino come una specie di colla.
8. A questo punto il vetrino è pronto per essere sparaffinato (togliere la paraffina) per poi poterlo colorare con del colorante (la paraffina fa da barriera e non lo fa colorare).

Tra l’apparato del Golgi e il nucleo c’è il reticolo endoplasmatico. Il reticolo plasmatico ruvido è vicino al nucleo ed è un’estroflessione del nucleo stesso nel citoplasma. L’apparato del Golgi è importante per le proteine. Tra un organello e l’altro c’è una fitta giungla di “filamenti”, sono dei tiranti proteici che passano attraverso la cellula e hanno tante funzioni tra cui:

• Dare struttura alla cellula.
• Permettere il movimento agli organelli.
• Localizzare nello spazio certe tipologie di organelli. La posizione insieme alla forma è importante per definire la funzione, infatti, e questo vale sia nel citoplasma sia quando entreremo nel nucleo.

C’è dunque un’elevata organizzazione e viene studiata attraverso il microscopio ottico, anche se essendo organismi viventi c’è sempre la possibilità di aggiustamenti. Gli organismi biologici sono caratterizzati dalla loro capacità di adattarsi ai cambiamenti. Se vogliamo studiare le molecole che costituiscono i filamenti e gli organelli dobbiamo invece usare il microscopio elettronico.

Preparazione di un vetrino con delle cellule

Si pone sul vetrino una certa quantità di terreno di coltura (contenente cellule) e la si stende sul vetrino, la si striscia con un vetrino coprioggetto. Le cellule in questo modo si attaccano al vetro e si seccano qua sopra, dopodiché le si può colorare. Se questa procedura dura pochi minuti si riesce a preservare la forma della cellula.

Preparazione di un vetrino con del tessuto

Con i tessuti è più complicato, bisogna usare dei fissativi e un processo di disidratazione che prevede una scala di alcol fino ad arrivare al soluto xilolo per un tempo che dipende dal tipo di tessuto. Dopo la fissazione, la disidratazione si passa all’inclusione: sostituzione xilolo con paraffina. È pronto per essere affettato grazie all’utilizzo di un microtomo. Si mette la fettina in un bagnetto per farla allargare e poi su un vetrino e si aspetta che asciughi l’acqua in modo che la fettina di paraffina contenente il tessuto aderisca al vetro. Può essere ora mantenuto in un’istoteca per un secolo. Se li vogliamo colorare dobbiamo togliere la paraffina: processo di sparaffinizzazione, ovvero si fa la scala degli alcool in senso opposto fino ad arrivare all’acqua. Una volta che sono in acqua il pezzettino rimane attaccato e può essere colorato.

(Vetrino colorato di rosso: ematossilina-eosina, è una miscela di coloranti che rispettivamente colorano sostanze acide (poiché l’ematossilina è un colorante basico), ossia colora DNA nella cellula, ovvero il nucleo; l’eosina invece colora il citoplasma.)

Scoperta degli anticorpi e il loro utilizzo

Negli anni '60 un passo avanti è stata la scoperta di piccole molecole fluorescenti che si legano a proteine oppure al DNA, ai lipidi, ai glucidi. Col tempo i ricercatori sono andati a caccia di queste molecole fluorescenti. Esse sono fluorescenti se vengono eccitate a una particolare lunghezza d’onda. Devo dunque frapporre tra il condensatore e il vetrino dei filtri che mi fanno passare solo certe lunghezze d’onda. In base al diverso fluorocloro che si utilizza per renderli fluorescenti si evidenziano aspetti differenti. Alla fine, con questa tecnica ottengo un’immagine più precisa della localizzazione dei componenti cellulari.

Negli anni ottanta si usava sempre la tecnica della fluorescenza, ma sono stati scoperti anche gli anticorpi (molecole che hanno un’affinità per un’altra molecola che si chiama antigene). Tutte le reazioni che vedono coinvolte due molecole che si associano per affinità, in particolare se sono proteine, sono anticorpo-antigeni. Se siamo interessati a capire dove sta una particolare proteina nella cellula, possiamo ricorrere a queste molecole che colorano, ma erano molto generiche poiché colorano tutti i lipidi, tutte le proteine, ma non quello che voglio, il mio x. Allora utilizzo la nuova scoperta che è quella della relazione tra anticorpo e antigene: l’antigene è x che voglio localizzare.

Utilizzando il microscopio a fluorescenza e coniugando l’anticorpo a un cloro-fluoro ho un anticorpo fluorescente. Questo si legherà solo al suo specifico antigene, ovvero a una proteina con una forma specifica. L’eccesso di anticorpo che non si è legato lo posso lavare via con dell’acqua. A questo punto ho la mia fettina con l’anticorpo legato al suo antigene. Espongo il preparato all’eccitazione e il mio fluorocloro emetterà come una lampadina della fluorescenza, così riesco a capire dove si trova la mia proteina x.

Siccome la posizione è importantissima, se si trova nel luogo giusto la proteina so che la cellula sta svolgendo determinate funzioni, altrimenti sta avendo dei problemi, ovvero è una cellula patologica. Con metodi istologici classici si analizza il preparato e inizia un primo livello di osservazione massiccio. Questa era la scoperta degli anticorpi e il loro utilizzo. Con il microscopio confocale c’è stata una grande innovazione: è stata sostituita la lampada di luce con un laser che si focalizza su un oggetto all’interno della cellula. Qui c’è un punto di intensità fortissimo e si sposta con frazioni di 0,4 micrometri. Una cellula tipo è grande tra i cinque e i 10 micrometri (la cellula uovo=100 micrometri, il globulo rosso 5). Con il raggio laser la affetto virtualmente con delle fettine da 0,4 micrometri. La telecamera fotografa i punti luminosi che si sono illuminati al passaggio del raggio laser; in questo modo si ricostruisce tutta la cellula, o un intero tessuto, attraverso le diverse fettine create virtualmente dal raggio laser. Queste fotografie vengono acquisite e elaborate con un software che ci permette di fare quello che vogliamo.

Il confocale può essere utilizzato per ricostruzione di cellule, tessuti, ma anche di cellule vive. Per questi esperimenti è anche utilizzata la GFP (green fluorescent protein): è una proteina naturale che è stata scoperta in alcune meduse. È stato identificato il gene, isolato e inserito in plasmidi (costrutti per trasferire geni in altri organismi) per trasmetterla ai nuovi organismi che saranno dunque transgenici. Questa GFP si inserisce nel genoma e viene espressa da tutte le cellule (viene inserito come gene costitutivo). Gli organismi saranno transgenici per GFP.

Una successiva evoluzione è stata quella di sostituire un promotore di un gene con quello di un promotore di GFP. Quando questo gene viene espresso naturalmente mi permette di saperlo poiché lo vedo attraverso la fluorescenza.